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重金屬宮內(nèi)暴露對胎兒DNMT3B基因甲基化的影響

來源：泰然健康網(wǎng) 時間：2024年11月23日 23:41

【摘要】目的分析胎兒宮內(nèi)暴露重金屬與臍帶血中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3B(DNMT3B)基因甲基化的關(guān)系。方法本研究基于在山西開展的病例對照研究，共納入173例無重大體表出生缺陷胎兒。采用電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)儀檢測臍帶組織中砷(As)、鉛(Pb)、鎘(Cd)、鎳(Ni)四種重金屬的含量，采用MassARRAY時間飛行質(zhì)譜陣列基因分析平臺檢測臍帶血中DNMT3B的甲基化水平。運用多重線性回歸模型分析重金屬暴露對DNMT3B甲基化的影響。結(jié)果臍帶組織中砷、鉛、鎘、鎳含量中位值及四分位間距分別為7.66 (5.24-10.30) ng/g、23.91 (16.74-44.29) ng/g、0.95 (0.47-2.71) ng/g、21.42 (15.61-32.2) ng/g。臍帶血中DNMT3B基因甲基化水平為(7.38±2.66)%。臍帶組織鎘對DNMT3B甲基化水平有影響(β=0.74, P=0.03)，鎘與砷、鉛、鎳對DNMT3B甲基化水平的影響均無交互作用。結(jié)論臍帶組織重金屬暴露會影響胎兒DNMT3B的甲基化水平。

近年來，由于工業(yè)化和城市化的快速發(fā)展，大量的重金屬進入水體及其他環(huán)境系統(tǒng)中，長期存在于環(huán)境中，并通過食物、污水和空氣等進入人體且不斷蓄積，直接危害人體健康[1]。砷(As)、鉛(Pb)、鎘(Cd)、鎳(Ni)是已知的有毒重金屬，具有一定的生殖毒性，且能通過胎盤屏障[2, 3]。動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，砷、鉛、鎘、鎳暴露會影響胚胎的正常發(fā)育及后代的生長[4, 5]。然而，其致畸作用的機制尚不清楚。

目前，越來越多的研究聚焦于環(huán)境暴露引起的表觀遺傳學(xué)改變[6]。表觀遺傳學(xué)是指在不改變DNA序列的前提下，基因表達發(fā)生的可遺傳的變化，被認為是環(huán)境暴露和疾病發(fā)生發(fā)展之間的機制橋梁[7, 8]。其中，DNA甲基化是研究最廣泛的機制之一，是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA Methyltransferase, DNMT)的催化下，將S-腺苷甲硫氨酸提供的甲基添加到DNA分子上[9]。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，母親砷、鉛、鎘、鎳暴露會引起胎兒臍帶血中整體[10]及特異基因甲基化水平的改變，包括砷甲基轉(zhuǎn)移酶基因(As3MT)[11]、印跡基因(H19、HSD11B2、PEG10、MEG3)[12, 13]、DNMT3B基因[14]等。但大部分研究采集母親外周血、尿、指甲等生物標(biāo)本進行重金屬暴露測量，鮮有研究使用臍帶組織測量重金屬含量。臍帶作為胎兒身體的一部分，測量其污染物濃度，能更好地評估胎兒體內(nèi)污染物的真實暴露水平。為探討一般人群中重金屬含量與DNA甲基化水平的關(guān)系，本研究納入173例無重大體表出生缺陷胎兒，測量其臍帶組織砷、鉛、鎘、鎳金屬含量，及臍帶血中DNMT3B基因甲基化水平，探索胎兒重金屬內(nèi)暴露對DNA甲基化水平的影響，為重金屬的致畸作用機制研究提供依據(jù)。

對象及方法

一、研究對象

本研究為橫斷面研究。研究對象來自北京大學(xué)生育健康研究所于2003年1月至2016年12月在山西省太谷縣、平定縣、昔陽縣、壽陽縣、澤州縣、太原市和長治市開展的病例對照研究。研究對象納入標(biāo)準為：(1)無重大體表出生缺陷的正常胎兒或新生兒；(2)母親為山西省常住居民(在本地居住2年以上)，且本次妊娠期間在本地居??；(3)同意參加研究并簽署書面知情同意書。本研究通過北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)倫理委員會審批。

