▉  導(dǎo)讀

近年來，CAR技術(shù)高速發(fā)展，在血液腫瘤治療方面取得了突破性成功，多款CAR-T藥物獲批上市。CAR技術(shù)遠(yuǎn)不止于腫瘤治療，在感染性疾病治療及自身免疫疾病中也有著新的發(fā)展。

圖源：《 regulatory  T cells  (Treg ) and their  roles in immu ne  system  with respect to  imm unopath olo gical  dis o rders》

T細(xì)胞在控制癌癥、傳染病和自身免疫疾病發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其中主要兩大類T細(xì)胞協(xié)同工作，維持免疫穩(wěn)態(tài)。第一個(gè)亞群是效應(yīng)T細(xì)胞，能夠消除病原體和腫瘤，雖然效應(yīng)T細(xì)胞反應(yīng)通常是有效的，但一部分傳染病和腫瘤已經(jīng)進(jìn)化出各種各樣的逃逸機(jī)制來繞過T細(xì)胞控制；第二個(gè)亞群是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)，調(diào)節(jié)自身免疫反應(yīng)，在自身免疫疾病中也存在一定局限。

圖源：https://www.creative-biolabs.com/blog/index.php/is-bio-distribution-study-necessary-for-car-t-therapy/

嵌合抗原受體 (CAR) 技術(shù)已成為重編程T細(xì)胞一種有前途的技術(shù)，以克服天然T 細(xì)胞的不足。CAR這一概念最早出現(xiàn)于1990年代，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞經(jīng)嵌合抗原受體及CD3胞內(nèi)激活信號(hào)域修飾后，可使T細(xì)胞可直接特異性識(shí)別細(xì)胞表面抗原發(fā)揮作用。CAR技術(shù)直接改變了T細(xì)胞識(shí)別抗原的方式，繞過了MHC限制性，具有高特異性，避免了T細(xì)胞免疫逃逸。

此文獻(xiàn)探討利用CAR技術(shù)治療HIV以及自身免疫和移植排斥疾病機(jī)遇與挑戰(zhàn)。

▉CAR-T細(xì)胞清除HIV

HIV感染人體后引發(fā)抗病毒免疫，但免疫系統(tǒng)無法完全清除被感染的細(xì)胞，且被感染細(xì)胞會(huì)下調(diào)抗原表達(dá)來逃避免疫監(jiān)視，一部分潛伏細(xì)胞休眠數(shù)年，機(jī)會(huì)性產(chǎn)生病毒，需終生進(jìn)行抗病毒治療。早期抗病毒治療雖能減少病毒載量但不能完全清除HIV病毒。一些因素如病毒逃逸、T細(xì)胞功能紊亂、免疫細(xì)胞耗竭影響HIV病毒的清除。

CAR-T治療HIV（圖源：https://doi.org/10.3389/fimmu.2020.00361）

目前抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療(anti-retroviral therapy, ART)可有效控制HIV感染，但無法完全清除體內(nèi)HIV病毒。

CTL細(xì)胞 (細(xì)胞毒性T細(xì)胞)是機(jī)體應(yīng)對(duì)病毒感染的主力軍，但CTL細(xì)胞抗原識(shí)別具M(jìn)HC限制性，CAR修飾CTL細(xì)胞能夠避免CTL細(xì)胞局限性（詳見下表），可有效控制感染，并防止?jié)摲《驹偌せ睢?br>

靶向HIV的CART細(xì)胞歷經(jīng)幾代發(fā)展逐步成形。

1995-2005年一代CAR結(jié)構(gòu)的靶向CD4-CART細(xì)胞證明了細(xì)胞治療HIV的安全性和可行性，但一代CAR結(jié)構(gòu)中僅包含一個(gè)共刺激因子結(jié)構(gòu)域，作用有限，未能持久地減少血液和組織內(nèi)的病毒負(fù)荷。

