▉  導讀

近年來，CAR技術高速發(fā)展，在血液腫瘤治療方面取得了突破性成功，多款CAR-T藥物獲批上市。CAR技術遠不止于腫瘤治療，在感染性疾病治療及自身免疫疾病中也有著新的發(fā)展。

圖源：《 regulatory  T cells  (Treg ) and their  roles in immu ne  system  with respect to  imm unopath olo gical  dis o rders》

T細胞在控制癌癥、傳染病和自身免疫疾病發(fā)揮著關鍵作用，其中主要兩大類T細胞協(xié)同工作，維持免疫穩(wěn)態(tài)。第一個亞群是效應T細胞，能夠消除病原體和腫瘤，雖然效應T細胞反應通常是有效的，但一部分傳染病和腫瘤已經(jīng)進化出各種各樣的逃逸機制來繞過T細胞控制；第二個亞群是調節(jié)性T細胞(Treg)，調節(jié)自身免疫反應，在自身免疫疾病中也存在一定局限。

圖源：https://www.creative-biolabs.com/blog/index.php/is-bio-distribution-study-necessary-for-car-t-therapy/

嵌合抗原受體 (CAR) 技術已成為重編程T細胞一種有前途的技術，以克服天然T 細胞的不足。CAR這一概念最早出現(xiàn)于1990年代，科學家發(fā)現(xiàn)T細胞經(jīng)嵌合抗原受體及CD3胞內激活信號域修飾后，可使T細胞可直接特異性識別細胞表面抗原發(fā)揮作用。CAR技術直接改變了T細胞識別抗原的方式，繞過了MHC限制性，具有高特異性，避免了T細胞免疫逃逸。

此文獻探討利用CAR技術治療HIV以及自身免疫和移植排斥疾病機遇與挑戰(zhàn)。

▉CAR-T細胞清除HIV

HIV感染人體后引發(fā)抗病毒免疫，但免疫系統(tǒng)無法完全清除被感染的細胞，且被感染細胞會下調抗原表達來逃避免疫監(jiān)視，一部分潛伏細胞休眠數(shù)年，機會性產(chǎn)生病毒，需終生進行抗病毒治療。早期抗病毒治療雖能減少病毒載量但不能完全清除HIV病毒。一些因素如病毒逃逸、T細胞功能紊亂、免疫細胞耗竭影響HIV病毒的清除。

CAR-T治療HIV（圖源：https://doi.org/10.3389/fimmu.2020.00361）

目前抗逆轉錄病毒治療(anti-retroviral therapy, ART)可有效控制HIV感染，但無法完全清除體內HIV病毒。

CTL細胞 (細胞毒性T細胞)是機體應對病毒感染的主力軍，但CTL細胞抗原識別具MHC限制性，CAR修飾CTL細胞能夠避免CTL細胞局限性（詳見下表），可有效控制感染，并防止?jié)摲《驹偌せ睢?br>

靶向HIV的CART細胞歷經(jīng)幾代發(fā)展逐步成形。

1995-2005年一代CAR結構的靶向CD4-CART細胞證明了細胞治療HIV的安全性和可行性，但一代CAR結構中僅包含一個共刺激因子結構域，作用有限，未能持久地減少血液和組織內的病毒負荷。

隨著二代CAR結構的更新，胞內信號域含2個共刺激因子結構域4-1BB+CD3或CD28+CD3，提升T細胞的功能。較一代，基于4-1BB+CD3二代 CD4-CAR-T細胞(下圖 a)體外抗病毒效果提升了50倍，小鼠感染模型中能夠顯著降低病毒負荷。靶向HIV的二代CAR結構的CAR-T細胞，其抗原識別區(qū)域為靶向Env蛋白保守位點的scFv，包括CD4結合位點、gp41、多聚糖，為廣譜中和抗體（下圖 b）。盡管scFv-CART在體外可發(fā)揮較強的抗病毒作用應用于臨床也存在一些挑戰(zhàn)，需克服HIV逃逸及持久性差的困難。

