2021-01-20 09:40   點擊次數(shù)：3024 關(guān)鍵詞： 益生菌活菌計數(shù)方法比較研究

益生菌活菌計數(shù)方法現(xiàn)狀

  隨著益生菌功能研究的深入，益生菌越來越多地應(yīng)用于食品和保健食品中，“ 活菌數(shù)”是保證其相關(guān)產(chǎn)品質(zhì)量的一個關(guān)鍵指標(biāo)。提高益生菌活菌計數(shù)方法的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，可以為企業(yè)生產(chǎn)過程中對益生菌相關(guān)產(chǎn)品質(zhì)量的控制、提升食品質(zhì)量安全水平提供技術(shù)支撐，同時可以更好地應(yīng)用于監(jiān)管部門的專項抽查、風(fēng)險監(jiān)控、執(zhí)法檢驗等活動中。

  目前較普遍使用的益生菌活菌計數(shù)方法是參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.35-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗乳酸菌檢驗》。

  食品用乳酸菌主要分為兩大類:一類是食品加工用乳酸菌;第二類是具有健康功能的活的乳酸菌，又稱益生菌。與食品加工用乳酸菌特征指標(biāo)不同的是，益生菌產(chǎn)品的活菌數(shù)通常都很高，可達(dá)到100億至1000億以上，而冷凍干燥菌粉原料中活菌數(shù)甚至可達(dá)到1000億至10000億，且生產(chǎn)日活菌添加量與保質(zhì)期內(nèi)活菌穩(wěn)定性通常是益生菌產(chǎn)品最關(guān)鍵的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和功效指標(biāo)，也是衡量益生菌原料與終端產(chǎn)品市場價值最核心與關(guān)鍵的因素?，F(xiàn)行國標(biāo)在實際應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，進(jìn)行高活菌密度、某些特殊劑型及配方或含有某些新菌種的益生菌產(chǎn)品的活菌計數(shù)時，常常出現(xiàn)結(jié)果不穩(wěn)定或檢驗結(jié)果明顯低于生產(chǎn)時活菌添加量的情況。

  影響計數(shù)結(jié)果最主要的影響因素包括稀釋液和計數(shù)培養(yǎng)基。樣品稀釋時，三個因素對活菌的準(zhǔn)確計數(shù)影響最大:稀釋比例、稀釋液組成和pH值。綜述前人的研究經(jīng)驗(2):樣品制備的稀釋比例為1:5-1:10 ;稀釋后樣品懸液的pH值最好與最佳生長pH值-致;因益生菌具有氧敏感性,稀釋液中應(yīng)該含有抗氧化劑。日本研究者M(jìn)asamichi MUTO和Fumiaki ABE等(2010年)在研究了多種稀釋液配方后認(rèn)為，Mitsuoka' s緩沖液適用于含有嚴(yán)格厭氧的雙歧桿菌活菌產(chǎn)品的稀釋，該緩沖液含有磷酸鹽、半胱氨酸和吐溫80,前2個成分分別具有緩沖能力、抗氧化能力，而吐溫80則可改善產(chǎn)品在稀釋液中的分散能力。(3)目前國標(biāo)方法選用的培養(yǎng)基如下:以MRS瓊脂(厭氧)為總?cè)樗峋嫈?shù)培養(yǎng)基;在含有多菌種的產(chǎn)品中，以添加有莫匹羅星抗生素的MRS瓊脂(厭氧)作為雙岐桿菌選擇性計數(shù)培養(yǎng)基，以MC瓊脂(需氧)為嗜熱鏈球菌選擇性計數(shù)培養(yǎng)基，以總?cè)樗峋鷶?shù)減去雙歧桿菌和嗜熱鏈球菌數(shù)為乳桿菌數(shù)。但是,近年來,綜述多個研究結(jié)果(2, 3)，RCM培養(yǎng)基可提高冷凍干燥雙歧桿菌的活菌計數(shù)準(zhǔn)確性。

  此外，本實驗室多年來采用GB 4789 .34-2003《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗雙岐桿菌檢驗》中推薦的TPY瓊脂培養(yǎng)基用于乳酸菌的計數(shù)，發(fā)現(xiàn)其用于益生菌產(chǎn)品的活菌計數(shù)結(jié)果較穩(wěn)定。

  為此，本研究比較了兩種稀釋液及幾種計數(shù)培養(yǎng)基對兩類代表性益生菌產(chǎn)品(冷凍干燥活菌粉原料和益生菌顆粒產(chǎn)品)活菌計數(shù)結(jié)果的影響，以確定更符合益生菌產(chǎn)品特點的活菌計數(shù)方法。

