藥苑雜談 YAOYUANZATAN

注射劑是直接注射到人體器官、組織或血液的無菌產(chǎn)品，中國藥典規(guī)定注射劑中不得含有任何活的微生物，因此生產(chǎn)過程中的微生物控制至關(guān)重要。細(xì)菌內(nèi)毒素是微生物、主要是革蘭氏陰性菌釋放的復(fù)合物，除無菌這一重要控制項(xiàng)外，還應(yīng)對(duì)注射劑進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢測，合理控制細(xì)菌內(nèi)毒素水平對(duì)注射劑安全性有重要意義。

本文將對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素的產(chǎn)生、去除、檢測及最新研究內(nèi)容進(jìn)行講解。

一、細(xì)菌內(nèi)毒素的產(chǎn)生與危害

細(xì)菌內(nèi)毒素的本質(zhì)是磷脂多糖和蛋白質(zhì)復(fù)合物，主要存在于革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁中，在細(xì)菌死亡或處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)會(huì)大量釋放。由其引發(fā)的毒性反應(yīng)主要包括發(fā)熱反應(yīng)、白細(xì)胞反應(yīng)、內(nèi)毒素休克。

曾經(jīng)轟動(dòng)一時(shí)的青霉素導(dǎo)致患者死亡事件，使得公眾對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素的認(rèn)識(shí)更加深刻。

事情是這樣的，青霉素問世后，有研究者發(fā)現(xiàn)青霉素對(duì)流行性腦膜炎有非常顯著的療效，青霉素立即成為當(dāng)時(shí)流行性腦膜炎的首選藥物，按照一般規(guī)律，用藥劑量會(huì)隨著病人病情的嚴(yán)重情況做出調(diào)整，但是在大劑量使用青霉素時(shí)卻發(fā)生了患者用藥后休克然后死亡的狀況。原因是流行性腦膜炎的病原菌屬于革蘭氏陰性菌，青霉素一舉殲滅腦膜炎奈瑟菌的同時(shí)，細(xì)菌內(nèi)毒素因菌體死亡、包膜破裂而大量釋放，造成患者發(fā)生內(nèi)毒素休克，最終死亡。

細(xì)菌內(nèi)毒素具有廣泛的生物活性，極微量就可使人體產(chǎn)生發(fā)熱、過敏甚至休克反應(yīng)。由于細(xì)菌內(nèi)毒素引發(fā)的生理學(xué)反應(yīng)對(duì)人體健康危害嚴(yán)重，目前藥品、食品、醫(yī)療器械和臨床領(lǐng)域均對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素進(jìn)行嚴(yán)格控制。

二、細(xì)菌內(nèi)毒素去除方法

細(xì)菌內(nèi)毒素具有體積小、耐高溫的特點(diǎn)，通過普通的除菌過濾和濕熱滅菌難以清除，經(jīng)過常規(guī)生產(chǎn)條件后在人體自然條件下仍然保持活性，因此首先就要從生產(chǎn)源頭嚴(yán)格控制內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)。以藥品生產(chǎn)為例，相關(guān)制劑涉及的原料、輔料以及制劑成品中的內(nèi)毒素限度都有嚴(yán)格要求。

生產(chǎn)過程中針對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素的有效去除方法也在不斷發(fā)展，包括超濾法、酸堿法、干熱滅菌法、蒸餾法、離子交換法、凝膠過濾法、微波、反滲透和吸附法等等，這些方法在使用時(shí)有一定的局限性和優(yōu)缺點(diǎn)，目前醫(yī)藥領(lǐng)域最常使用的還是超濾法、酸堿法和干熱滅菌法。

即使是干熱滅菌也需要在250℃條件下滅菌至少30分鐘才可以去除熱原。由于細(xì)菌內(nèi)毒素疏水性較強(qiáng)，易于在容器、管道、組件和設(shè)備表面滋長，干熱滅菌主要用于設(shè)備、管道、醫(yī)療器械。使用稀氫氧化鈉溶液煮沸30分鐘以上，也可以對(duì)部分工器具、管道進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素去除。

對(duì)于注射劑、生物制劑或其他不耐高溫產(chǎn)品，優(yōu)先選用超濾法去除細(xì)菌內(nèi)毒素，超濾膜尺寸一般不超過0.1μm，可以有效去除細(xì)菌內(nèi)毒素，但操作過程注意壓力和溫度控制。

