?；o酶 A 合成酶長鏈家族成員 4（ACSL4）是多不飽和脂肪酸（PUFA）代謝中的重要同工酶。ACSL4 在脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)炎癥中的作用，以及 ACSL4 介導(dǎo)的炎癥對帕金森?。≒D）進(jìn)展的影響尚不清楚。來自青島大學(xué)神經(jīng)再生與神經(jīng)康復(fù)研究所的研究者們對此展開研究，發(fā)現(xiàn) LPS 刺激后 ACSL4 表達(dá)增加，敲低小膠質(zhì)細(xì)胞中的 ACSL4 可減少促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，ACSL4 減少退化樣家族成員 4（VGLL4）的表達(dá)，與促進(jìn) NF-κB 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)控脂代謝有關(guān)，且敲低ACSL4可減輕LPS模型和MPTP模型中的神經(jīng)炎癥。該研究結(jié)果發(fā)表在2023年3月Brain Behavior and Immunity雜志上。

小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的常駐免疫細(xì)胞，其介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥在多種生理和病理狀況中發(fā)揮重要作用。神經(jīng)元損傷后，小膠質(zhì)細(xì)胞成為啟動(dòng)炎癥反應(yīng)的快速反應(yīng)者，當(dāng)刺激減輕時(shí)，炎癥反應(yīng)會(huì)造成進(jìn)一步的損害。帕金森病是一種神經(jīng)退行性疾病，其特征是黑質(zhì)致密部（SNc）中多巴胺能（DA）神經(jīng)元的退化或丟失。多項(xiàng)研究表明，TNF、IL-1β 和IL-6 等炎癥介質(zhì)在調(diào)節(jié)PD中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

ACSL構(gòu)成一個(gè)酶家族，通過將游離的長鏈脂肪酸轉(zhuǎn)化為其?；o酶 A（CoA）形式，在脂質(zhì)代謝中發(fā)揮重要作用。作為ACSL家族的一員，ACSL4優(yōu)先結(jié)合其底物花生四烯酸，通過摻入游離脂肪酸促進(jìn)磷脂的重塑。由于其對脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)，ACSL4已被確定為鐵死亡的調(diào)節(jié)劑，此外，骨髓細(xì)胞特異性 ACSL4 缺陷通過重塑磷脂，減少花生四烯酸衍生的促炎脂質(zhì)介質(zhì)從而緩解炎癥。

VGLL4是VGLL家族中的一個(gè)轉(zhuǎn)錄輔助因子，通過與TEA結(jié)構(gòu)域（TEAD）轉(zhuǎn)錄因子相互作用來發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。阻斷VGLL4表達(dá)可減弱 LPS 誘導(dǎo)的焦慮樣行為并減少小鼠的神經(jīng)炎癥。此外，VGLL4可調(diào)節(jié)肌肉再生和心臟發(fā)育，然而其在神經(jīng)炎癥中的作用仍不清楚。

1、LPS刺激后ACSL4在小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)增加

研究者檢測了LPS刺激后小膠質(zhì)細(xì)胞中ACSL4的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)ACSL4在LPS刺激2h后RNA水平和蛋白水平顯著升高，且與小膠質(zhì)細(xì)胞的靶標(biāo)Iba-1共標(biāo)可觀察到ACSL4在LPS刺激后表達(dá)升高（圖1）。

圖1 LPS刺激后ACSL4在小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)增加

2、敲低ACSL4降低LPS誘導(dǎo)的炎性因子的產(chǎn)生

研究中使用靶向ACSL4的特異性si-RNA轉(zhuǎn)染BV2細(xì)胞、小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞后，檢測LPS處理后炎性因子表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)敲低ACSL4后LPS誘導(dǎo)的炎性因子產(chǎn)生減少（圖2）。

圖2 敲低ACSL4降低LPS誘導(dǎo)的炎性因子的產(chǎn)生

3、敲低ACSL4抑制了NF-κB 信號的激活

研究者檢測了TLR4通路關(guān)鍵下游信號分子水平，發(fā)現(xiàn)敲低ACSL4后，NF-κB P65磷酸化水平顯著降低，而其他信號分子磷酸化水平無改變。由于ACSL4已被確定參與調(diào)節(jié)鐵死亡，作者通過流式細(xì)胞術(shù)及qPCR檢測RSL3（鐵死亡誘導(dǎo)劑）刺激敲低ACSL4后的小膠質(zhì)細(xì)胞中炎性因子表達(dá)情況。結(jié)果表明，RSL3處理未能增加炎性因子表達(dá)，提示ACSL4調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)炎癥并不依賴于鐵死亡（圖3）。

圖3 敲低ACSL4抑制了NF-κB 信號的激活

4、ACSL4 通過增強(qiáng)VGLL4表達(dá)來調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生

