導讀  
目的：由于有效治療方法有限(特別是口服藥物有限)，肥胖流行及其代謝并發(fā)癥仍然是一個重大的全球公共衛(wèi)生威脅。肽是一類很有前景的分子，因其在醫(yī)學和生物技術(shù)中的應用而受到越來越多的關(guān)注。本研究專注于尋找可以口服治療肥胖的肽，并探索其機制。  
方法：本研究設(shè)計了一種名為D3的9-氨基酸肽，并將其口服給藥于無菌(GF)小鼠和野生型(WT)小鼠、大鼠和獼猴。評估D3對體重和其他基礎(chǔ)代謝參數(shù)的影響。使用16S rRNA擴增子測序評估D3對腸道微生物群的影響。為了確定D3的作用機制，對三種動物模型進行了回腸轉(zhuǎn)錄組分析和分子方法研究。  

結(jié)果：經(jīng)D3處理的WT(12%)和GF(9%)小鼠體重均顯著下降。D3改善了瘦素抵抗并上調(diào)了尿鳥苷(UGN)的表達，UGN通過UGN-GUCY2C內(nèi)分泌軸抑制食欲。在飲食誘導的肥胖大鼠和獼猴模型中也發(fā)現(xiàn)了類似的影響。此外，D3處理后腸道中Akkermansia muciniphila的豐度通過IFNγ-Irgm1軸增加了約100倍，這可能通過下調(diào)Cd36進一步抑制脂肪吸收。

結(jié)論：本研究結(jié)果表明，D3作為一種無毒且具有生物活性的肽，是一種對抗飲食誘導的肥胖的新型候選藥物；靶向UGGNUCY2C內(nèi)分泌軸可能是治療肥胖癥的一種治療策略。 

論文ID 

原名：A novel peptide protects against diet-induced obesity by suppressing appetite and modulating the gut microbiota

譯名：一種新型肽通過抑制食欲和調(diào)節(jié)腸道微生物群來預防飲食引起的肥胖

期刊：Gut

IF：31.793

發(fā)表時間：2022.7

通訊作者：趙方慶＆魏泓

通訊作者單位：中國科學院北京生命科學研究院；陸軍軍醫(yī)大學基礎(chǔ)醫(yī)學院

DOI號：10.1136/gutjnl-2022-328035

實驗設(shè)計

結(jié)果

1 口服D3可對抗肥胖
增加電荷和疏水性可以提高肽的膜通透性。因此，為了增強疏水性，從人十二指腸液中被蛋白酶降解的HD5片段之一HD5(1-9)修飾了四個名為D1-4的肽，HD5(1-9)是防御素HD5-N端的前9個氨基酸。所有這些肽都帶正電荷，其中D3穿透細胞膜的潛力最強(在線補充表1和圖1A)。然后，我們評估了D1-4在哺乳動物細胞中的細胞毒性。在非常高的濃度(29 μM)下，D1-3顯示出對細胞活性的輕微抑制(2.71%-5.42%)，表明其細胞毒性較低(在線補充圖1a)。此外，我們還在體外檢測了D1-4對小鼠紅細胞的潛在毒性作用。如在線補充圖1b所示，D1-4在28 μM時的溶血率分別為1.06%-3.61%，表明其溶血作用較低。因此，這些小肽的安全濃度范圍設(shè)定為0~27 μM。 接下來，我們比較了每日給藥D1-4對HFD喂養(yǎng)小鼠的影響。值得注意的是，在暴露于HFD 8周后，與對照組小鼠相比，HFD喂養(yǎng)的小鼠口服D3(而非其他肽)導致體重增加減少12.06%±2.35%(圖1B-D)。最近的研究表明，肥胖及其伴隨的代謝狀態(tài)越來越多地與腸道微生物群的組成有關(guān)。為了檢驗腸道微生物群是否可能促成這一效應，在限菌(抗生素雞尾酒，ABX)和無菌(GF)小鼠中重復了相同的實驗。同樣，在ABX小鼠(在線補充圖1C)和GF小鼠(圖1D)中分別觀察到體重下降分別為9.65%±4.26%和9.14%±2.93%，這表明D3灌胃減少肥胖可能部分獨立于腸道微生物組。 當給予額外的胰島素和葡萄糖刺激時，D3處理的小鼠表現(xiàn)出與NC組小鼠相似的葡萄糖清除動力學，這表明D3可以降低肥胖引起的胰島素抵抗(圖1E,F)。經(jīng)D3處理后檢測到腹股溝、附睪和腎周脂肪組織重量顯著降低(p<0.05，Wilcoxon檢驗)，這可能與脂肪細胞體積減小有關(guān)(圖1H)。此外，D3治療還能防止肝臟脂肪變性(圖1H)。 基于這些發(fā)現(xiàn)，我們進一步研究了在HFD喂養(yǎng)10周后，在一組新的DIO小鼠(n=5)中口服給藥D3(持續(xù)4周)的影響。在DIO小鼠中觀察到體重顯著下降(p<0.01, Wilcoxon檢驗)(圖1I)，而在同時喂食10周飼料的瘦小鼠(n=5)中，這一趨勢趨于溫和(p<0.05, Wilcoxon t檢驗)(圖1J)。值得注意的是，在第14周交換飲食后也觀察到了類似的效果(圖1I, J)。綜上，這些結(jié)果表明，D3治療可以預防DIO的發(fā)作和惡化，特別是HFD(在線補充圖1e)。