隨著二代CAR結(jié)構(gòu)的更新，胞內(nèi)信號(hào)域含2個(gè)共刺激因子結(jié)構(gòu)域4-1BB+CD3或CD28+CD3，提升T細(xì)胞的功能。較一代，基于4-1BB+CD3二代 CD4-CAR-T細(xì)胞(下圖 a)體外抗病毒效果提升了50倍，小鼠感染模型中能夠顯著降低病毒負(fù)荷。靶向HIV的二代CAR結(jié)構(gòu)的CAR-T細(xì)胞，其抗原識(shí)別區(qū)域?yàn)?strong>靶向Env蛋白保守位點(diǎn)的scFv，包括CD4結(jié)合位點(diǎn)、gp41、多聚糖，為廣譜中和抗體（下圖 b）。盡管scFv-CART在體外可發(fā)揮較強(qiáng)的抗病毒作用應(yīng)用于臨床也存在一些挑戰(zhàn)，需克服HIV逃逸及持久性差的困難。

CD4-CART細(xì)胞治療HIV示意圖

此外，Bi-CAR雙特異性CAR設(shè)計(jì)是將CD4與bNab中的scFv或人C型凝集素識(shí)別域（CRD）融合，CD4片段與Env蛋白的gp120亞基結(jié)合，CRD結(jié)合Env蛋白中的糖基部分，但CRD與可正常細(xì)胞結(jié)合引起副作用。（上圖 c和 上圖 d）

圖源：《Application of CAR-T Cell Therapy beyond Oncology:Autoimmune Diseases and Viral Infections》

維持CAR-T細(xì)胞體內(nèi)持久性的策略

1. 多次輸注  持久性與CAR-T功能的發(fā)揮有著重要的關(guān)聯(lián)，CD19-CAR-T抗腫瘤的研究中，B細(xì)胞腫瘤抗原負(fù)荷能夠影響CAR T細(xì)胞的增殖和持久性，而在HIV感染中，接受cART抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的個(gè)體抗原負(fù)荷影響有限。維持CAR-T細(xì)胞的持久性需多次輸注 HIV 特異性 CAR T 細(xì)胞，維持足夠數(shù)量以應(yīng)對(duì)反彈。     2. 加強(qiáng)免疫治療  抗病毒疫苗加強(qiáng)免疫以維持足夠多的抗原特異性的記憶細(xì)胞。此策略也可應(yīng)用于CAR-T抗病毒研究中，表達(dá)病毒抗原的CART細(xì)胞通過TCR信號(hào)途徑刺激HIV特異性CAR-T細(xì)胞，治愈HIV還需要CART細(xì)胞能夠在低抗原負(fù)荷中持久生存。     3. HSPC來源CART細(xì)胞  造血干細(xì)胞(hematopoietic stem and progenitor cells, HSPC)具有自我更新能力，可實(shí)現(xiàn)持久性。造血干細(xì)胞來源的T細(xì)胞可能會(huì)克服外周血來源的細(xì)胞在較低抗原負(fù)荷環(huán)境中的持續(xù)性差的問題。HPSC來源的一代CART細(xì)胞可以穩(wěn)定生存近2年,且能避免產(chǎn)生CAR與TCR交叉反應(yīng)的問題。  

圖源：《Gene therapy targeting haematopoietic stem cells for inherited diseases: progress and challenges》

CAR-T治療HIV也存在諸多挑戰(zhàn)：

1.抗性

CAR-T細(xì)胞也會(huì)受到HIV病毒感染，保護(hù)CAR-T細(xì)胞免受HIV感染是至關(guān)重要的。CCR5是病毒進(jìn)入機(jī)體的重要分子，科學(xué)家將靶向CCR5的shRNA基因整合到CAR-T 細(xì)胞中，shRNA下調(diào)CCR5表達(dá)防止病毒感染CART細(xì)胞。此外，研究者采用鋅指核酸酶編輯、定點(diǎn) megaTAL 核酸酶等基因編輯技術(shù)修飾CCR5阻止HIV病毒進(jìn)入機(jī)體。