二、方法

1. 問卷調(diào)查及標(biāo)本采集：對調(diào)查員進行統(tǒng)一規(guī)范的培訓(xùn)，在終止妊娠或分娩前后，采用結(jié)構(gòu)式問卷對研究對象的母親進行面對面調(diào)查。調(diào)查內(nèi)容包括母親基本人口學(xué)特征、生活方式、孕期飲食情況、環(huán)境污染物暴露情況等。胎兒娩出時，現(xiàn)場采集5～10 cm臍帶組織、臍帶血等標(biāo)本，并用干冰轉(zhuǎn)運至實驗室。臍帶組織保存在-20℃冰箱，臍帶血以紙血片或血細胞方式分別保存于-20℃、-80℃冰箱。

2. 臍帶組織重金屬含量檢測：分離2g左右的濕重臍帶，用鈦合金剪刀將臍帶血管剪開，超純水清洗后放入真空冷凍干燥機，凍干至約0.2g。在高壓微波消解儀(Ultra WAVE, Milestone, Italy)中用3 mL硝酸溶液和0.5 mL雙氧水消化凍干臍帶。處理1h后，從石英消解管中取1ml樣本加入到EP管中，超純水稀釋至2ml。使用電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)檢測并得到結(jié)果。每批次檢測同時制備2份豬肝標(biāo)準品(GBW 10051)，對每20個臍帶樣品進行質(zhì)控。砷、鉛、鎘、鎳的檢出限分別0.011 ng/mL、0.002 ng/mL、0.001 ng/mL、0.016 ng/mL。所有樣本的重金屬含量均高于檢出限。

3. 臍帶血DNA提?。河肈NA提取試劑盒(QIAamp DNA Mini Kit)，按照試劑盒說明書提取臍帶血中的DNA，使用NanoDrop分光光度計對DNA樣本的濃度及純度進行測定，并置于-80°C冰箱保存。

4. 臍帶血DNMT3B基因甲基化水平檢測：選取DNMT3B基因甲基化島區(qū)域為目標(biāo)區(qū)域，使用EpiDesigner網(wǎng)站(http://www.epidesigner.com/)，在線設(shè)計PCR引物，PCR引物共覆蓋24個CpG位點，剔除3個位點不可分析，共21個可分析位點。正向引物為5′-aggaagagag-GGGTTTTTAGGGGTTTTTTTTG-3′，反向引物為5′-agtaatacgactcactatagggagaaggct-CCCCTCCCACAAAATATATACAATA-3′。取500ng DNA樣本使用試劑盒(EZ DNA Methylation kit，Zymo公司)進行重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)換。處理后的DNA使用Sequenom MassARRAY時間飛行質(zhì)譜陣列基因分析平臺進行定量分析。先配置5μL體系進行PCR擴增，反應(yīng)條件為：95℃ 4min; 95℃ 20s，58℃ 30s，72℃ 1min(45個循環(huán))；72℃ 3min。之后使用蝦堿性磷酸酶(SAP)純化PCR產(chǎn)物，條件為37℃ 20min，85℃ 5min。使用T切割轉(zhuǎn)錄酶進行堿基特異性酶切反應(yīng)(MassCLEAVE),條件為37℃ 3h。最終產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至384孔板，加入清潔樹脂進行脫鹽處理并上機檢測。用EpiTYPER軟件進行峰值檢測及甲基化水平定量計算。甲基化數(shù)值用百分數(shù)表示，DNMT3B的甲基化水平為21個位點的平均值。實驗中設(shè)置陽性對照和陰性對照進行質(zhì)控。

5. 統(tǒng)計分析方法：砷、鉛、鎘、鎳金屬濃度用中位值及四分位間距表示，基因甲基化水平用表示。采用Spearman等級相關(guān)法進行相關(guān)分析。對四種金屬含量進行l(wèi)og對數(shù)轉(zhuǎn)換，并采用多重線性回歸模型調(diào)整混雜，分析四種重金屬對DNMT3B甲基化水平的影響?；祀s因素包括母親分娩年齡、孕前BMI、文化程度、職業(yè)、圍孕期葉酸補充情況、主動或被動吸煙暴露、胎兒孕周及胎兒性別。使用Stata 14.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析。雙側(cè)P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

