本發(fā)明涉及動物飼料
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種混合菌株發(fā)酵制備茶渣飼料的方法。
背景技術(shù)：
：我國是產(chǎn)茶大國，2018年干毛茶葉產(chǎn)量超過260萬噸，其中綠茶類占比超過65％，是全球綠茶的主要生產(chǎn)國，總產(chǎn)量超過全球綠茶總產(chǎn)量的75％。綠茶作為傳統(tǒng)飲料，其可食部分僅占茶葉的一小部分，目前伴隨著茶葉產(chǎn)業(yè)鏈的延伸，更多的干茶葉進(jìn)入茶葉深加工企業(yè)，通過高溫水提制備速溶茶粉及茶濃縮液，而目前的茶葉深加工后的干物質(zhì)總量也僅為茶葉干重的3％左右，有效成分含量也僅提取不到40％。茶葉加工后產(chǎn)生茶葉原料量近三倍的濕茶渣，其中含有超過60％的茶營養(yǎng)成分，包含有大量的蛋白、脂肪、纖維以及茶多酚等。研究表明，綠茶渣中含有17-19％的粗蛋白，16-18％的粗纖維，1-2％的茶多酚，0.1-0.3％的咖啡堿，不僅如此，其蛋白氨基酸組成豐富，氨基酸比值系數(shù)分達(dá)到57.51-68.01，較常規(guī)飼用玉米及麩皮要好，與魚粉接近，兼具營養(yǎng)與功能，具有非常高的利用與開發(fā)價(jià)值。目前，茶渣利用仍以低值化的燃料、肥料、飼料或吸附材料為主，也包括一些茶渣蛋白的提取研究，但其不論是規(guī)?；€是工業(yè)化應(yīng)用都非常有限，如何實(shí)現(xiàn)茶渣的資源化越來越受到關(guān)注，急需拓展高效、價(jià)值化的綜合方案。隨著開發(fā)技術(shù)的不斷推進(jìn)，有研究者利用微生物發(fā)酵的方式對茶渣飼料進(jìn)行運(yùn)用，開發(fā)生物飼料。有研究表明，茶渣經(jīng)過不同的微生物發(fā)酵后其營養(yǎng)成分會有所增加。如劉姝等(2001年)以茶渣為原料，利用木霉、曲霉以及有益微生物發(fā)酵進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)粗蛋白質(zhì)和可溶性物質(zhì)的含量顯著增加，并且其營養(yǎng)含量已經(jīng)完全滿足仔豬配合日糧的需求。目前已報(bào)道用于茶渣發(fā)酵的微生物有黑曲霉、青霉屬、酵母屬、根霉屬、灰綠曲霉、細(xì)菌類等。將茶渣開發(fā)成飼料的研究剛剛起步，尚存在一些問題，除了基質(zhì)原料本身的營養(yǎng)性之外，另外一個(gè)很重要的方面就是微生物的種類和功能性。發(fā)酵菌株的選擇首先應(yīng)在《飼料添加劑品種目錄》當(dāng)中，但作為發(fā)酵飼料用的菌種，其核心目的還在于針對不同原料的預(yù)處理，以及在飼料“熟化”過程中的代謝產(chǎn)物，所以不同的基質(zhì)原料和不同的目標(biāo)選擇的菌種是不一樣。如何利用微生物發(fā)酵的方法來處理茶渣，使得茶渣中氨基酸含量提高，纖維素含量減少，更適于家禽的飼喂，這是目前研究需要攻克的一個(gè)方面。因此，需要根據(jù)茶渣的營養(yǎng)特性，篩選更多能夠利用茶渣作為碳氮源生長的菌株，開發(fā)茶渣固態(tài)發(fā)酵工藝。常壓室溫等離子體(atmosphericroomtemperatureplasma,artp)被稱為除氣體、液體、固體以外物質(zhì)的第四態(tài)，通過改變激發(fā)方式和發(fā)生器結(jié)構(gòu)可以產(chǎn)生不同熱力學(xué)狀態(tài)的等離子體。等離子體具有臭氧濃度及紫外輻射強(qiáng)度均極低，安全性高、環(huán)境友好、誘變快速等特點(diǎn)，常壓室溫等離子體誘變操作簡單，條件溫和，菌株突變率高、突變點(diǎn)位和跨度廣泛。artp工作氣源種類、流量、放電功率、處理時(shí)間等條件均可控，通過改變儀器操作條件，可以大大提高菌種突變的強(qiáng)度和突變庫容量，結(jié)合壓力篩選和高通量篩選技術(shù)，artp已經(jīng)成為高效進(jìn)化育種的新方法。artp誘變一般以致死率作為篩選誘變條件等的指標(biāo)，致死率不宜過高或過低，有研究表明，致死率越接近90％，誘變效果越好，此時(shí)的誘變條件越佳。