圖1 口服D3可對抗肥胖。(A) HD5(1-9)衍生肽D1-4及其兩親性表面的設(shè)計。藍色、紅色和白色分別代表正電荷、負電荷和中性電荷。使用PyMOL 3.0生成分子模型。(B)實驗大綱。(C-H)將小鼠分為3組(正常飲食(NC)、高脂飲食HFD)和D3)，分別飼喂標準正常飲食或60%脂肪飲食10周；D3組灌胃D3，以生理鹽水作為平行對照(HFD)。(C)第8周SPF小鼠的代表性圖片。D3組的小鼠體重減輕，毛發(fā)梳理更好。(D-F)SPF顯示在頂部，無菌(GF)顯示在底部。(D) 4周齡開始測量的體重增加克數(shù)；SPF小鼠(每組n=10-12)；GF小鼠(每組6-8只)。代表三個獨立實驗。(E, F) SPF小鼠和GF小鼠的胰島素耐量試驗(ITT)(E)和口服葡萄糖耐量試驗(OGTT)(F)。(G)不同器官組織中白色脂肪含量總重。代表三個獨立實驗。(H) HFD組和D3組小鼠肝臟和附睪脂肪H&E染色，放大倍數(shù)20倍。比例尺：100 μm，每組n=10。(I,J)實驗大綱(上)；4周齡開始測量的體重增加克數(shù)，并在第14周更換飼料。對于D-G、I和J，p值由雙尾Wilcoxon檢驗確定，數(shù)據(jù)以平均值±SEM表示；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
2 D3通過抑制食欲來維持能量平衡
考慮到當能量攝入超過能量消耗時就會發(fā)生肥胖，因此我們評估了口服D3是否會影響食物攝入和/或能量代謝。值得注意的是，在無特定病原體(SPF)小鼠和GF小鼠中，隨著時間的推移，D3處理顯著減少了食物攝入量，與對照處理動物相比，24小時食物攝入顯著減少(p<0.05, Wilcoxon檢驗)(在線補充圖1d和圖2A,B)。此外，還進行了間接量熱分析，以確定能量消耗的變化是否有助于觀察到的D3介導的體重減輕。如圖2C所示，兩組之間的能量消耗幾乎沒有差異(p>0.05, Wilcoxon檢驗)，表明D3處理可能影響能量攝入而不是能量消耗。進行配對喂養(yǎng)以探索降低食物超負荷的影響。結(jié)果，在暴露于HFD的8周內(nèi)，口服D3的小鼠與HFD對照小鼠相比，體重增加減少了10.04%±2.19% (p<0.01, Wilcoxon檢驗)(圖2D)。此外，配對喂養(yǎng)組小鼠的體重增加減少了6.02%±2.03%。這些結(jié)果表明，D3的生理作用主要是基于對小鼠食欲的抑制。 為了進一步探索D3的作用機制，我們使用FITC標記的D3 (FITC-D3)可視化其在小鼠中的全身分布?？诜﨔ITC-D3或FITC 3小時后，在FITC-D3處理的小鼠腸道內(nèi)可見強烈的熒光，特別是在遠端小腸，但在FITC組的小鼠中沒有(圖2E)。除了肝臟中略有分布外，在其他器官(心臟、脾、肺和腎)中未觀察到FITC-D3的分布(圖2E和在線補充圖2a)。FITC-D3處理24小時后，包括腸道在內(nèi)的上述任何器官中均未觀察到熒光，表明D3的主要作用靶點是遠端小腸，且其半衰期較短。 一些富含精氨酸和賴氨酸殘基的小肽具有顯著的細胞攝取能力，可以結(jié)合細胞內(nèi)靶點或?qū)㈧o電生物活性物質(zhì)遞送到細胞內(nèi)。為了確定D3是否可以穿透細胞膜，將HCT細胞與10 μM FITC-D3/FITC共培養(yǎng)2 h。共聚焦顯微鏡顯示，F(xiàn)ITC-D3均勻分布在HCT細胞的胞漿中，并顯示出比FITC顯著更高的熒光強度(圖2E和在線補充圖2b)，表明與D3結(jié)合后細胞攝取增強。D3在穿透細胞膜方面的高效率支持其作為細胞內(nèi)調(diào)節(jié)劑的潛力。 隨后，我們通過轉(zhuǎn)錄組分析研究了D3是否可以調(diào)控小鼠遠端小腸中基因的表達?；蚣患治霰砻鳎cHFD對照相比，D3處理小鼠中參與代謝和炎癥反應的幾個KEGG途徑，如調(diào)節(jié)脂肪細胞分化、正調(diào)節(jié)分解代謝過程和負調(diào)節(jié)I-kappaB激酶/NF-kappaB信號通路是最顯著富集的途徑(圖2F)。此外，通過差異表達分析確定了D3小鼠回腸中有121個基因表達上調(diào)(p<0.05，Wald檢驗)。通過實時定量PCR驗證了幾個參與脂解調(diào)控的基因，如Zbtb1624、酰基輔酶A氧化酶2(Acox2)，和炎癥抑制相關(guān)基因Zfp3626，特別是Guca2b基因(校正后p<0.01)(在線補充圖3b-d和圖2G)。在脂肪組織中也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果：D3處理增加了脂肪細胞分化標志物(如Cebpa編碼的CCAAT/增強子結(jié)合蛋白-α)和脂質(zhì)氧化標志物(如Acox2)的mRNA表達，并降低了脂肪生成標志物(如Fasn編碼的脂肪酸合成酶)的表達(在線補充圖3b)。先前的研究發(fā)現(xiàn)，Guca2b可通過UGN-GUCY2C內(nèi)分泌軸調(diào)節(jié)食物攝入，從而起到體重穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)劑的作用。我們通過ELISA進一步驗證了血清中UGN水平的變化。值得注意的是，通過免疫熒光評估，D3處理顯著上調(diào)了SPF小鼠和GF小鼠中UGN的表達(p<0.01，Wilcoxon檢驗)(圖2H-J和在線補充圖3e)。