材料和方法

試劑及培養(yǎng)基

  生理鹽水; Mitsuoka' s緩沖液(6.0g Na2HPO, 4.5 g KH2PO,，0.5g L-半胱氨酸鹽酸鹽，0.5g吐溫80，1000mL蒸餾水);MRS瓊脂、TPY瓊脂(青島海博) ; RCM瓊脂(OXOID)。改良MRS、改良TPY和改良RCM瓊脂分別為添加有50μg/ml莫匹羅星鋰鹽(青島海博)。

樣品

  所用樣品為嗜酸乳桿菌LA11-ONLLY冷凍干燥活菌粉(3000億CFU/g)、長雙歧桿菌BL88-ONLLY冷凍干燥活菌粉(3000億CFU/g)和昂立1號益生菌顆粒(國食健字G20060027)產(chǎn)品，均來自上海交大昂立股份有限公司，各選取三個批號的樣品進(jìn)行平行檢驗。

實驗方法

  稱取2.00g士0.01g樣品，分別至18ml生理鹽水或Mitsuoka' s緩沖液中，均質(zhì)1 min,靜置5 min,分別用生理鹽水或Mitsuoka's緩沖液梯度稀釋至合適濃度。

乳桿菌菌粉計數(shù)

  以MRS、TPY瓊脂培養(yǎng)基，分別置于37°C厭氧、好氧條件下培養(yǎng)48-72小時，比較不同稀釋液和培養(yǎng)基對計數(shù)結(jié)果的影響。

雙歧桿菌菌粉計數(shù)

  以MRS、TPY和RCM瓊脂培養(yǎng)基，分別置于37°C厭氧培養(yǎng)48-72小時，比較不同稀釋液和培養(yǎng)基對計數(shù)結(jié)果的影響。

冷凍干燥活菌粉的計數(shù)結(jié)果

乳桿菌冷凍干燥菌粉

  由于乳桿菌為兼性厭氧菌，在好氧和厭氧條件下均可生長，本研究以生理鹽水或Mitsuo-ka’s緩沖液為菌粉稀釋液，以MRS或TPY為培養(yǎng)基,分別在好氧和厭氧進(jìn)行培養(yǎng)。三批嗜酸乳桿菌LAI1-ONLLY菌粉采用不同方法計數(shù)的結(jié)果見表1和圖1。

  從結(jié)果看出，培養(yǎng)方式對計數(shù)結(jié)果影響很小;而稀釋液對計數(shù)結(jié)果有顯著影響。用生理鹽水稀釋和用Mitsuoka's緩沖液稀釋后計數(shù)結(jié)果分別為3.95×1011cfu/g

和4.47×1011cfu/g，用生理鹽水作為稀釋液可檢出的活菌僅為Mitsuoka' s緩沖液的87%。

雙歧桿菌冷凍干燥菌粉

  雙歧桿菌與乳桿菌不同，為嚴(yán)格厭氧菌，僅在厭氧條件下生長。分別考察兩種稀釋液和三種培養(yǎng)基對長雙歧桿菌BL88-ONLLY菌粉計數(shù)結(jié)果的影響，結(jié)果見表2。

  從表2結(jié)果可見，菌粉稀釋液和培養(yǎng)基均對計數(shù)結(jié)果產(chǎn)生了顯著影響，Mitsuoka' S緩沖液與RCM瓊脂組合檢出的活菌數(shù)最高，以此為100%，那么Mitsuoka' s緩沖液與MRS和TPY組合的計數(shù)結(jié)果分別為36%和98%;而用生理鹽水，MRS、TPY和RCM計數(shù)結(jié)果僅分別25%、76%和78%，生理鹽水作為稀釋液對活菌細(xì)胞影響較大，會影響計數(shù)結(jié)果。

益生菌顆粒計數(shù)結(jié)果

稀釋液對pH值的影響

  對昂立1號‘益生菌顆粒連續(xù)3個批號，分別采用生理鹽水和Mitsuoka'S緩沖液溶解并測定pH值，結(jié)果見表3。生理鹽水稀釋液pH值為4.41,而Mitsuoka' s緩沖液組的為6.56?？梢?，稀釋液對樣品勻液的pH值影響較大。

益生菌顆?？?cè)樗峋嫈?shù)