陳瑞龍等(2018)的文章公開了植物乳桿菌細(xì)菌素高產(chǎn)菌株的誘變選育及其對肉丸的防腐保鮮作用，具體是以植物乳桿菌jl-a65為出發(fā)菌株，對其進(jìn)行artp誘變、甲基硝基亞硝基胍(mnng)誘變與基因組改組。artp誘變參數(shù)設(shè)置為：載氣：高純氦氣(99.99％)；入射功率：200w；載氣流速：10slm；處理溫度：25℃；反射功率：40w；載物臺與放射源距離：10.0mm；照射時(shí)間分別為15、30、45、60、75、90和105s進(jìn)行誘變。然后利用瓊脂擴(kuò)散法對誘變處理后菌株進(jìn)行初篩和復(fù)篩，得到細(xì)菌素產(chǎn)量提高的突變株。目前未見采用artp誘變及馴化篩選的方法進(jìn)行功能性微生物的選育，并結(jié)合多種菌株混合、優(yōu)選輔料組合、菌酶協(xié)同發(fā)酵的方法進(jìn)行茶渣發(fā)酵飼料研究的相關(guān)報(bào)道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是采用artp誘變及馴化篩選功能性微生物，建立“一罐多菌”混合培養(yǎng)工藝，同時(shí)配以合適的輔料組合和外源菌酶，用于茶渣發(fā)酵及茶渣資源的高值化利用，開發(fā)以茶營養(yǎng)為主要成分的“菌茶”生物飼料。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：一種混合菌株發(fā)酵制備茶渣飼料的方法，包括如下步驟：s1.artp誘變及馴化篩選功能性微生物：采用artp誘變短小芽孢桿菌(bacilluspumilus)和植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)，得到的突變菌株接種至馴化培養(yǎng)基中，通過逐級提高馴化培養(yǎng)基中的茶渣含量，篩選獲得耐受高濃度茶渣的突變菌株；s2.突變菌株的混合發(fā)酵：將步驟s1得到的耐受高濃度茶渣的突變菌株混勻，得到菌落總數(shù)為0.5×106-1.5×106cfu/g的混合菌液；將混合菌液與發(fā)酵基質(zhì)按重量比為4-6：94-96混勻，得到混合發(fā)酵基質(zhì)；向混合發(fā)酵基質(zhì)中添加纖維素酶、半纖維素酶、木聚糖酶和果膠酶，調(diào)整混合發(fā)酵基質(zhì)的含水量為35-45％，于20-30℃條件下發(fā)酵7-10d，即得茶渣飼料。優(yōu)選地，所述的耐受高濃度茶渣的突變菌株為短小芽孢桿菌(bacilluspumilus)bp-09和植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)lp-08；所述短小芽孢桿菌(bacilluspumilus)bp-09于2020年6月16日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心(gdmcc)，保藏編號為gdmccno：61062；所述植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)lp-08于2020年6月16日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心(gdmcc)，保藏編號為gdmccno：61061。優(yōu)選地，步驟s1中所述的artp誘變的條件為：電源功率60w，照射距離3mm，等離子體的溫度26℃，氣流量10l/min，短小芽孢桿菌的artp處理時(shí)間為120s，植物乳桿菌的artp處理時(shí)間為60s。優(yōu)選地，步驟s1中所述的高濃度茶渣是指馴化培養(yǎng)基中含有20％茶渣浸提液。優(yōu)選地，所述的混合菌液中短小芽孢桿菌bp-09與植物乳桿菌lp-08的比例為1：1.5。更優(yōu)選地，所述的混合菌液中菌落總數(shù)為1×106cfu/g。優(yōu)選地，所述的混合菌液與發(fā)酵基質(zhì)的重量比為5：95。優(yōu)選地，所述的發(fā)酵基質(zhì)包括茶渣、脫脂米糠和豆粕粉，三者質(zhì)量比為7：2：1。優(yōu)選地，所述的混合發(fā)酵基質(zhì)中纖維素酶終濃度為300μ/g，半纖維素酶終濃度為300μ/g，木聚糖酶終濃度為200μ/g，果膠酶終濃度為200μ/g。