圖2 D3處理通過上調(diào)回腸中尿鳥苷(UGN)的表達來減少食物攝入。(A, B)每周測量一次食物攝入量。(C) D3處理對急性食物攝入的影響，每隔一天測量一次，持續(xù)1周。A和B分別為(A) (SPF小鼠，n=10-12)，(B)(無菌小鼠，n=6-8)。(C) SPF小鼠20小時的能量消耗(每組n=6)。(D)從4周齡開始，配對喂養(yǎng)的小鼠隨時間的體重增加克數(shù)(每組6只小鼠)。(E)通過共聚焦顯微鏡觀察FITC標記的D3的定位。細胞核用DAPI染色(藍色)?？诜o藥3小時后取SPF小鼠的Swiss rolls(上圖，比例尺：500 μm)和腸道橫截面(下圖，比例尺200 μm)。最后一列顯示FITC-D3在與HCT細胞共培養(yǎng)1小時后的定位。FITC呈現(xiàn)的洋紅色是一種偽色，后來被替換以區(qū)別于UGN的免疫熒光染色。圖像代表具有相似結(jié)果的三個獨立實驗。(F)回腸基因的RNA測序和KEGG通路。(G)火山圖顯示D3處理組與HFD對照組的相對基因表達。繪制了所有基因，每個圓圈代表一個基因。圓的直徑表示FPKM的值，p<0.05(綠色)和p<0.01(紅色)。x軸顯示log2倍數(shù)變化，y軸顯示p值的-log10。(H)灌胃D3或磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS)的小鼠回腸中Guca2b mRNA的相對水平。(I)采用ELISA法測定小鼠血清中UGN(Guca2b蛋白)的濃度(ng/mL)。(J)回腸切片雙重免疫熒光染色檢測UGN(綠色點位于腸上皮細胞底部)和細胞核(藍色)。漫反射綠色薄層是背景噪聲。比例尺:10 μm。對于A、B、H和I，p值通過雙尾Wilcoxon檢驗確定，數(shù)據(jù)以平均值±SEM表示；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
3 完整的瘦素信號有助于D3的抗肥胖作用
我們試圖確定D3處理是否可以預防遺傳肥胖(ob/ob)小鼠的肥胖。如圖3A所示，口服給藥6周后，D3組ob/ob小鼠體重增加與HFD組無明顯差異。為了驗證D3的抗肥胖作用與瘦素相關(guān)，我們接下來回顧性檢查了在之前實驗中處理的SPF小鼠中瘦素表達的變化。事實上，與之前的報道一致，喂食HFD顯著上調(diào)了SPF和GF小鼠中瘦素的表達，這可以通過口服D3來恢復(p<0.05, Wilcoxon檢驗)(圖3B)。為了進一步證明D3可以改善瘦素抵抗，我們首先通過急性方法研究了體重對瘦素給藥的反應，其中WT小鼠腹腔注射瘦素3天，然后測定它們的體重變化。如圖3C、A所示，經(jīng)外源性瘦素處理后，D3組小鼠體重明顯下降(p<0.05, Wilcoxon檢驗)，但HFD組小鼠體重沒有明顯下降。其次，我們檢測了瘦素刺激的細胞因子，包括信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)和磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)通路。我們發(fā)現(xiàn)，在瘦素信號傳導的負調(diào)控因子中，HFD和D3組之間PTB1B的mRNA表達水平?jīng)]有顯著差異(在線補充圖4b)，但在D3處理的小鼠中，SOCS-3顯著下調(diào)。在體內(nèi)，SOCS-3過表達抑制瘦素誘導的pSTAT3，從而導致瘦素抵抗。相反，PI3K的表達水平顯著上調(diào)，其表達水平與總表達水平呈正相關(guān)，可以反映瘦素敏感性，這可能代表對瘦素的反應增強(在線補充圖4b)。綜上，這些結(jié)果表明，D3處理可以恢復DIO小鼠中瘦素誘導的信號通路和瘦素敏感性。 本研究觀察到，瘦素處理導致ob/ob小鼠體重明顯下降，而瘦素+D3引起的體重下降比單獨D3更顯著(圖3D)，這意味著補充外源性瘦素可以恢復D3在ob/ob小鼠中的功能。然后，我們定量并比較了ob/ob小鼠和WT小鼠回腸中Guca2b的表達水平。與未處理的ob/ob小鼠(OB-NC)相比，D3處理ob/ob小鼠(OB-D3)中Guca2b的表達增加了2.22倍，而SPF-D3組的WT小鼠則增加了3.67倍(圖3E)。此外，僅用瘦素(OB-Lep)處理的ob/ob小鼠(ob/ob小鼠)增加了2.12倍，低于用瘦素+D3處理的小鼠(OB-Lep+D3，增加了3.46倍)(圖3E)，表明瘦素和D3對調(diào)節(jié)UGN表達的協(xié)同作用。通過免疫熒光進一步觀察和驗證D3、瘦素和D3+瘦素處理的ob/ob小鼠回腸中UGN的表達(圖3F)。綜上，這些發(fā)現(xiàn)表明瘦素可能在介導D3的厭食和抗肥胖作用中發(fā)揮重要作用。 下丘腦中與食欲相關(guān)的一些神經(jīng)元在禁食時被激活，伴隨著這些神經(jīng)元中c-Fos表達的顯著誘導。為了觀察D3處理對小鼠食欲的影響，在上午10:00給8周齡SPF小鼠灌胃D3或?qū)φ瘴?生理鹽水)。隨后每1小時進行一次Transcardial及c-Fos染色，持續(xù)3小時。D3給藥后1小時c-Fos表達明顯升高，隨后逐漸恢復正常水平(在線補充圖4c)，后續(xù)免疫熒光染色證實(圖3H,J)。我們進一步測量了在此過程中AgRP和POMC的表達，以確定與觀察到的效應有關(guān)的下丘腦神經(jīng)元群。D3給藥后2小時和3小時POMC的表達明顯改善(p<0.05, Wilcoxon檢驗)，但AgRP無明顯變化(p＞0.05, Wilcoxon檢驗)(圖3G,K)。此外，在弓狀核中觀察到c-Fos和POMC表達神經(jīng)元的共定位(圖3H,I)。上述結(jié)果表明，D3給藥可能間接影響弓形核中的POMC神經(jīng)元，其發(fā)出飽腹信號并減少食物攝入，從而達到抑制食欲的效果。

