文章標(biāo)題：Integrated Proteomics and Metabolomics Analysis of Nitrogen System Regulation on Soybean Plant Nodulation and Nitrogen Fixation

發(fā)表期刊：INTERNATIONAL JOURNAL OF MOLECULAR SCIENCES

發(fā)表時(shí)間：2022.2

影響因子：5.923

合作客戶：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院

百趣生物提供服務(wù)：蛋白質(zhì)組學(xué)分析和代謝組學(xué)分析

1、研究背景

大豆產(chǎn)量取決于根瘤固氮和氮施肥的綜合作用，而大豆根系暴露于高濃度氮條件下，可抑制根瘤生長(zhǎng)，加速根瘤衰老，降低固氮的效率。氮影響豆科作物結(jié)瘤和固氮的具體機(jī)制尚不清楚。為研究大豆中氮、結(jié)瘤與固氮的關(guān)系，采用嫁接法制備了單側(cè)結(jié)瘤的雙根大豆植株。在第3個(gè)三葉(V3)至第4個(gè)三葉(V4)生長(zhǎng)期(5天)，向非結(jié)瘤側(cè)添加氮營(yíng)養(yǎng)液，在結(jié)瘤側(cè)添加無(wú)氮營(yíng)養(yǎng)液。百趣解讀，本實(shí)驗(yàn)旨在研究外源氮對(duì)大豆根瘤中蛋白質(zhì)和代謝物的影響，為分析大豆根瘤中施氮與固氮相互作用的生理機(jī)制。

2、研究結(jié)果

在V3期前，在大豆幼苗兩側(cè)加入氮素濃度為25mg/L(硝酸銨濃度為71.4mg/L)的營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。從V3期到V4期(為期5天)，將幼苗分為有氮處理或無(wú)氮處理的兩組。氮處理組在未結(jié)瘤根中加入氮濃度為100mg/L(硝酸銨濃度為285.6mg/L)的營(yíng)養(yǎng)液，在結(jié)瘤根中加入無(wú)氮營(yíng)養(yǎng)液，記錄為NH。在無(wú)氮組的兩側(cè)加入無(wú)氮營(yíng)養(yǎng)液，記錄為NF

氮供應(yīng)對(duì)結(jié)節(jié)生長(zhǎng)和固氮酶活性的影響

百趣解讀，通過(guò)對(duì)不同處理NH和NF向未結(jié)瘤的側(cè)根供氮5天后，了解在結(jié)瘤的側(cè)根上的根瘤數(shù)量和重量，5天供氮對(duì)根瘤的生長(zhǎng)發(fā)育無(wú)顯著影響(表1)。圖1顯示了氮供應(yīng)對(duì)雙根大豆根瘤中固氮酶活性的影響。向非結(jié)瘤側(cè)根供氮后，與NF處理相比，NH處理其結(jié)瘤側(cè)的特定固氮酶活性(SNA)和乙炔還原活性(ARA)分別降低了44.0%和41.0%，說(shuō)明向非結(jié)瘤側(cè)根供氮5天對(duì)結(jié)瘤側(cè)根瘤的ARA和SNA有顯著影響。

表1. 雙根大豆根瘤數(shù)和干重的變化

圖1. 大豆雙根根瘤的固氮酶活性研究

大豆結(jié)節(jié)的蛋白質(zhì)組學(xué)分析

通過(guò)分析了氮供應(yīng)處理和對(duì)照之間的蛋白質(zhì)組學(xué)變化，共鑒定出8573個(gè)蛋白，其中5279個(gè)蛋白屬于甘氨酸（大豆），3294個(gè)蛋白屬于日本慢生根瘤菌。按照治療組間的差異表達(dá)蛋白(DEPs)采用FC>1.2或FC<0.83，p值<0.05為標(biāo)準(zhǔn)，共鑒定出164個(gè)DEPs。

百趣解讀，利用GO數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行注釋，研究了上述DEPs的功能。根據(jù)功能特征，DEPs屬于與細(xì)胞組分(CC)、分子功能(MF)和生物過(guò)程(BP)相關(guān)的三組。CC組大豆根瘤組織的DEPs多富集于淀粉質(zhì)體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、內(nèi)膜系統(tǒng)、膜蛋白復(fù)合物等中。MF組中的DEPs主要富含糖原（淀粉）合酶活性、輔助因子結(jié)合、血紅素結(jié)合、四吡咯結(jié)合成分等。BP組主要富含淀粉生物合成過(guò)程、蛋白質(zhì)退出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、淀粉代謝過(guò)程等（圖2）。這些結(jié)果表明，氮處理可以調(diào)節(jié)大豆根瘤組織的碳代謝和氮代謝，從而影響大豆根瘤的固氮能力。