優(yōu)選地，所述的混合發(fā)酵基質(zhì)的含水量為40-45％，發(fā)酵溫度為25-30℃，發(fā)酵時(shí)間為8-9d。優(yōu)選地，所述的茶渣為綠茶茶渣。相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有以下有益效果：(1)本發(fā)明提供的方法選擇符合國家飼料微生物目錄的安全菌株，為短小芽孢桿菌和植物乳桿菌，這兩種菌株組合具有正協(xié)同作用。在此基礎(chǔ)上，從artp誘變和茶渣的馴化定向選育出發(fā)，篩選能夠耐受一定濃度茶渣，并能夠以茶渣為主要營養(yǎng)源生長的菌株進(jìn)行混合菌株發(fā)酵。(2)本發(fā)明提供的方法通過評估不同功能突變菌株混合培養(yǎng)的可能性，建立“一罐多菌”混合培養(yǎng)工藝，既解決單個(gè)菌株培養(yǎng)的費(fèi)時(shí)費(fèi)力費(fèi)錢的問題，又能大大增加混合菌株的“共生”特性，同時(shí)配以合適的輔料組合，促進(jìn)混合功能微生物的繁殖，結(jié)合外源酶的協(xié)同，消化茶渣中的大分子，釋放茶中的活性成分，進(jìn)一步挖掘原料利用空間，充分強(qiáng)化固體發(fā)酵中的群落優(yōu)勢，提供高含量的益生菌及其功能性活性物質(zhì)，有效的實(shí)現(xiàn)茶渣資源化利用，維護(hù)動物腸道健康，為健康養(yǎng)殖帶來益處。附圖說明圖1為artp處理時(shí)間對不同菌株存活率的影響。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的闡述，下述實(shí)施例不用于限制本發(fā)明，僅用于說明本發(fā)明。以下實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，下述實(shí)施例中所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。新鮮綠茶茶渣含水量較高(含水量70.5％)，而且粗纖維的含量也較高(粗纖維含量達(dá)到24.1％，以干重計(jì))，其中尤以纖維類含量最為豐富，其通常是纖維素與半纖維素、果膠和木質(zhì)素結(jié)合在一起，很難直接被微生物利用。為加速茶渣的生物利用，本發(fā)明選用一定量的纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶和木聚糖酶，盡可能的打開植物細(xì)胞壁，再通過配伍合適的輔料，改善和提高整個(gè)固體發(fā)酵的微生物營養(yǎng)結(jié)構(gòu)(提高碳氮比、速效氮、無機(jī)鹽和維生素等)，為不同功能的微生物高強(qiáng)度的繁殖創(chuàng)造基礎(chǔ)，結(jié)合菌酶同步發(fā)酵的方式對綠茶茶渣進(jìn)行高效發(fā)酵，從而提高茶渣的生物可利用性。1、菌種(1)原始菌芽孢桿菌類：短小芽孢桿菌bp(bacilluspumilus,bp)。乳酸菌類：植物乳桿菌lp(lactobacillusplantarum,lp)。(2)檢菌g+菌株為藤黃微球菌atcc4698(micrococcusluteusatcc4698)，g-菌株為大腸桿菌atcc25922(escherichiacoliatcc25922)，孔徑6.0±0.2mm。2、試劑綠茶提取后的茶渣由福建仙洋洋生物科技有限公司提供；脫脂米糠、麩皮、豆粕粉等由廣東容大生物股份有限公司提供；纖維素酶(200000μ/g)、木聚糖酶(200000μ/g)、果膠酶(30000μ/g)、半纖維素酶(100000μ/g)均購自于棗莊市杰諾生物酶有限公司；酵母提取粉、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨等購自于生工生物工程(上海)股份有限公司；乳酸細(xì)菌培養(yǎng)基(mrs)等購自于青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；常壓室溫等離子體誘變儀(artp)購自于無錫源清天木生物科技有限公司；發(fā)酵呼吸袋購自于溫州創(chuàng)佳包裝材料有限公司；其它試劑、耗材均購自于生工生物工程(上海)股份有限公司。