CD4-CART細胞治療HIV示意圖

此外，Bi-CAR雙特異性CAR設計是將CD4與bNab中的scFv或人C型凝集素識別域（CRD）融合，CD4片段與Env蛋白的gp120亞基結合，CRD結合Env蛋白中的糖基部分，但CRD與可正常細胞結合引起副作用。（上圖 c和 上圖 d）

圖源：《Application of CAR-T Cell Therapy beyond Oncology:Autoimmune Diseases and Viral Infections》

維持CAR-T細胞體內持久性的策略

1. 多次輸注  持久性與CAR-T功能的發(fā)揮有著重要的關聯(lián)，CD19-CAR-T抗腫瘤的研究中，B細胞腫瘤抗原負荷能夠影響CAR T細胞的增殖和持久性，而在HIV感染中，接受cART抗逆轉錄病毒治療的個體抗原負荷影響有限。維持CAR-T細胞的持久性需多次輸注 HIV 特異性 CAR T 細胞，維持足夠數(shù)量以應對反彈。     2. 加強免疫治療  抗病毒疫苗加強免疫以維持足夠多的抗原特異性的記憶細胞。此策略也可應用于CAR-T抗病毒研究中，表達病毒抗原的CART細胞通過TCR信號途徑刺激HIV特異性CAR-T細胞，治愈HIV還需要CART細胞能夠在低抗原負荷中持久生存。     3. HSPC來源CART細胞  造血干細胞(hematopoietic stem and progenitor cells, HSPC)具有自我更新能力，可實現(xiàn)持久性。造血干細胞來源的T細胞可能會克服外周血來源的細胞在較低抗原負荷環(huán)境中的持續(xù)性差的問題。HPSC來源的一代CART細胞可以穩(wěn)定生存近2年,且能避免產(chǎn)生CAR與TCR交叉反應的問題。  

圖源：《Gene therapy targeting haematopoietic stem cells for inherited diseases: progress and challenges》

CAR-T治療HIV也存在諸多挑戰(zhàn)：

1.抗性

CAR-T細胞也會受到HIV病毒感染，保護CAR-T細胞免受HIV感染是至關重要的。CCR5是病毒進入機體的重要分子，科學家將靶向CCR5的shRNA基因整合到CAR-T 細胞中，shRNA下調CCR5表達防止病毒感染CART細胞。此外，研究者采用鋅指核酸酶編輯、定點 megaTAL 核酸酶等基因編輯技術修飾CCR5阻止HIV病毒進入機體。

研究者認為攜帶完整HIV病毒的CD4+T細胞是CART治療后復發(fā)的原因，此細胞下調Nef表達逃避CTL殺傷。CTL細胞識別病毒需要MHC分子，而CAR-T細胞非MHC限制性，可識別完整的HIV病毒，裂解含HIV前病毒的CD4+T細胞。采用延遲逆轉劑LRA破壞病毒潛伏狀態(tài)，潛伏病毒可以被激活并被免疫細胞殺死，但逆轉劑并不能減小潛伏病毒數(shù)量。

HIV在B淋巴濾泡中發(fā)生免疫逃逸，表現(xiàn)為HIV特異性CTL細胞在淋巴組織中毒性降低，低表達穿孔素和顆粒酶，不能清除被感染的CD4+Tfh細胞。CART通過表達CCR5進入B淋巴濾泡中，清除病毒感染細胞，采用基因編輯修飾CART細胞可將CART細胞帶入被感染組織位點。

CART在B淋巴濾泡中的作用

2. 毒性

由于HIV的Env蛋白非自身抗原，可實現(xiàn)HIV特異性靶向，毒性較小但臨床上的毒性未見有報道。

3. 細胞因子風暴 

腫瘤研究中，高抗原負荷產(chǎn)生的細胞因子風暴比較嚴重。而對于HIV治療中，初期抗原負荷低，出現(xiàn)細胞因子風暴可能性??；但當CART細胞不能控制HIV時，可能會出現(xiàn)細胞因子風暴，通常采用IL-6或者cART終止不良反應。