本研究共納入173例無重大體表出生缺陷胎兒，均為漢族，男性和女性的比例分別為44.7%、55.3%，平均孕周為(39.8±3.0)周。接受問卷調(diào)查的母親平均分娩年齡為(27.0±4.7)歲，孕前BMI為(23.0±3.6)kg/m2。113(65.3%)人文化程度為初中及以下。大部分人(77.3%)的職業(yè)為農(nóng)民，89(53.0%)人為初產(chǎn)婦。其余孕期環(huán)境因素暴露特征見表1。

表1 母親、胎兒基本人口學(xué)及孕期環(huán)境暴露因素特征
Table 1 Basic demographic characteristics and prenatal environmental exposure among mothers and infants

Characteristics? n(%)Age at delivery (mean±SD)27.0±4.7BMI (mean±SD)23.0±3.6Education level Junior school and lower113(65.3) High school and above60(34.7)Occupation Famer133(77.3) Other39(22.7)Han ethnicity173(100.0)Parity 189(53.0) ≥279(47.0)Folic acid supplementation Yes86(52.4) No78(47.6)Active or passive smoking Yes70(40.7) No102(59.3)Alcohol drinking Yes15(8.8) No156(91.2)Infant gender Male76(44.7) Female94(55.3)Gestational week (mean±SD)39.8±3.0

*The number for some variables data may not equal to total number due to missing value.

臍帶組織中，砷、鉛、鎘、鎳濃度的中位值及四分位間距分別為7.66(5.24～10.30) ng/g、23.91(16.74～44.29) ng/g、0.95(0.47～2.71) ng/g、21.42(15.61～32.2) ng/g。臍帶血中DNMT3B基因平均甲基化水平為(7.38±2.66)%。Spearman等級相關(guān)法結(jié)果顯示，鎘與DNMT3B甲基化水平存在相關(guān)性(r=0.19， P=0.01)，其余金屬與DNMT3B甲基化水平無相關(guān)性(P>0.05)。4種重金屬的濃度均為偏態(tài)分布，進行l(wèi)og對數(shù)轉(zhuǎn)換，分別繪制散點圖。詳見圖1。

圖1 臍帶中砷、鉛、鎘、鎳金屬含量與DNMT3B甲基化水平散點圖
Figure 1 Correlation between concentrations of As, Pb, Cd and Ni in umbilical cord and DNMT3B methylation level

以DNMT3B甲基化水平為因變量，各金屬濃度的log轉(zhuǎn)換值為自變量，調(diào)整混雜因素，進行多重線性回歸分析?；貧w結(jié)果顯示，臍帶組織中鎘含量對DNMT3B甲基化水平的影響有統(tǒng)計學(xué)意義(β=0.74, P=0.03)。其余金屬對DNMT3B甲基化水平無顯著影響(P>0.05)。詳見表2。

表2 臍帶中砷、鉛、鎘、鎳金屬對DNMT3B甲基化水平的影響
Table 2 Effect of umbilical cord As, Pb, Cd and Ni on DNMT3B methylation level

MetalsβSE95% CIArsenic 0.330.53-0.71, 1.37Lead 0.010.65-1.28, 1.30Cadmium 0.740.34 0.06, 1.42?Nickel-0.650.75-2.13, 0.83

*P<0.05

多重線性回歸模型中分別加入鎘與砷、鉛、鎳金屬兩兩配對的交互項，結(jié)果顯示鎘與砷、鉛、鎳金屬對DNMT3B甲基化的影響均無顯著交互作用(P>0.05)。詳見表3。

表3 臍帶中重金屬交互作用對DNMT3B甲基化水平的影響
Table 3 Interaction effect among umbilical cord As, Pb, Cd and Ni on DNMT3B methylation level

MetalsβSE95% CICadmium×Arsenic-1.220.94-3.08, 1.86Cadmium×Lead-2.031.10-4.21, 0.15Cadmium×Nickel 0.361.30-2.20, 2.93