3、培養(yǎng)基細(xì)菌培養(yǎng)基(％)：牛肉膏0.5，蛋白胨1.0，氯化鈉0.5，naoh調(diào)ph至7.0，若制固體培養(yǎng)基，加入2.0％瓊脂粉，121℃滅菌21min。該培養(yǎng)基主要用于芽孢類細(xì)菌的培養(yǎng)。mrs培養(yǎng)基(％)：蛋白胨1.0，牛肉膏1.0，酵母膏0.5，檸檬酸氫二銨0.2，葡萄糖2.0，吐溫800.1ml，三水合乙酸鈉0.5，三水合磷酸氫二鉀0.2，七水合硫酸鎂0.058，一水合硫酸錳0.025，naoh調(diào)ph至6.5，若制固體培養(yǎng)基，加入2.0％瓊脂粉，121℃滅菌21min。該培養(yǎng)基主要用于乳酸菌類的培養(yǎng)。lb培養(yǎng)基(％)：胰蛋白胨1.0，酵母提取物0.5，nacl1.0，naoh調(diào)ph至7.0，若制固體培養(yǎng)基，加入2.0％瓊脂粉，121℃滅菌21min。該培養(yǎng)基主要用于檢菌的培養(yǎng)。平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基(％)：tsa培養(yǎng)基+1.0％葡萄糖，主要用于混合培養(yǎng)菌株及固體發(fā)酵后的菌落平板計(jì)數(shù)。馴化培養(yǎng)基(％)：以熱水浸提后的綠茶茶渣作為主要碳源，篩選能夠在一定濃度茶渣中繁殖代謝的菌株，具體配方包括(％)：茶渣5.0，硫酸銨0.5，磷酸二氫鉀0.15，無水乙酸鈉0.1，硫酸鎂0.02，硫酸錳0.005，硫酸亞鐵0.005，碳酸鈣0.3，naoh調(diào)ph至6.5-7.0，121℃滅菌20min。固體平板需添加2.0％的瓊脂粉。多菌株混合培養(yǎng)基(％)：豆粕粉2.0，玉米淀粉1.5，紅糖粉2.0，葡萄糖0.5，酵母膏0.5，蛋白胨0.5，甘蔗糖蜜1.0，乙酸鈉0.5，檸檬酸二銨0.2，硫酸胺0.1，磷酸二氫鉀0.15，輕質(zhì)碳酸鈣0.3，硫酸鎂0.02，硫酸錳0.005，吐溫800.1，naoh調(diào)ph至6.5-7.0，121℃滅菌20min，備用。主要用于多菌株的混合培養(yǎng)。茶渣固體發(fā)酵培養(yǎng)基(％)：硫酸胺0.1，硫酸鎂0.02，磷酸二氫鉀0.15，輕質(zhì)碳酸鈣0.5，甘蔗糖蜜0.6，混合后與茶渣和輔料一起攪拌均勻，每個(gè)發(fā)酵袋裝量10kg。磷酸鹽緩沖液：將3.4gkh2po4溶解于50ml的蒸餾水中，用1mol/l的naoh調(diào)整ph值至7.2，最后用加入蒸餾水使體積達(dá)到100ml。121℃高壓滅菌15分鐘，4℃保存?zhèn)溆谩?、檢測方法總酸含量的測定：參照國標(biāo)gb/t12456—2008《食品中總酸的測定》中的酸堿滴定法測定。粗蛋白含量：參照gb/t6432-2018《飼料中粗蛋白的測定》凱氏定氮法。酸溶蛋白含量：參照gb/t22492-2008《大豆肽粉》中酸溶蛋白質(zhì)含量的測定。粗纖維含量：參照gb/t6434-2006《飼料中粗纖維的含量測定》過濾法。氨基酸含量：參照gb/t18246-2000《飼料中氨基酸的測定》。5、平板菌落計(jì)數(shù)稱取1.0g固體發(fā)酵樣品(或1ml發(fā)酵液樣品)加入到9.0ml的磷酸鹽緩沖液中，然后加入2滴吐溫80，這樣就得到了濃度為10-1的稀釋溶液。150rpm震蕩搖勻5-10min，然后用磷酸鹽緩沖溶液對震蕩液進(jìn)行梯度稀釋，分別得到10-3，10-5和10-7的稀釋梯度，將不同梯度的稀釋液分別涂布2個(gè)平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)皿，30℃培養(yǎng)72小時(shí)，計(jì)算總菌落數(shù)，并對不同的菌落類型進(jìn)行分類計(jì)數(shù)。6、抑菌活性分析采用改良的瓊脂擴(kuò)散法檢測代謝產(chǎn)物的抑菌活性。參考文獻(xiàn)：郝湘妹,王宇航,王媛,等.幾種檢測乳酸菌抑制真菌性能的方法比較[j].食品研究與開發(fā),2020(9).