技術(shù)背景

作為茶葉的發(fā)源地之一，我國毋庸置疑是茶葉產(chǎn)量大國，2017年，我國的綠茶產(chǎn)量已超過了160萬噸，并依舊保持每年都增加的趨勢(shì)。這么多的茶葉產(chǎn)量也意味著非常多的茶葉副產(chǎn)物-茶渣的產(chǎn)生，依據(jù)茶葉的產(chǎn)量推算，每年至少有40～50萬噸的廢棄茶渣產(chǎn)生。

在綠茶的沖泡及飲用過程中，只有有限的水溶性物質(zhì)成分溶于茶湯。用于生產(chǎn)速溶茶的綠茶，茶飲料和功能成分的提取物只達(dá)到了茶葉干重的30％，而剩下的70％的干重就是茶渣。而這70％的干重中依然含有較多的營養(yǎng)物質(zhì)(例如茶多酚、氨基酸、粗纖維、粗蛋白等)。因此綜合開發(fā)綠茶資源、充分利用茶葉中的天然有效成分是時(shí)代發(fā)展的必然趨勢(shì)，具有巨大的市場(chǎng)潛力。

綠茶茶渣作為茶葉副產(chǎn)物，其中含有大量未利用的有效成分，但我國目前對(duì)綠茶茶渣的回收利用仍處在初步研究階段，這意味著綠茶中大量有效成分將成為廢棄物，付之東流。因此，若能研究出一種簡(jiǎn)單的方法使茶葉快速分解，使其中的有效成分快速、大量地釋放出來，將有利于茶渣的循環(huán)再利用，并對(duì)社會(huì)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

本研究從分解茶渣出發(fā)，旨在通過發(fā)明一種適宜綠茶茶渣降解菌的培養(yǎng)方法，通過菌株的快速降解，為利用生物法獲得綠茶茶渣中保留的有效成分，開發(fā)茶葉廢渣再利用的研究奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

目前國內(nèi)外關(guān)于微生物降解茶渣的報(bào)道較少，對(duì)茶渣的研究多集中在生產(chǎn)復(fù)合肥和茶渣成分提取等方向。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供用鮑曼不動(dòng)桿菌降解綠茶茶渣的方法，從而可以快速的降解茶渣。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是，用鮑曼不動(dòng)桿菌降解綠茶茶渣的方法，其特征在于包含以下步驟：

1.種子培養(yǎng)基的制備

稱取蔗糖7g，蛋白胨5g，浸酵母粉6g，nacl3g，加入少量無菌去離子水充分溶解，然后繼續(xù)添加無菌去離子水至1l配制種子培養(yǎng)基，將ph調(diào)至7，加熱溶解后于高溫高壓滅菌鍋中115℃滅菌30min，隨后在無菌操作環(huán)境下分裝至各個(gè)培養(yǎng)皿冷卻，每個(gè)培養(yǎng)皿分裝20ml種子培養(yǎng)基。

2.種子培養(yǎng)基接入菌種

在無菌操作環(huán)境下，將活化后傳代培養(yǎng)的不動(dòng)桿菌屬的鮑曼不動(dòng)桿菌[atcc19606]標(biāo)準(zhǔn)菌種，用無菌移液槍接入冷卻后的種子培養(yǎng)基，并在種子培養(yǎng)基上分部均勻。

3.菌的培養(yǎng)

將接有菌株的種子培養(yǎng)基密封后放入溫控?fù)u床中以恒溫37℃，180rpm/min培養(yǎng)12h。

4.菌液接入茶渣

將接有菌液并培養(yǎng)后的種子培養(yǎng)基取出，將培養(yǎng)基中的菌株與種子培養(yǎng)基用無菌移液槍調(diào)和均勻成為混合液體菌液，在無菌操作環(huán)境下，用無菌移液槍向無菌綠茶濕茶渣中接入培養(yǎng)后的混合液體菌液，茶渣與菌液接入比例為3g/ml。密封后重新置于溫控?fù)u床中以室溫培養(yǎng)72h。

本發(fā)明進(jìn)一步說明：

1.茶渣降解驗(yàn)證

設(shè)置空白對(duì)照組。在無菌操作環(huán)境下，用無菌移液槍向同一等級(jí)的無菌綠茶濕茶渣中接入不含鮑曼不動(dòng)桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌種的種子培養(yǎng)基，茶渣與菌液接入比例為3g/ml，密封后重新置于溫控?fù)u床中以室溫培養(yǎng)72h。