圖3 D3增加小鼠瘦素敏感性和ARC c-Fos表達。(A)隨時間推移測量的體重增加百分比(ob/ob小鼠，每組n=8)。(B)用D3或生理鹽水(對照)灌胃飼喂高脂飲食(HFD)或正常飲食(NC)的特定無病原體/無菌(SPF/GF)小鼠后附睪脂肪的瘦素mRNA表達水平(SPF小鼠，n=10-12；GF小鼠，n=6-8)。(C)外源性瘦素或生理鹽水處理后的體重變化(野生型(WT)小鼠，n=7-8)。相同顏色的Lute圖代表兩組接受相同處理的小鼠。(D)正常飲食的ob/ob小鼠經(jīng)不同處理后體重增加百分比(NC，n=3；D3、瘦素和D3+瘦素，n=4)。(E) ob/ob或WT小鼠中的Guca2b mRNA表達水平(ob/ob小鼠，每組n=3-4;WT小鼠；每組n=8-10)。(F)回腸切片雙重免疫熒光顯示尿鳥苷(UGN)(位于腸上皮細胞底部的綠點)和細胞核(藍色)。比例尺：10 μm。(G) WT小鼠中AgRp和POMC mRNA表達水平(每組n=3)。(H) SPF小鼠中ARC c-FOS(紅色)和POMC(綠色)的代表性圖像。比例尺:100μm；3v，第三腦室。(I) c-Fos陽性細胞與POMC神經(jīng)元共定位。(J)小鼠ARC中c-Fos陽性細胞/玻片數(shù)量。(K) ARC切片雙重免疫熒光染色顯示POMC(綠色)和細胞核(藍色)。比例尺:100μm；3v，第三腦室。對A-E、H和J，p值通過雙尾Wilcoxon檢驗確定，數(shù)據(jù)以平均值±SEM表示；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
4 D3處理增加了腸道菌群中A. muciniphila 的豐度
腸道微生物群是代謝功能的重要貢獻者，并與人類疾病的發(fā)展有關(guān)，例如嬰兒自閉癥和肥胖癥。我們接下來研究了D3對肥胖的保護是否與腸道微生物群的改變相關(guān)。D3處理小鼠和對照處理小鼠之間的糞便微生物群組成存在明顯差異(圖4A、B和在線補充圖5a-c)。線性判別分析顯示，Oscillospira、Lawsonia和Desulfovibrio在對照處理小鼠中顯著富集，而Bacteroides、Bilophila和Akkermansia在D3處理小鼠中顯著富集(圖4C)。 糞便微生物群移植(FMT)是指將健康供體的腸道微生物群落轉(zhuǎn)移到患者體內(nèi)，已成為治療一系列慢性疾病的一種有前景的治療選擇。慮到腸道微生物群的組成變化可能在D3治療過程中發(fā)揮作用，我們采用FMT來確定腸道菌群是否有助于拯救肥胖。收集用D3處理10周小鼠的糞便微生物群，并口服給藥DIO小鼠。4周后，與HFD對照組小鼠相比，F(xiàn)MT使受體小鼠的體重減輕6.50%±2.91%，而熱滅活的糞便樣本則無任何影響(圖4D,E)。我們想知道是否有某種特定的糞便細菌發(fā)揮了這種保護作用。因此，我們在D3處理的DIO小鼠中使用了兩個顯著富集的分類群(B. vulgatus和A. muciniphila)，持續(xù)4周。和A. muciniphila的定殖導致體重顯著下降(p<0.05，Wilcoxon檢驗)，而B. vulgatus的定殖沒有這種影響(p>0.05, Wilcoxon檢驗)(圖4F)。這一發(fā)現(xiàn)表明，轉(zhuǎn)移到受體小鼠的腸道微生物群的個體成員(如A. muciniphila)可能會延緩DIO小鼠的肥胖發(fā)展，這與之前的研究一致。然后我們回到SPF小鼠的初始實驗，發(fā)現(xiàn)D3處理小鼠糞便中A. muciniphila的豐度大約是HFD小鼠的100倍(圖4G)。 