三、現(xiàn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢測方法

產(chǎn)品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值一般是通過公式L=K/M計(jì)算得到的。其中M為人用每千克體重每小時(shí)最大供試品劑量，可參考藥品說明書或具有權(quán)威性資料的用法用量。涉及聯(lián)合用藥應(yīng)考慮其他制劑可能引入的細(xì)菌內(nèi)毒素；兒科用藥、營養(yǎng)不良用藥和惡病質(zhì)用藥等，應(yīng)考慮細(xì)菌內(nèi)毒素對(duì)體弱患者人群可能導(dǎo)致更嚴(yán)重的影響。

注：K 為人每千克體重每小時(shí)最大可接受的內(nèi)毒素劑量，以 EU/ (kg * h)表示；細(xì)菌內(nèi)毒素的單位通常用EU表示，IU是細(xì)菌內(nèi)毒素的國際單位，1EU與1IU相當(dāng)。

關(guān)于細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查方法，藥典2020版《1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法》和《9251細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則》中都有詳細(xì)的指導(dǎo)，即利用鱟試劑來檢測或量化細(xì)菌內(nèi)毒素，以期通過檢測保證細(xì)菌內(nèi)毒素限度符合藥用質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

由于革蘭氏陰性菌內(nèi)毒素可以迅速導(dǎo)致鱟血液凝固成凝膠狀，因此采用鱟試劑法檢測內(nèi)毒素簡便快捷，同時(shí)具有較高的靈敏度和特異性，鱟試劑成為理想的內(nèi)毒素檢測試劑。

《1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法》主要介紹了凝膠法和光度法：

需要注意的是，如果樣品中含有β-葡聚糖，則要求使用去G因子的鱟試劑進(jìn)行樣品檢測。這是因?yàn)棣?葡聚糖會(huì)和鱟試劑發(fā)生凝集反應(yīng)，從而產(chǎn)生假陽性結(jié)果。

四、細(xì)菌內(nèi)毒素研究最新進(jìn)展

4.1細(xì)菌內(nèi)毒素檢測應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域

2023年河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院腫瘤科聯(lián)合臨床營養(yǎng)科對(duì)原發(fā)性肝癌放療患者血清中D-乳酸、細(xì)菌內(nèi)毒素、二胺氧化酶含量進(jìn)行檢測，研究發(fā)現(xiàn)在肝癌患者放療前、放療完成時(shí)和放療結(jié)束后一個(gè)月這三項(xiàng)指標(biāo)的含量有明顯差異，是評(píng)價(jià)腸粘膜損傷、腸道營養(yǎng)不良、惡性腫瘤患者術(shù)后炎癥及損傷恢復(fù)程度的可靠指標(biāo)。這就是說通過檢測血液中細(xì)菌內(nèi)毒素含量可以評(píng)價(jià)患者腸粘膜恢復(fù)情況，對(duì)于腸道營養(yǎng)不良和腸道菌群轉(zhuǎn)移均有指導(dǎo)意義。

4.2細(xì)菌內(nèi)毒素檢測新技術(shù)

電化學(xué)分析技術(shù)在各行各業(yè)均有應(yīng)用，電化學(xué)分析技術(shù)具有靈敏度高，操作簡便的優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)廣泛作為生物原件；核酸適體具有靶向性高、便于修飾的特點(diǎn)。浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院研究者將電化學(xué)技術(shù)和核酸適體相結(jié)合對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素進(jìn)行定量分析，大大彌補(bǔ)現(xiàn)有方法靈敏度低、操作復(fù)雜的問題。

除此以外，眾所周知，鱟試劑來源于鱟的血液，鱟大約在地球已經(jīng)生存了4億年，比恐龍出現(xiàn)的還要早，由于醫(yī)藥行業(yè)對(duì)鱟血液的大量采集，現(xiàn)在已列為國家二級(jí)保護(hù)動(dòng)物，鱟血價(jià)格增長迅猛。核酸適體電化學(xué)分析技術(shù)研究如果能進(jìn)行更深入的研究，代替鱟血的使用，在后期廣泛用于細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測，對(duì)于細(xì)菌內(nèi)毒素檢測將是一個(gè)很大的進(jìn)步。那么被譽(yù)為“活化石”的鱟也將在地球上有更自由的生長空間。

往期回顧 Past Review

?【受理日?qǐng)?bào)2024.4.17】CDE受理；卡貝縮宮素注射液點(diǎn)評(píng)

?【醫(yī)藥.Market】近百年端?？顾パ芯?，是永葆青春的秘密？

?【受理日?qǐng)?bào)2024.4.16】CDE受理；培哚普利氨氯地平片（I）點(diǎn)評(píng)

?【受理日?qǐng)?bào)2024.4.15】CDE受理；他氟前列素滴眼液點(diǎn)評(píng)