討論

本研究為橫斷面研究，以無重大體表出生缺陷的胎兒為研究對象，分析一般人群中重金屬暴露對胎兒DNA甲基化水平的影響。結(jié)果顯示，控制混雜因素后，臍帶組織鎘含量增加，會引起臍帶血中DNMT3B甲基化水平升高。未發(fā)現(xiàn)鎘與砷、鉛或鎳對DNMT3B甲基化水平的交互作用。

砷、鉛、鎘、鎳是生產(chǎn)生活環(huán)境中普遍存在的污染物，可以通過多種途徑進入人體，如呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等，對人類健康造成了很多不良影響[1]。有研究報道，砷、鉛、鎘、鎳可以通過胎盤屏障，形成宮內(nèi)暴露，引起不良妊娠結(jié)局[2,3]。本研究檢測了173例胎兒臍帶組織中砷、鉛、鎘、鎳的含量，其中，鉛、鎘含量的中位值分別為23.91 ng/g、0.95 ng/g，略低于日本的一項人群研究報道的39.9 ng/g、1.16 ng/g[15]。既往研究多采用臍帶血清樣本檢測砷含量，一項在中國人群開展的大型隊列研究(N=3474)報道臍帶血清砷含量中位值為1.87 μg/L[16]。與臍帶血相比，臍帶組織是胎兒組織的一部分，更能反映胎兒的暴露情況。本研究首次使用臍帶組織檢測砷的中位值為7.66 ng/g。本研究也首次報道了臍帶組織中鎳的含量，其中位值為21.42 ng/g。

已有研究發(fā)現(xiàn)，母親孕期砷、鉛、鎘、鎳暴露會影響胎兒的DNA甲基化水平。本研究以DNMT3B基因為目的基因，檢測甲基化水平并分析與重金屬的關(guān)系。DNMT3B基因是DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)家族的成員之一，其編碼的蛋白酶在合成甲基化(de novo methylation)過程中起重要作用[17]。對169例居住在鎘暴露區(qū)和100例非暴露區(qū)的泰國居民的尿鎘濃度檢測發(fā)現(xiàn)隨著尿鎘濃度增加，外周血DNMT3B甲基化的水平越高[14]。另一項對202名阿根廷婦女的研究發(fā)現(xiàn)低水平的尿鎘暴露(0.23 μg/L)與外周血DNMT3B基因表達呈負相關(guān)[18]。以上研究提示鎘暴露會影響DNMT3B甲基化及表達水平，但暴露測量均使用妊娠婦女尿液標(biāo)本，不能反映胎兒生長發(fā)育過程中的真實暴露情況。本研究中，多重線性回歸分析發(fā)現(xiàn)，控制混雜因素后，DNMT3B甲基化與臍帶鎘含量呈正相關(guān)，隨著鎘暴露水平的增加，DNMT3B甲基化水平升高，提示表觀遺傳改變可能是重金屬致病的重要途徑之一。

本研究還探討了鎘與砷、鉛和鎳金屬之間的交互作用。結(jié)果顯示，鎘與其他三種金屬對DNMT3B甲基化水平的影響均無統(tǒng)計學(xué)交互作用。目前有關(guān)金屬交互作用的研究較少，一項母親鎘、砷暴露與后代先天性心臟病發(fā)病風(fēng)險關(guān)聯(lián)研究中發(fā)現(xiàn)，鎘和砷對先天性心臟病發(fā)病風(fēng)險存在交互作用[19]。然而，其相互作用的生物機制尚不清楚。

本研究的優(yōu)勢在于，相比以往研究，使用臍帶組織測量胎兒發(fā)育過程中的重金屬內(nèi)暴露。使用臍帶血測量DNA甲基化水平，DNA甲基化能作為一種生物標(biāo)志物，可運用臨床上異常狀態(tài)的早期識別和診斷。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)胎兒臍帶組織重金屬暴露可能會影響DNMT3B基因甲基化水平，為今后進一步探究重金屬與疾病關(guān)聯(lián)的作用機制提供依據(jù)。此外，胎盤對重金屬缺乏有效屏障作用，為減少胎兒的宮內(nèi)暴露劑量，應(yīng)采取有效防護措施、開展合理的孕期健康教育，避免孕婦暴露于環(huán)境重金屬污染。

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