  采用生理鹽水和Mitsuoka’s緩沖液進(jìn)行樣品稀釋，分別以MRS、TPY和RCM厭氧培養(yǎng)進(jìn)行總?cè)樗峋嫈?shù)，結(jié)果見表4。Mitsuoka' s緩沖液與RCM組合的計數(shù)結(jié)果記為100%，則MRS和TPY的結(jié)果分別為85%和98%，而用生理鹽水時三種培養(yǎng)基結(jié)果分別為60%、74%和72%，這表明，MRS用于乳桿菌和雙歧桿菌復(fù)配產(chǎn)品的總?cè)樗峋嫈?shù)時，結(jié)果偏低，Mitsuoka’s緩沖液、TPY和RCM培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)更適用于本產(chǎn)品中總?cè)樗峋嫈?shù)。

益生菌顆粒長雙歧桿菌選擇性計數(shù)

  用Mitsuoka' s緩沖液溶解后，以改良MRS、改良TPY和改良RCM厭氧培養(yǎng)，并與國標(biāo)比較，結(jié)果見表5。以改良RCM結(jié)果為100%,改良TPY結(jié)果為96%左右，而改良MRS結(jié)果只有71%左右。可見，MRS不適于長雙歧桿菌的活菌計數(shù)，RCM或TPY更適合。國標(biāo)方法(生理鹽水/改良MRS培養(yǎng)基)的計數(shù)結(jié)果僅為59%左右，推薦使用Mitsuoka' S緩沖液、改良TPY或改良RCM培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)進(jìn)行益生菌顆粒產(chǎn)品長雙歧桿菌選擇性計數(shù)。

益生菌顆粒嗜酸乳桿菌選擇性計數(shù)

  用國標(biāo)方法(生理鹽水/ MRS厭氧培養(yǎng)總數(shù)減去改良MRS厭氧培養(yǎng)數(shù))、Mitsuoka' s緩沖液/MRS/好氧培養(yǎng)、Mitsuoka' s緩沖液/TPY/好氧培養(yǎng)方法進(jìn)行選擇性計數(shù)，結(jié)果見表6。以Mitsuoka' S緩沖液/TPY/好氧培養(yǎng)方法計數(shù)結(jié)果為100%,Mitsuoka' S緩沖液/MRS/好氧培養(yǎng)結(jié)果約為95%，而國標(biāo)方法結(jié)果僅為55%。根據(jù)本實驗結(jié)果，推薦使用Mitsuoka’s緩沖液、MRS或TPY好氧條件下進(jìn)行益生菌顆粒中嗜酸乳桿菌選擇性計數(shù)。

討論

  推薦用于冷凍干燥活菌粉的稀釋液和培養(yǎng)基。稀釋液對結(jié)果的影響可能是由于高密度菌粉本身呈酸性，若菌粉稀釋液呈酸性，可能會對細(xì)胞造成傷害，而Mitsuoka's緩沖液添加了磷酸鹽作為緩沖體系以及吐溫80作為細(xì)胞膜表面活性劑，可以保護(hù)細(xì)胞在溶解復(fù)水過程中免受損害。經(jīng)過本實驗，推薦Mitsuoka' S緩沖液作為冷凍干燥活菌粉的菌粉和梯度稀釋液;推薦MRS和TPY瓊脂好氧培養(yǎng)用于乳桿菌冷凍干燥活菌粉的計數(shù);推薦TPY和RCM瓊脂厭氧培養(yǎng)用于雙歧桿菌冷凍干燥活菌粉的計數(shù)。

  推薦用于益生菌產(chǎn)品的稀釋液和培養(yǎng)基。Mitsuoka's緩沖液比生理鹽水更適合用于該活菌產(chǎn)品的稀釋。益生菌顆粒為乳桿菌與雙歧桿菌及其它輔料復(fù)配而成的產(chǎn)品。本研究推薦用TPY或RCM在厭氧條件下檢驗總?cè)樗峋鷶?shù)，采用MRS或TPY在好氧條件下檢驗嗜酸乳桿菌數(shù)，采用以莫匹羅星鋰鹽改良的TPY或改良RCM在厭氧條件下檢驗長雙歧桿菌數(shù)。

結(jié)論

  通過比較研究，發(fā)現(xiàn)Mitsuoka' s緩沖液更適用于益生菌活菌樣品溶解與梯度稀釋。對乳桿菌活菌粉，推薦采用MRS或TPY于好氧或厭氧條件下計數(shù);對雙歧桿菌活菌粉，推薦采用TPY或RCM于厭氧條件下計數(shù);對乳桿菌和雙歧桿菌混合復(fù)配產(chǎn)品，推薦采用TPY或RCM于厭氧條件下進(jìn)行總?cè)樗峋嫈?shù)，采用莫匹羅星鋰鹽改良的TPY或改良RCM于厭氧條件下進(jìn)行雙歧桿菌選擇性計數(shù)，采用MRS或TPY于好氧條件下進(jìn)行嗜酸乳桿菌選擇性計數(shù)。

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