最近，A. muciniphila被鑒定為一種存在于粘液層中的粘蛋白降解細菌，其在粘液蛋白降解中的特化作用使其成為管腔和宿主細胞之間粘膜界面的關(guān)鍵角色。通過對結(jié)腸上皮粘液進行染色，我們發(fā)現(xiàn)HFD喂養(yǎng)的小鼠(SPF)中粘液層厚度明顯降低。D3和A. muciniphila處理都抵消了這種下降(p<0.05, Wilcoxon檢驗)。有趣的是，當使用D3處理GF小鼠時，這種效果消失了(圖4H,I)。因此，我們推測粘液層增厚是由于A. muciniphila的定殖，而不是D3的直接作用。 為了進一步探索D3處理導致A. muciniphila豐度增加的機制，我們首先在體外測量了暴露于不同濃度D3時A. muciniphila的生長曲線。如圖4J所示，不同D3濃度下無明顯變化，說明D3在體外并不能促進A. muciniphila的生長。先前的研究發(fā)現(xiàn)，在IFNγ缺陷小鼠中A. muciniphila顯著增加，并且IFNγ水平的恢復可以降低A. muciniphila的豐度。IFNγ可以通過Irgm1誘導Paneth細胞分泌抗菌蛋白，Irgm1是其信號級聯(lián)的下游分子。先前的研究表明，當IFN或Irgm1水平降低時，抑菌肽的產(chǎn)生受損會導致A. muciniphila的過度生長。在本研究中，我們觀察到，相對于HFD組，D3處理顯著抑制了小鼠回腸中IFNγ和Irgm1的表達(圖4K,L)。因此，我們推測D3處理增加了A. muciniphila豐度可能是由于IFNγ-Irgm1軸的負調(diào)控。 為了研究A. muciniphila是否有助于改善肥胖表型，我們將A. muciniphila移植到DIO小鼠體內(nèi)8周。值得注意的是，每2天用1×109 CFU A. muciniphila灌胃小鼠，導致小鼠體重顯著降低(p<0.01, Wilcoxon檢驗)，與D3處理相似(圖4M)。我們進一步比較了A. muciniphila和D3對DIO小鼠脂質(zhì)代謝的影響。我們觀察到，在SPF小鼠(而非GF小鼠)給藥D3或A. muciniphila后，調(diào)節(jié)脂質(zhì)合成和吸收的Fasn和CD36 mRNA表達增加，促進附睪脂肪中脂質(zhì)氧化的Adipoq mRNA水平降低(在線補充圖5f)，這表明增加的A. muciniphila有額外的積極作用。有趣的是，僅在D3處理的SPF小鼠中觀察到Acox2的顯著上調(diào)，它可以增加脂肪酸氧化并進一步抑制肝臟中的脂質(zhì)積累(圖4N和在線補充圖5f)。以上結(jié)果表明，脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)應該是D3和A. muciniphila二者共同作用的結(jié)果。 最近的研究表明，A. muciniphila可以修復由高脂(HF)飲食引起的腸粘液變薄。因此，我們進一步研究了D3或A. muciniphila給藥對結(jié)腸粘液的影響。我們發(fā)現(xiàn)，在SPF小鼠中給藥D3或A. muciniphila后MUC2和IL4的表達水平顯著增加(p<0.05，Wilcoxon檢驗)，但在杯狀細胞發(fā)育的其他標志物中沒有增加，如Klf4(p >0.05，Wilcoxon檢驗)(在線補充圖5d-e)。然而，D3處理的GF小鼠并沒有出現(xiàn)相同的結(jié)果，這表明粘液層增厚可能歸因于A. muciniphila豐度的增加，而不是D3的直接作用。