研究者認(rèn)為攜帶完整HIV病毒的CD4+T細(xì)胞是CART治療后復(fù)發(fā)的原因，此細(xì)胞下調(diào)Nef表達(dá)逃避CTL殺傷。CTL細(xì)胞識(shí)別病毒需要MHC分子，而CAR-T細(xì)胞非MHC限制性，可識(shí)別完整的HIV病毒，裂解含HIV前病毒的CD4+T細(xì)胞。采用延遲逆轉(zhuǎn)劑LRA破壞病毒潛伏狀態(tài)，潛伏病毒可以被激活并被免疫細(xì)胞殺死，但逆轉(zhuǎn)劑并不能減小潛伏病毒數(shù)量。

HIV在B淋巴濾泡中發(fā)生免疫逃逸，表現(xiàn)為HIV特異性CTL細(xì)胞在淋巴組織中毒性降低，低表達(dá)穿孔素和顆粒酶，不能清除被感染的CD4+Tfh細(xì)胞。CART通過表達(dá)CCR5進(jìn)入B淋巴濾泡中，清除病毒感染細(xì)胞，采用基因編輯修飾CART細(xì)胞可將CART細(xì)胞帶入被感染組織位點(diǎn)。

CART在B淋巴濾泡中的作用

2. 毒性

由于HIV的Env蛋白非自身抗原，可實(shí)現(xiàn)HIV特異性靶向，毒性較小但臨床上的毒性未見有報(bào)道。

3. 細(xì)胞因子風(fēng)暴 

腫瘤研究中，高抗原負(fù)荷產(chǎn)生的細(xì)胞因子風(fēng)暴比較嚴(yán)重。而對(duì)于HIV治療中，初期抗原負(fù)荷低，出現(xiàn)細(xì)胞因子風(fēng)暴可能性??；但當(dāng)CART細(xì)胞不能控制HIV時(shí)，可能會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞因子風(fēng)暴，通常采用IL-6或者cART終止不良反應(yīng)。

4. 高成本是腫瘤和HIV治療中的共同重要問題。

總結(jié)

二代CAR-T細(xì)胞在應(yīng)用于小鼠和非靈長類HIV感染模型中是安全有效的。但是，成功的CAR-T細(xì)胞治療需長期持久并能夠清除潛在的HIV病毒。目前來看增強(qiáng)CAR-T在較低抗原負(fù)荷中持久性及增強(qiáng)CAR-T耐受HIV感染還任重而道遠(yuǎn)。  ▉ CAR-T用于自身免疫疾病T細(xì)胞維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)（圖源：https://doi.org/ 10.1016/j.molmet.2013.12.005）

自身免疫疾病治療常會(huì)產(chǎn)生副作用。CAR-T作為一種突破性療法，可直接殺死自身病理性的免疫細(xì)胞。Treg細(xì)胞在調(diào)節(jié)自身免疫性疾病起著重要作用。CAR分子可以引導(dǎo)Treg細(xì)胞到達(dá)免疫環(huán)境中，發(fā)揮特異性的免疫抑制功能。

圖源: 《Prospects of the Use of Cell Therapy to Induce Immune Tolerance》

CAR Treg 細(xì)胞自身免疫疾病中的試驗(yàn)

CAARS（Chimeric autoantibody receptors）嵌合自身抗體可使CAART細(xì)胞靶向破壞自身免疫B細(xì)胞，當(dāng)自身免疫B細(xì)胞上的BCR受體遇到CAART細(xì)胞時(shí)，可被破壞無法產(chǎn)生抗體。