在掃描電鏡放大500倍數(shù)下觀察添加菌株與否后降解茶渣葉片表面的結(jié)構(gòu)變化，結(jié)果表明：空白對(duì)照組沒有接菌的茶渣表面有完整的、均勻分布的氣孔，且相鄰氣孔之間排列緊密。而接入了有菌培養(yǎng)基的茶渣在經(jīng)培養(yǎng)的菌株發(fā)酵后，茶葉表面的氣孔被擴(kuò)大，氣孔邊緣受到破壞，證明在相同的時(shí)間里，利用鮑曼不動(dòng)桿菌可快速降解綠茶茶渣。

附圖說明：圖1為空白對(duì)照

圖2為加菌株降解后茶葉發(fā)酵液外觀圖

圖3為空白對(duì)照掃描電鏡放大500倍數(shù)下結(jié)構(gòu)圖

圖4為加菌株降解后掃描電鏡放大500倍數(shù)下茶葉結(jié)構(gòu)圖

具體實(shí)施方式：

實(shí)施例1：

1.種子培養(yǎng)基的制備

稱取蔗糖7g，蛋白胨5g，浸酵母粉6g，nacl3g，加入少量無菌去離子水充分溶解，然后繼續(xù)添加無菌去離子水至1l配制種子培養(yǎng)基，將ph調(diào)至7，加熱溶解后于型號(hào)為ym75cm的高溫高壓滅菌鍋中115℃滅菌30min，隨后在無菌操作環(huán)境下分裝至各個(gè)培養(yǎng)皿冷卻，每個(gè)培養(yǎng)皿分裝20ml種子培養(yǎng)基。

2.種子培養(yǎng)基接入菌種

在無菌操作環(huán)境下，將活化后傳代培養(yǎng)的不動(dòng)桿菌屬的鮑曼不動(dòng)桿菌[atcc19606]標(biāo)準(zhǔn)菌種，用無菌移液槍接入冷卻后的種子培養(yǎng)基，并在種子培養(yǎng)基上分部均勻。

3.菌的培養(yǎng)

將接有菌株的種子培養(yǎng)基密封后放入型號(hào)為xq-200bd溫控?fù)u床中以恒溫37℃，180rpm/min培養(yǎng)12h。

4.菌液接入茶渣

將接有菌液并培養(yǎng)后的種子培養(yǎng)基取出，將培養(yǎng)基中的菌株與種子培養(yǎng)基用無菌移液槍調(diào)和均勻成為混合液體菌液，在無菌操作環(huán)境下，用無菌移液槍向3g特級(jí)碧螺春無菌濕茶渣中接入1ml培養(yǎng)后的混合液體菌液，密封后重新置于溫控?fù)u床中以室溫培養(yǎng)72h。

5.茶渣降解驗(yàn)證

設(shè)置空白對(duì)照組。在無菌操作環(huán)境下，用無菌移液槍吸取1ml沒有接菌的種子培養(yǎng)基，加入到3g特級(jí)碧螺春茶葉的無菌濕茶渣中，密封后重新置于溫控?fù)u床中以室溫培養(yǎng)72h。

72h后同時(shí)觀察空白對(duì)照與發(fā)酵液外觀變化以及空白對(duì)照與發(fā)酵液在電鏡觀察下的結(jié)構(gòu)變化，發(fā)現(xiàn)接入加有鮑曼不動(dòng)桿菌[atcc19606]標(biāo)準(zhǔn)菌種混合培養(yǎng)基的碧螺春茶渣已被分解，電鏡下碧螺春茶渣表面的氣孔被擴(kuò)大，氣孔邊緣受到破壞。而對(duì)照空白組中的茶渣則還未開始分解且電鏡下的碧螺春茶渣表面有完整的、均勻分布的氣孔，且相鄰氣孔之間排列緊密。

實(shí)施例2：

1.種子培養(yǎng)基的制備

稱取蔗糖7g，蛋白胨5g，浸酵母粉6g，nacl3g，加入少量無菌去離子水充分溶解，然后繼續(xù)添加無菌去離子水至1l配制種子培養(yǎng)基，將ph調(diào)至7，加熱溶解后于型號(hào)為ym75cm的高溫高壓滅菌鍋中115℃滅菌30min，隨后在無菌操作環(huán)境下分裝至各個(gè)培養(yǎng)皿冷卻，每個(gè)培養(yǎng)皿分裝20ml種子培養(yǎng)基。

2.種子培養(yǎng)基接入菌種

在無菌操作環(huán)境下，將活化后傳代培養(yǎng)的不動(dòng)桿菌屬的鮑曼不動(dòng)桿菌[atcc19606]標(biāo)準(zhǔn)菌種，用無菌移液槍接入冷卻后的種子培養(yǎng)基，并在種子培養(yǎng)基上分部均勻。