圖4 D3改變了小鼠的腸道微生物群。(A)在屬水平上高脂飲食(HFD)處理和D3處理小鼠的糞便微生物群組成。(B) HFD和D3小鼠糞便微生物群的主成分分析(PCoA)。Adonis檢驗兩個分離簇的顯著性。(C) LEfSe分析顯示HFD和D3之間的顯著差異豐度細菌類群。在D3處理的小鼠中，類群顯著富集和減少分別顯示為紅色和黑色。(D)糞便微生物群移植(FMT)的實驗流程。首先給小鼠喂食HFD 10周，以實現(xiàn)飲食肥胖。在接下來的4周內(nèi)，使用D3處理的小鼠作為供體。收集它們的糞便，然后分為滅活組和活性組，最終通過FMT轉(zhuǎn)移到受體小鼠。此外，A. m和B. v組小鼠灌胃1×109 CFU Akkermansia muciniphila或Bacteroides vulgatus。供體和受體，每組n=6；A. m和B. v組，每組n=5。(E-F)從第14周開始，隨時間測量的體重增加百分比(E，F(xiàn)MT；F，外源細菌定殖)。(G)定量PCR測定小鼠糞便樣本中A. muciniphila的相對豐度，見圖1D。(H-I)高碘酸Schiff(PAS)和阿爾新藍(AB)染色(H)以及來自SPF小鼠和無菌(GF)小鼠以及外源性細菌定殖小鼠的結(jié)腸切片的粘液層厚度(I)(圖1D)。白色虛線代表粘液層的邊界。(J)在體外暴露于不同濃度D3的A. muciniphila的生長曲線。代表三個獨立實驗。(K-I)圖1D中SPF小鼠回腸中IFNγ(K)和Irgm1(L) mRNA表達水平，隨時間測量的體重增加百分比(每組n=6只小鼠)。(N)飼喂對照飲食(NC和HFD)或D3處理或灌胃A. muciniphila的SPF小鼠(每組n=6)的CD36、Fasn和Acox2(肝臟)和Adipoq(附睪)mRNA表達水平。對于E-G、I和K-N，p值通過雙尾Wilcoxon檢驗確定，數(shù)據(jù)以平均值±SEM表示；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
5 D3在其他動物模型中的抗肥胖作用
為了研究D3在其他動物中的抗肥胖作用，我們進一步用D3處理了另外兩種DIO模型，大鼠和獼猴(圖5A,H)。值得注意的是，在HFD暴露的10周內(nèi)，與未處理對照相比，D3處理導致大鼠體重增加減少了8.96%±3.11% (p<0.05, Wilcoxon檢驗)(圖5B,C,I)。正如預期的那樣，我們觀察到與HFD對照大鼠相比，D3處理顯著抑制了DIO大鼠的攝食量(p<0.05, Wilcoxon檢驗)(圖5D)?；啬c中Guca2b的表達顯著升高(p<0.05, Wilcoxon檢驗)，附睪脂肪中瘦素的表達顯著降低(p<0.05, Wilcoxon檢驗)(圖5E,F)。同樣，A. muciniphila的豐度增加(p<0.05, Wilcoxon檢驗)(圖5G)。對于DIO獼猴，第6周D3組的平均增重增幅比對照組低7.71%±2.97%(圖5j)。(圖5)。此外，我們觀察到，D3組獼猴的攝食量顯著降低(p<0.05, Wilcoxon檢驗)(圖5J)，A. muciniphila的豐度增加(p<0.05, Wilcoxon檢驗)(圖5K)。