在尋常皰疹小鼠模型中，由于自身免疫B細(xì)胞靶向自身的desmogleins蛋白，導(dǎo)致皮膚粘膜發(fā)生皰疹，傳統(tǒng)上用皮質(zhì)類固醇和其他免疫抑制劑進(jìn)行治療減少全身性免疫反應(yīng)。CART突破性療法通過表達(dá)desmoglein3二代CAAR（4–1BB–CD3ζ胞內(nèi)信號(hào)域）T細(xì)胞，與BCR相互作用，誘導(dǎo)自身免疫的B細(xì)胞裂解發(fā)揮作用，以此思路類推，CAART細(xì)胞可應(yīng)用于其他B細(xì)胞相關(guān)的自身免疫疾病中，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。

另一項(xiàng)標(biāo)志性研究，在小鼠模型中靶向TNBS的CAR Treg細(xì)胞可用于治療TNBS引起的結(jié)腸炎，體內(nèi)可檢測到CAR T reg細(xì)胞，能夠以抗原特異性增殖，可運(yùn)輸?shù)桨衅鞴俨?strong>在靶器官中增殖，結(jié)果顯示CAR T reg細(xì)胞可預(yù)防或改善小鼠結(jié)腸炎。  圖源：《Application of CAR-T Cell Therapy beyond Oncology:Autoimmune Diseases and Viral Infections》

CAR Treg 細(xì)胞在器官移植中應(yīng)用：

識(shí)別 HLA 分子（human leukocyte antigen, 人類白細(xì)胞抗原）的嵌合抗原受體 (CAR) 的調(diào)節(jié)性 T (Treg) 細(xì)胞為自身免疫提供了理想的方案（見下圖）。HLA因其表達(dá)量高且僅在移植器官上表達(dá)，是理想治療靶點(diǎn)。此外，靶向HLA的CAR Treg 細(xì)胞不會(huì)對(duì)移植細(xì)胞的功能產(chǎn)生影響。

HLA-A2 特異性 CAR Treg 細(xì)胞已被用于預(yù)防免疫缺陷小鼠的移植物抗宿主病 (GVHD)和皮膚移植排斥反應(yīng)，體外FOXP3表達(dá)水平正常，具有良好擴(kuò)增能力，細(xì)胞毒性小。重要的是，猿猴和人類 MHC 分子高度保守，可在靈長類動(dòng)物上直接HLA特異性CAR評(píng)估器官移植可能性，易于動(dòng)物模型的評(píng)價(jià)。

CAR-Treg治療GVHD

CAR-T治療自身免疫疾病中也存在諸多挑戰(zhàn)：

1. 靶標(biāo)選擇

與腫瘤靶標(biāo)選擇類似，自身免疫靶標(biāo)也需要在細(xì)胞表面高表達(dá)且具有組織特異性。腫瘤治療中靶外毒性的副作用是非常嚴(yán)重的，而自身免疫疾病治療中，CAR Treg 細(xì)胞組織外產(chǎn)生副作用小。然而，在某些CAR可觀察到較強(qiáng)的信號(hào)會(huì)使CAR Treg 細(xì)胞產(chǎn)生組成型抑制活性；

另一問題，CAR Treg細(xì)胞可能會(huì)優(yōu)先歸巢到組織外，可能會(huì)限制特異性CAR Treg細(xì)胞療法。此外，Treg 細(xì)胞在其他健康組織中的積累可能會(huì)有利于腫瘤形成或病原體存活，這一問題目前尚未得到解決。

2.  細(xì)胞穩(wěn)定性

理論上，若效應(yīng)CAR-T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為 Treg 細(xì)胞可能會(huì)加速疾病進(jìn)展，但目前在癌癥試驗(yàn)中尚未觀察到。相比之下，若CAR Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)化為效應(yīng)T 細(xì)胞有可能加劇疾病進(jìn)展，可能會(huì)引起重大的安全問題。小鼠模型研究表明，當(dāng)Treg 細(xì)胞暴露于炎癥環(huán)境，細(xì)胞會(huì)下調(diào)FOXP3 的表達(dá)并產(chǎn)生促炎作用。因此，β細(xì)胞特異性CAR Treg 細(xì)胞轉(zhuǎn)化為效應(yīng)T細(xì)胞可能會(huì)造成對(duì)β細(xì)胞的殺傷，并加速I型糖尿病進(jìn)展。