實(shí)施例1菌株的artp誘變1、菌株活化取不同菌株(短小芽孢桿菌、植物乳桿菌)的甘油菌接種于相應(yīng)的斜面培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)24h，培養(yǎng)結(jié)束后，從中取一環(huán)菌株劃線至新鮮的斜面培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)16h，進(jìn)一步強(qiáng)化菌株活力，復(fù)壯菌株，達(dá)到菌株活化的目的。2、菌株artp誘變參數(shù)的確定活化培養(yǎng)好的斜面中加入無菌生理鹽水，洗脫，制備菌懸液，控制菌懸液od600nm值在0.5-0.7之間。取10μl的菌懸液，均勻涂布在金屬載片的表面，干燥后用滅菌鑷子將裝有樣品載片的平板轉(zhuǎn)移至artp操作倉。采用高純氦氣作為等離子體的工作氣體處理菌物載片，設(shè)置電源功率60w，照射距離3mm，等離子體的溫度26℃，氣流量10l/min，設(shè)置不同的處理組，各組的處理時(shí)間分別為0(對照)、30、60、90、120、150、180s，每組設(shè)置三次重復(fù)。將處理后的載片轉(zhuǎn)移到裝有1ml滅菌生理鹽水的ep管中，振蕩器洗脫60s，把附著在載片上的微生物洗脫到無菌生理鹽水中，形成菌懸液。將菌懸液適當(dāng)稀釋后涂布至相應(yīng)的平板，置于30℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h后進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算致死率，致死率計(jì)算方法如下所示：致死率％＝(未經(jīng)誘變處理菌落數(shù)-經(jīng)誘變處理菌落數(shù))/未經(jīng)誘變菌落數(shù)×100％通過統(tǒng)計(jì)各處理組的致死率，選擇致死率約80％的照射處理時(shí)間進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)，即保證一定的突變豐富度，又提供一定的存活率。結(jié)果：不同類型菌株菌懸液經(jīng)artp誘變，以未經(jīng)artp處理的(處理時(shí)間0s)的菌株為對照，繪制不同類型菌株的致死率曲線(圖1)。由圖1可知，不同類型菌株對artp的耐受性有明顯差異：(1)就植物乳桿菌而言，artp處理30s，致死率僅為36.6％，處理時(shí)間60s時(shí)，致死率大幅度增加，達(dá)到76.8％，而當(dāng)處理時(shí)間超過90s時(shí)，致死率超過95％，處理時(shí)間120s，致死率幾乎達(dá)到100％。(2)而同樣作為原核生物的短小芽孢桿菌對artp就具備更好的耐受性，其同樣條件下處理60s，致死率僅為24.6％，處理90s，致死率上升至50.6％，處理120s，致死率為80.1％，而處理時(shí)間達(dá)到150s時(shí)，細(xì)胞存活率還有3.6％，處理180s，細(xì)胞存活率基本為0。所以，在保證誘變效果的同時(shí)又有一定的細(xì)胞存活率進(jìn)行后續(xù)篩選，選擇致死率約為80％的條件進(jìn)行artp處理，所以植物乳桿菌的artp處理時(shí)間確定為60s，短小芽孢桿菌的處理時(shí)間確定為120s。實(shí)施例2突變株的馴化篩選取artp處理后的菌懸液直接接種至馴化培養(yǎng)基中，裝液量為250ml三角瓶裝液50ml，30℃，220rpm，培養(yǎng)72h，考察菌株在以茶渣為主要碳源的培養(yǎng)基中的生長與繁殖能力。并通過逐級的提高馴化培養(yǎng)基中的茶渣含量，結(jié)合平板分離，獲得菌株生長力強(qiáng)，可以耐受和利用高濃度茶渣的優(yōu)良菌株，保存，備用。具體如下：(1)低濃度茶渣對突變株的馴化將artp處理后的菌懸液直接轉(zhuǎn)接至馴化培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，以未處理的菌株為對照，觀察發(fā)酵液的顏色及氣味變化，并對發(fā)酵液菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示：不同類型突變菌株在含有以5.0％茶渣為唯一碳源的培養(yǎng)基中都能夠不同程度的進(jìn)行繁殖，并且能夠正常一定的代謝活動，而其原始菌株在同樣的培養(yǎng)基條件下均不能正常生長。