4. 高成本是腫瘤和HIV治療中的共同重要問題。

總結

二代CAR-T細胞在應用于小鼠和非靈長類HIV感染模型中是安全有效的。但是，成功的CAR-T細胞治療需長期持久并能夠清除潛在的HIV病毒。目前來看增強CAR-T在較低抗原負荷中持久性及增強CAR-T耐受HIV感染還任重而道遠。  ▉ CAR-T用于自身免疫疾病T細胞維持機體穩(wěn)態(tài)（圖源：https://doi.org/ 10.1016/j.molmet.2013.12.005）

自身免疫疾病治療常會產(chǎn)生副作用。CAR-T作為一種突破性療法，可直接殺死自身病理性的免疫細胞。Treg細胞在調節(jié)自身免疫性疾病起著重要作用。CAR分子可以引導Treg細胞到達免疫環(huán)境中，發(fā)揮特異性的免疫抑制功能。

圖源: 《Prospects of the Use of Cell Therapy to Induce Immune Tolerance》

CAR Treg 細胞自身免疫疾病中的試驗

CAARS（Chimeric autoantibody receptors）嵌合自身抗體可使CAART細胞靶向破壞自身免疫B細胞，當自身免疫B細胞上的BCR受體遇到CAART細胞時，可被破壞無法產(chǎn)生抗體。

在尋常皰疹小鼠模型中，由于自身免疫B細胞靶向自身的desmogleins蛋白，導致皮膚粘膜發(fā)生皰疹，傳統(tǒng)上用皮質類固醇和其他免疫抑制劑進行治療減少全身性免疫反應。CART突破性療法通過表達desmoglein3二代CAAR（4–1BB–CD3ζ胞內信號域）T細胞，與BCR相互作用，誘導自身免疫的B細胞裂解發(fā)揮作用，以此思路類推，CAART細胞可應用于其他B細胞相關的自身免疫疾病中，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風濕關節(jié)炎。

另一項標志性研究，在小鼠模型中靶向TNBS的CAR Treg細胞可用于治療TNBS引起的結腸炎，體內可檢測到CAR T reg細胞，能夠以抗原特異性增殖，可運輸?shù)桨衅鞴俨?strong>在靶器官中增殖，結果顯示CAR T reg細胞可預防或改善小鼠結腸炎。  圖源：《Application of CAR-T Cell Therapy beyond Oncology:Autoimmune Diseases and Viral Infections》

CAR Treg 細胞在器官移植中應用：

識別 HLA 分子（human leukocyte antigen, 人類白細胞抗原）的嵌合抗原受體 (CAR) 的調節(jié)性 T (Treg) 細胞為自身免疫提供了理想的方案（見下圖）。HLA因其表達量高且僅在移植器官上表達，是理想治療靶點。此外，靶向HLA的CAR Treg 細胞不會對移植細胞的功能產(chǎn)生影響。

HLA-A2 特異性 CAR Treg 細胞已被用于預防免疫缺陷小鼠的移植物抗宿主病 (GVHD)和皮膚移植排斥反應，體外FOXP3表達水平正常，具有良好擴增能力，細胞毒性小。重要的是，猿猴和人類 MHC 分子高度保守，可在靈長類動物上直接HLA特異性CAR評估器官移植可能性，易于動物模型的評價。

CAR-Treg治療GVHD

CAR-T治療自身免疫疾病中也存在諸多挑戰(zhàn)：

1. 靶標選擇

與腫瘤靶標選擇類似，自身免疫靶標也需要在細胞表面高表達且具有組織特異性。腫瘤治療中靶外毒性的副作用是非常嚴重的，而自身免疫疾病治療中，CAR Treg 細胞組織外產(chǎn)生副作用小。然而，在某些CAR可觀察到較強的信號會使CAR Treg 細胞產(chǎn)生組成型抑制活性；