另在Treg 細(xì)胞分離時(shí)會(huì)出現(xiàn)效應(yīng)CAR T 細(xì)胞的污染。Treg細(xì)胞是一種罕見的細(xì)胞群，幾乎不可能達(dá)到100%的純度，分離時(shí)會(huì)帶來細(xì)胞穩(wěn)定性問題。為提高CAR Treg細(xì)胞穩(wěn)定性，選擇適宜共刺激因子結(jié)構(gòu)域是十分重要的，研究表明CD28信號(hào)對(duì)于Treg細(xì)胞維持、增殖和功能至關(guān)重要。

圖源：《Chimeric Antigen Receptor (CAR)Treg: A Promising Approach toInducing Immunological Tolerance》

3.  安全性

起始材料影響Treg細(xì)胞的純度，存在效應(yīng)T細(xì)胞污染可能會(huì)引起安全性問題。起始材料的應(yīng)選擇臍帶血而非成人外周血，因?yàn)槟殠а?strong>更容易分離Treg細(xì)胞，并維持Treg 細(xì)胞早期表型。

在患者無自體臍帶血時(shí)，第三方臍帶血是一種可行的、安全的替代方案，已在臨床試驗(yàn)中使用。在沒有合適的臍帶血細(xì)胞來源的情況下，成人PBMC也可分離幼稚的Treg 細(xì)胞。另外，自殺開關(guān)的設(shè)計(jì)能夠使CAR T 細(xì)胞發(fā)生可控的凋亡，如當(dāng) FOXP3 表達(dá)丟失或當(dāng) IL-17促炎細(xì)胞因子表達(dá)時(shí)，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，可以減輕副作用。

4.  劑量和持久性

劑量關(guān)系到細(xì)胞藥物的安全性和有效性。CAR T細(xì)胞是一種“活的”藥物，半衰期難以確定。對(duì)最佳劑量的確定十分復(fù)雜且依賴于疾病，如用于GVHD治療中，若患者體內(nèi)存在大量抗原可需要相對(duì)較小劑量的 CAR Treg 細(xì)胞。Treg 細(xì)胞本身是一種占比較小的細(xì)胞群，可能需要高效的培養(yǎng)系統(tǒng)才能達(dá)到 CAR Treg 細(xì)胞的目標(biāo)劑量。目前CAR-T 細(xì)胞持久性的研究大部分來自于外周血而非組織。當(dāng)靶抗原有限時(shí)，效應(yīng)CAR-T 細(xì)胞可能無法做出反應(yīng)。相比之下，CAR Treg 細(xì)胞能夠產(chǎn)生響應(yīng)，保護(hù)正常細(xì)胞不被清除，持久性可能優(yōu)于效應(yīng)CAR-T 細(xì)胞。

圖源：《Human Tregs Made Antigen Specific by Gene Modification: The Power to Treat Autoimmunity and Antidrug Antibodies with Precision》

總結(jié)

在動(dòng)物模型中，CAR 技術(shù)用于治療自身免疫性疾病和器官移植免疫排斥反應(yīng)顯示出前景。然而，在研究劑量之前需確定CAR的最佳胞外結(jié)合域和胞內(nèi)信號(hào)域，以提高安全性、有效性和持久性。由于Treg細(xì)胞和效應(yīng)T細(xì)胞之間差異以及疾病特異性要求，在開發(fā) CAR Treg 細(xì)胞的主要治療產(chǎn)品方面仍有許多工作要做。

圖源 : 《Human Tregs Made Antigen Specific by Gene Modification: The Power to Treat Autoimmunity and Antidrug Antibodies with Precision》

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