3.菌的培養(yǎng)

將接有菌株的種子培養(yǎng)基密封后放入型號(hào)為xq-200bd溫控?fù)u床中以恒溫37℃，180rpm/min培養(yǎng)12h。

4.菌液接入茶渣

將接有菌液并培養(yǎng)后的種子培養(yǎng)基取出，將培養(yǎng)基中的菌株與種子培養(yǎng)基用無菌移液槍調(diào)和均勻成為混合液體菌液，在無菌操作環(huán)境下，用無菌移液槍向3g一級(jí)龍井無菌濕茶渣中接入1ml培養(yǎng)后的混合液體菌液，密封后重新置于溫控?fù)u床中以室溫培養(yǎng)72h。

5.茶渣降解驗(yàn)證

設(shè)置空白對(duì)照組。在無菌操作環(huán)境下，用無菌移液槍吸取1ml沒有接菌的種子培養(yǎng)基，加入到3g一級(jí)龍井茶葉的無菌濕茶渣中，密封后重新置于溫控?fù)u床中以室溫培養(yǎng)72h。

72h后同時(shí)觀察空白對(duì)照與發(fā)酵液外觀變化以及空白對(duì)照與發(fā)酵液在電鏡觀察下的結(jié)構(gòu)變化，發(fā)現(xiàn)接入加有鮑曼不動(dòng)桿菌[atcc19606]標(biāo)準(zhǔn)菌種混合培養(yǎng)基的龍井茶渣已被分解，電鏡下龍井茶渣表面的氣孔被擴(kuò)大，氣孔邊緣受到破壞。而對(duì)照空白組中的茶渣則還未開始分解且電鏡下的龍井茶渣表面有完整的、均勻分布的氣孔，且相鄰氣孔之間排列緊密。

實(shí)施例3：

1.種子培養(yǎng)基的制備

稱取蔗糖7g，蛋白胨5g，浸酵母粉6g，nacl3g，加入少量無菌去離子水充分溶解，然后繼續(xù)添加無菌去離子水至1l配制種子培養(yǎng)基，將ph調(diào)至7，加熱溶解后于型號(hào)為ym75cm的高溫高壓滅菌鍋中115℃滅菌30min，隨后在無菌操作環(huán)境下分裝至各個(gè)培養(yǎng)皿冷卻，每個(gè)培養(yǎng)皿分裝20ml種子培養(yǎng)基。

2.種子培養(yǎng)基接入菌種

在無菌操作環(huán)境下，將活化后傳代培養(yǎng)的不動(dòng)桿菌屬的鮑曼不動(dòng)桿菌[atcc19606]標(biāo)準(zhǔn)菌種，用無菌移液槍接入冷卻后的種子培養(yǎng)基，并在種子培養(yǎng)基上分部均勻。

3.菌的培養(yǎng)

將接有菌株的種子培養(yǎng)基密封后放入型號(hào)為xq-200bd溫控?fù)u床中以恒溫37℃，180rpm/min培養(yǎng)12h。

4.菌液接入茶渣

將接有菌液并培養(yǎng)后的種子培養(yǎng)基取出，將培養(yǎng)基中的菌株與種子培養(yǎng)基用無菌移液槍調(diào)和均勻成為混合液體菌液，在無菌操作環(huán)境下，用無菌移液槍向3g二級(jí)無錫毫茶無菌濕茶渣中接入1ml培養(yǎng)后的混合液體菌液，密封后重新置于溫控?fù)u床中以室溫培養(yǎng)72h。

5.茶渣降解驗(yàn)證

設(shè)置空白對(duì)照組。在無菌操作環(huán)境下，用無菌移液槍吸取1ml沒有接菌的種子培養(yǎng)基，加入到3g二級(jí)無錫毫茶茶葉的無菌濕茶渣中，密封后重新置于溫控?fù)u床中以室溫培養(yǎng)72h。

72h后同時(shí)觀察空白對(duì)照與發(fā)酵液外觀變化以及空白對(duì)照與發(fā)酵液在電鏡觀察下的結(jié)構(gòu)變化，發(fā)現(xiàn)接入加有鮑曼不動(dòng)桿菌[atcc19606]標(biāo)準(zhǔn)菌種混合培養(yǎng)基的無錫毫茶茶渣已被分解，電鏡下無錫毫茶茶渣表面的氣孔被擴(kuò)大，氣孔邊緣受到破壞。而對(duì)照空白組中的茶渣則還未開始分解且電鏡下的無錫毫茶茶渣表面有完整的、均勻分布的氣孔，且相鄰氣孔之間排列緊密。

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