作者通過RNA-seq并結(jié)合KEGG通路分析，進(jìn)一步確定ACSL4調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥的潛在分子機(jī)制。與炎癥反應(yīng)相關(guān)的通路包括 NF-kappa B 信號通路、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、TNF信號通路、病毒蛋白與細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體的相互作用、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用和Toll樣受體信號通路發(fā)生顯著變化。通過GO富集分析，作者發(fā)現(xiàn)在炎癥反應(yīng)，對細(xì)菌、LPS、IFN-β的細(xì)胞反應(yīng)以及免疫系統(tǒng)過程相關(guān)通路發(fā)生改變（圖4）。通過以上分析，一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子 VGLL4 引起了作者的注意。

圖4 ACSL4 相關(guān)KEGG通路分析

研究者進(jìn)一步驗(yàn)證了在敲低ACSL4的小膠質(zhì)細(xì)胞中VGLL4的表達(dá)，結(jié)果表明VGLL4表達(dá)升高。使用靶向VGLL4的siRNA 轉(zhuǎn)染BV2小膠質(zhì)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)與siNC轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，抑制VGLL4顯著增加LPS刺激后TNFα、IL-6和 IL-1β的產(chǎn)生。

為進(jìn)一步確定ACSL4是否通過降低VGLL4表達(dá)來促進(jìn)炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，同時(shí)使用靶向ACSL4和VGLL4的特異性siRNA轉(zhuǎn)染BV2細(xì)胞，檢測LPS誘導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在抑制VGLL4后，在ACSL4敲低的小膠質(zhì)細(xì)胞中，炎性細(xì)胞因子的表達(dá)減少得到了很大程度的恢復(fù)（圖5）。

圖5 ACSL4 通過增強(qiáng)VGLL4表達(dá)來調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生

5、敲低ACSL4改變LPS刺激后細(xì)胞中的脂質(zhì)成分

由于ACSL4已被證明參與調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝從而促進(jìn)炎性因子產(chǎn)生，研究者通過非靶向代謝組學(xué)檢測了敲低ACSL4后LPS處理BV2細(xì)胞后的脂質(zhì)代謝情況。結(jié)果表明，多種磷脂、鞘脂和脂肪酸在ACSL4敲低后顯著降低，表明ACSL4可能通過調(diào)節(jié)BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞中的脂質(zhì)組成來調(diào)節(jié)炎癥過程（圖6）。

圖6 敲低ACSL4改變LPS刺激后細(xì)胞中的脂質(zhì)成分

6、ACSL4敲低減弱 LPS 誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥

研究者進(jìn)一步將慢病毒特異性注射到小鼠的黑質(zhì)區(qū)域以敲低ACSL4，并在慢病毒注射兩周后給予單劑量LPS評估炎癥反應(yīng)。免疫熒光結(jié)果表明，與對照組相比，ACSL4 shRNA組中LPS誘導(dǎo)的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞活化顯著降低，表現(xiàn)為神經(jīng)元有更長的分支長度、更多的分支點(diǎn)數(shù)和更少的反應(yīng)性表型，且ACSL4敲低減弱了LPS誘導(dǎo)的炎性分子的產(chǎn)生（圖7）。

圖7 ACSL4敲低減弱 LPS 誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥

7、ACSL4敲低減弱MPTP誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥

小膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥與PD進(jìn)展有關(guān)。研究者通過MPTP構(gòu)建PD模型，并檢測ACSL4敲低后對PD的影響。結(jié)果表明，MPTP刺激敲低ACSL4后小鼠的小膠質(zhì)細(xì)胞，其活化顯著降低且DA神經(jīng)元損傷顯著減少，且MPTP誘導(dǎo)的自發(fā)活動(dòng)惡化情況顯著改善。通過qPCR檢測，敲低小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞中ACSL4后，MPTP誘導(dǎo)的炎性因子產(chǎn)生顯著降低（圖8）。

圖8 ACSL4敲低減弱MPTP誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥

醉翁之藝點(diǎn)評

代謝相關(guān)酶在神經(jīng)炎癥的調(diào)節(jié)中起著重要作用，ACSL4作為一種參與脂質(zhì)代謝的酶，其在小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥中的作用尚不清楚。本研究中，發(fā)現(xiàn) LPS 刺激后ACSL4表達(dá)上調(diào)，敲低ACSL4通過抑制NF-κB活化來降低促炎細(xì)胞因子的表達(dá)。有趣的是，ACSL4以不依賴鐵死亡的方式調(diào)節(jié)炎癥，并通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄輔因子VGLL4的表達(dá)和降低脂質(zhì)代謝率來促進(jìn)細(xì)胞因子的產(chǎn)生。此外，敲低ACSL4減輕了體內(nèi)神經(jīng)炎癥，并降低了MPTP模型中的神經(jīng)元死亡率。研究者揭示了ACSL4通過調(diào)節(jié)VGLL4表達(dá)和脂質(zhì)代謝促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥的新作用，在未來的研究中，針對ACSL4表達(dá)的干預(yù)可能是帕金森病或其他神經(jīng)炎癥相關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的潛在治療方法。

編譯：許沐秋 

審校：呂卓辰

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