圖5 D3保護大鼠和獼猴免于飲食肥胖。(A)大鼠實驗工作流程(每組n= 8-10)。(B)隨時間測量的大鼠體重增加克數(shù)。(C)隨時間測量的大鼠體重增加百分比。括號表示高脂飲食(HFD)和D3之間的比較。(D)每隔一天測量一次大鼠的食物攝入量，持續(xù)1周。(E)大鼠回腸中Guca2b mRNA表達水平。(F)大鼠附睪脂肪的瘦素mRNA表達水平。(G)大鼠糞便樣本中Akkermansia muciniphila的相對豐度。(H)喂食標準飲食(正常食物，NC)或HFD 6周(每組n=3)的獼猴的實驗工作流程。(I)隨時間測量的獼猴體重增加百分比。括號表示HFD和D3之間的比較。(J)每隔一天測量一次獼猴的食物攝入量，持續(xù)1周。(K)獼猴糞便樣本中A. muciniphila的相對豐度。(L) D3在治療肥胖中的作用總結(jié)。D3作為瘦素增敏劑，可以上調(diào)回腸中尿鳥苷(UGN)的表達，并通過靶向下丘腦抑制食欲。D3還可以增加腸道中A. muciniphila的豐度，進而影響肝臟的脂質(zhì)吸收和代謝。對于B-G和I-K，p值通過雙尾Wilcoxon檢驗確定，數(shù)據(jù)以平均值±SEM表示；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