百趣生物解讀，CC組大豆根瘤菌的DEPs多富集于細(xì)胞質(zhì)、非膜結(jié)合細(xì)胞器、含蛋白復(fù)合物等中。MF組的DEPs主要富集于固氮酶活性、氧化還原酶活性等。BP組主要富集于固氮、氮循環(huán)代謝過(guò)程、有機(jī)氮化合物生物合成過(guò)程、細(xì)胞氮化合物代謝過(guò)程等（圖3）。結(jié)果表明大豆根瘤菌與根瘤組織的結(jié)果相同，根瘤菌中大部分差異蛋白在氮和碳代謝過(guò)程中富集。 

圖2. 大豆結(jié)節(jié)組織中差異表達(dá)蛋白（DEPs）的GO注釋統(tǒng)計(jì)

圖3. 大豆根瘤菌中差異表達(dá)蛋白（DEPs）的GO注釋統(tǒng)計(jì)

利用(KEGG)通路分析，探索所鑒定的DEPs可能參與的代謝或信號(hào)通路。如圖4所示，大豆根瘤組織中的DEPs主要參與纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成、葉酸、倍半萜和三萜生物合成、C5-支二酸代謝和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工。如圖5所示，大豆根瘤菌中的DEPs主要參與碳代謝、氮代謝、光合生物中的固碳作用、葉酸生物合成、果糖和甘露糖代謝、核糖體等方面。

圖4. 大豆根瘤組織中DEPs的KEGG通路

圖5. 大豆根瘤菌中DEPs的KEGG通路

大豆結(jié)節(jié)的代謝組學(xué)分析

百趣解讀，通過(guò)分析氮供應(yīng)處理和對(duì)照之間的代謝組學(xué)方法測(cè)定大豆根瘤代謝譜的變化。治療組間的差異表達(dá)代謝物(DEMs)采用VIP>1，p值<0.05為標(biāo)準(zhǔn)，共鑒定出56種差異表達(dá)代謝物(DEMs)，其中上調(diào)20個(gè)，下調(diào)36個(gè)。利用代謝組學(xué)(KEGG)通路分析，探索富含差異代謝物的代謝組學(xué)代謝途徑。DEMs主要富集于代謝途徑、次生代謝產(chǎn)物的生物合成、氨基酸生物合成、磷酸戊糖途徑、碳代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、精氨酸生物合成、精氨酸和脯氨酸代謝等方面。

圖6. 差異代謝物富含的KEGG通路分析

結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)分析治療組之間的DEPS和DEMs進(jìn)行綜合KEGG途徑分析

百趣解讀，大豆根瘤組織中的KEGG途徑如圖7所示，這些途徑包括代謝組學(xué)代謝途徑、次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工、碳代謝、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體、核糖體、氨基酸生物合成、乙醛酸和二羧酸代謝等。大豆根瘤菌中的KEGG途徑如圖8所示，代謝途徑包括次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成、異種抗生素的生物合成、葉酸生物合成等。

根瘤中的碳代謝是固氮的主要能量來(lái)源，蔗糖可通過(guò)淀粉合酶(StS)轉(zhuǎn)化為淀粉儲(chǔ)存，并通過(guò)蔗糖合酶(SS)催化轉(zhuǎn)化為UDP-葡萄糖和果糖為根瘤內(nèi)固氮提供能量。氮的供應(yīng)降低了精氨酸的濃度，而增加腐胺和ODC(A0A0A3Z5A3)的表達(dá)，研究表明腐胺、一氧化氮(NO)和天冬酰胺是調(diào)節(jié)根瘤固氮的信號(hào)分子(圖9)。在本研究中，通過(guò)比較治療間大豆，氮調(diào)控淀粉和蔗糖代謝、有機(jī)酸代謝、硫代謝、氮代謝、氨基酸代謝等代謝途徑。

圖7. 大豆結(jié)節(jié)組織中同時(shí)涉及DEPs和DEMs的KEGG通路

圖8. 大豆根瘤菌中同時(shí)涉及DEPs和DEMs的KEGG通路

圖9. DEPs和DEMs與結(jié)節(jié)中氮調(diào)控途徑

3、結(jié)論

通過(guò)比較氮處理和不氮處理大豆，氮調(diào)控淀粉和蔗糖代謝、有機(jī)酸代謝、硫代謝、氮代謝、氨基酸代謝等代謝途徑。此外，外源氮促進(jìn)了根瘤中腐胺、一氧化氮和天冬酰胺的合成，抑制了蔗糖向蘋果酸的轉(zhuǎn)化；因此，根瘤菌缺乏固氮能量。此外，外源氮降低了根瘤細(xì)胞壁的合成，從而抑制了根瘤的生長(zhǎng)和固氮。

文/阿趣代謝組學(xué)

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