另一問題，CAR Treg細胞可能會優(yōu)先歸巢到組織外，可能會限制特異性CAR Treg細胞療法。此外，Treg 細胞在其他健康組織中的積累可能會有利于腫瘤形成或病原體存活，這一問題目前尚未得到解決。

2.  細胞穩(wěn)定性

理論上，若效應CAR-T細胞轉化為 Treg 細胞可能會加速疾病進展，但目前在癌癥試驗中尚未觀察到。相比之下，若CAR Treg細胞轉化為效應T 細胞有可能加劇疾病進展，可能會引起重大的安全問題。小鼠模型研究表明，當Treg 細胞暴露于炎癥環(huán)境，細胞會下調FOXP3 的表達并產(chǎn)生促炎作用。因此，β細胞特異性CAR Treg 細胞轉化為效應T細胞可能會造成對β細胞的殺傷，并加速I型糖尿病進展。

另在Treg 細胞分離時會出現(xiàn)效應CAR T 細胞的污染。Treg細胞是一種罕見的細胞群，幾乎不可能達到100%的純度，分離時會帶來細胞穩(wěn)定性問題。為提高CAR Treg細胞穩(wěn)定性，選擇適宜共刺激因子結構域是十分重要的，研究表明CD28信號對于Treg細胞維持、增殖和功能至關重要。

圖源：《Chimeric Antigen Receptor (CAR)Treg: A Promising Approach toInducing Immunological Tolerance》

3.  安全性

起始材料影響Treg細胞的純度，存在效應T細胞污染可能會引起安全性問題。起始材料的應選擇臍帶血而非成人外周血，因為臍帶血更容易分離Treg細胞，并維持Treg 細胞早期表型。

在患者無自體臍帶血時，第三方臍帶血是一種可行的、安全的替代方案，已在臨床試驗中使用。在沒有合適的臍帶血細胞來源的情況下，成人PBMC也可分離幼稚的Treg 細胞。另外，自殺開關的設計能夠使CAR T 細胞發(fā)生可控的凋亡，如當 FOXP3 表達丟失或當 IL-17促炎細胞因子表達時，誘導細胞死亡，可以減輕副作用。

4.  劑量和持久性

劑量關系到細胞藥物的安全性和有效性。CAR T細胞是一種“活的”藥物，半衰期難以確定。對最佳劑量的確定十分復雜且依賴于疾病，如用于GVHD治療中，若患者體內存在大量抗原可需要相對較小劑量的 CAR Treg 細胞。Treg 細胞本身是一種占比較小的細胞群，可能需要高效的培養(yǎng)系統(tǒng)才能達到 CAR Treg 細胞的目標劑量。目前CAR-T 細胞持久性的研究大部分來自于外周血而非組織。當靶抗原有限時，效應CAR-T 細胞可能無法做出反應。相比之下，CAR Treg 細胞能夠產(chǎn)生響應，保護正常細胞不被清除，持久性可能優(yōu)于效應CAR-T 細胞。

圖源：《Human Tregs Made Antigen Specific by Gene Modification: The Power to Treat Autoimmunity and Antidrug Antibodies with Precision》

總結

在動物模型中，CAR 技術用于治療自身免疫性疾病和器官移植免疫排斥反應顯示出前景。然而，在研究劑量之前需確定CAR的最佳胞外結合域和胞內信號域，以提高安全性、有效性和持久性。由于Treg細胞和效應T細胞之間差異以及疾病特異性要求，在開發(fā) CAR Treg 細胞的主要治療產(chǎn)品方面仍有許多工作要做。

圖源 : 《Human Tregs Made Antigen Specific by Gene Modification: The Power to Treat Autoimmunity and Antidrug Antibodies with Precision》

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