討論

盡管多年來肥胖管理已有了顯著改善，但仍缺乏針對其潛在過程的療法。人們對支持減肥的藥物療法越來越感興趣。目前，人體中的一些內(nèi)源性肽已被用于治療2型糖尿病和肥胖，如K-酪蛋白衍生的糖原肽和酪蛋白。此外，一些腸道肽(如α-防御素5)被用于逆轉(zhuǎn)血脂異常并提高DIO小鼠的血糖調(diào)節(jié)能力。
我們發(fā)現(xiàn)，口服D3可使DIO小鼠的體重增加減少12.06%±2.35%，并改善腸道菌群失調(diào)。我們進一步證明，D3可以上調(diào)UGN和瘦素抵抗的表達，這兩者都可以抑制小鼠的食欲。我們的研究提供了一個新的觀點和證據(jù)，表明來自蛋白質(zhì)前體降解片段的內(nèi)源性多肽可能在調(diào)節(jié)肥胖和其他代謝性疾病中發(fā)揮重要作用(圖5l)。 迄今為止，五種藥物(奧利司他、芬特明和托吡酯、納曲酮＋安非他酮、利拉魯肽和索馬魯肽)均具有厭食作用，已被美國食品和藥物管理局(FDA)批準用于成人的長期體重管理。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)D3處理后，SPF小鼠和GF小鼠的食物攝入量均顯著降低，同時小腸中UGN的表達增加。UGN是一種由小腸腸嗜鉻細胞分泌的16個氨基酸的厭食激素，已被證明可靶向下丘腦的GUCY2C受體，并通過血液循環(huán)激活厭食癥產(chǎn)生的途徑。靜脈注射尿鳥苷前體激素可引起小鼠飽腹感。Kim等人還發(fā)現(xiàn)，受腦特異性啟動子控制的轉(zhuǎn)基因UGN可產(chǎn)生生理水平以誘導持久的厭食反應，對抗體重增加至少24周而不改變DIO小鼠的代謝率。 我們發(fā)現(xiàn)，D3治療可以通過上調(diào)UGN的表達和提高血清中UGN的含量來抵抗飲食誘導的小鼠肥胖的發(fā)生和惡化。這種UGN(腸道)-GUCY2C(下丘腦)內(nèi)分泌軸有可能成為食欲控制和代謝綜合征的新治療靶點。
此外，我們發(fā)現(xiàn)D3恢復了由HF飲食引起的代償性瘦素升高并增加了瘦素敏感性。瘦素可以通過抑制ARC中神經(jīng)元的活動來降低食欲，ARC是下丘腦食欲調(diào)節(jié)的中心。當ARC中神經(jīng)元被饑餓激活時，會發(fā)生c-Fos表達的顯著誘導，這可以通過食欲抑制劑(如雌二醇和瘦素)或進食來逆轉(zhuǎn)。值得注意的是，D3給藥后小鼠c-Fos表達上調(diào)并與表達POMC的神經(jīng)元共定位，可能是由于D3促進UGN表達和其作為瘦素敏化劑的綜合作用。 目前，越來越多的證據(jù)表明腸道菌群在各種代謝疾病中的作用，對腸道菌群的操縱可能是一種新的治療選擇。
在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)D3處理可以降低Desulfovibrio 和Ruminococcus 的豐度。向GF小鼠施用Desulfovibrio后，小鼠體脂百分比和CD36表達增加，CD36是哺乳動物體內(nèi)脂質(zhì)吸收和穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。此外，我們在D3處理的小鼠中觀察到較高豐度的擬桿菌(Bacteroides)。許多觀察性和干預性研究已將瘦身或體重減輕與擬桿菌(Bacteroidetes)水平升高相關(guān)聯(lián)，擬桿菌可產(chǎn)生短鏈脂肪酸。但這種關(guān)系是有爭議的，因為觀察性研究還發(fā)現(xiàn)擬桿菌的豐度增加與西方飲食有關(guān)，而西方飲食與肥胖有關(guān)。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)用B. vulgatus進行4周的定殖并未導致DIO小鼠體重的顯著變化。相比之下，在肥胖小鼠體內(nèi)移植A. muciniphila 可逆轉(zhuǎn)肥胖表型，這與之前的研究一致。值得注意的是，D3處理的GF小鼠(9.14%±2.93%)和SPF小鼠(12.06%±2.35%)體重減輕百分比之間的差異進一步證明了腸道菌群在治療肥胖中的作用。事實上，許多被發(fā)現(xiàn)可以減輕體重的藥物和化學物質(zhì)都會影響腸道微生物群。例如，利拉魯肽改變了整體組成以及與體重相關(guān)的系統(tǒng)發(fā)育型的相對豐度，例如處理過的DIO小鼠中Proteobacteria 的減少和A. muciniphila 的增加。有趣的是，D3處理使A. muciniphila 的豐度增加了100倍，這種效果比前兩種藥物(3~5倍)強很多。 許多多肽已被用作調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)以預防肥胖的信號分子，包括利拉魯肽和索馬魯肽、胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)激動劑和腎上腺髓質(zhì)素2。然而，有幾個原因可以解釋注射GLP-1R激動劑的緩慢采用，包括該患者群體對注射療法的依從性差，以及與注射療法相比，患者一般更喜歡口服藥物。值得注意的是，在本研究中，口服D3顯著降低了小鼠的體重，表明D3有可能成為治療肥胖癥的一種有效的首選治療方案。由于安全問題，肥胖藥物的使用一直受到限制。目前FDA批準用于臨床治療肥胖癥的藥物中，似乎大部分都有副作用。例如，GLP-1類似物已被證明會引起副作用，包括短暫性惡心、GLP-1RA相關(guān)或胰島素胃腸道副作用急性胰腺炎、嘔吐和食欲不振，從而限制了劑量。值得注意的是，在我們對小鼠、大鼠或獼猴的研究中，沒有觀察到D3的明顯副作用?？紤]到本研究實驗只進行了10-12周，還需要更長的實驗周期來驗證結(jié)果。
綜上所述，我們在此報告了一種小肽D3(不是GLP-1類似物)，可以通過抑制食欲和調(diào)節(jié)腸道微生物群來抑制肥胖的發(fā)展。本研究增加了新的證據(jù)，表明UGN-GUCY2G軸是抗肥胖藥物開發(fā)的一個潛在治療靶點，并支持D3是對抗飲食誘導的肥胖的競爭性候選藥物，具有良好的安全性。該肽在人體中的潛在多效性作用仍需在未來的研究中加以探討。 

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