從生長情況來說，短小芽孢桿菌突變菌生長最好，植物乳桿菌突變菌次之；從代謝產(chǎn)物活性來說，短小芽孢桿菌體現(xiàn)了一定的對g+(藤黃微球菌)的抑菌活性，而植物乳桿菌則同時(shí)具有g(shù)+與g-(大腸桿菌)的抑菌活性，但抑菌圈相對比較模糊，而且邊界也不清晰，這可能與乳酸菌類產(chǎn)生的有機(jī)酸有關(guān)，低濃度的有機(jī)酸的抑菌性能往往都不太徹底(表1)。表1artp突變菌在含綠茶茶渣培養(yǎng)基中的馴化培養(yǎng)特性菌株類型ph菌落數(shù)(cfu/ml)g+活性(mm)g-活性(mm)短小芽孢桿菌7.19±0.053.9±0.05×10711.2±0.1nd植物乳桿菌4.10±0.058.9±0.05×10610.2±0.110.3±0.1注：nd表示未檢測到抑菌活性。(2)高茶渣濃度耐受性突變株的復(fù)篩同時(shí)，繼續(xù)將馴化培養(yǎng)獲得的菌液分別涂布至含有10％、15％、20％茶渣浸提液的馴化培養(yǎng)基平板，挑取能夠在高濃度茶渣中生長的菌落進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)。結(jié)果顯示：不同類型的菌株都有能夠在20％茶渣浸提液中生長的菌落，而其液體發(fā)酵的菌濃與低濃度茶渣馴化培養(yǎng)結(jié)果基本一致，說明高濃度的茶渣營養(yǎng)環(huán)境對突變株的生長基本沒有抑制，反而不同類型變株合成活性成分的能力還受到明顯的刺激，不管是抑菌活性還是產(chǎn)酸能力都有一定程度的提高(表2)。整體來說，短小芽孢桿菌對于g+的抑菌活性比較低，最高的為12±0.1mm。而乳酸菌類突變株均體現(xiàn)了較好的產(chǎn)酸能力，ph最低為4.01(lp-08菌株)，體現(xiàn)了較好的乳酸菌發(fā)酵特性。表2突變株對高濃度茶渣的耐受性篩選(部分)注：nd表示未檢測到抑菌活性。選擇生物量最好、代謝產(chǎn)物活性好的菌株短小芽孢桿菌bp-09、植物乳桿菌lp-08進(jìn)行搖瓶復(fù)篩，采用瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行活性抑菌活性檢測。結(jié)果顯示：短小芽孢桿菌bp-09只對g+菌株有明顯抑菌效果，能夠形成清晰明確的抑菌圈；而植物乳桿菌lp-08對g+和g-菌株都有一定的抑制效果，但抑菌圈透明度低，這與上述耐受篩選的結(jié)果基本一致。將短小芽孢桿菌(bacilluspumilus)bp-09于2020年6月16日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心(gdmcc)，保藏編號為gdmccno：61062。保藏地址為廣州市先烈中路100號大院59號樓5樓。將植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)lp-08于2020年6月16日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心(gdmcc)，保藏編號為gdmccno：61061。保藏地址為廣州市先烈中路100號大院59號樓5樓。實(shí)施例3混合突變菌株的液體培養(yǎng)(1)單一菌株發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌分析在進(jìn)行多菌株混合培養(yǎng)前，有必要考察不同菌株的代謝產(chǎn)物對其它菌株的抑制作用，采用混合發(fā)酵培養(yǎng)基分別將上述篩選獲得的菌株進(jìn)行單獨(dú)培養(yǎng)，離心收集發(fā)酵液上清，根據(jù)瓊脂擴(kuò)散法，檢測菌株之間的抑制作用。結(jié)果顯示：菌株之間基本沒有相互的抑制作用。(2)多菌株的混合培養(yǎng)分析在單一菌株與同類型菌株純培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，根據(jù)不同菌株的生理及代謝特性，設(shè)計(jì)同一發(fā)酵體系中培養(yǎng)不同類型的菌株，實(shí)現(xiàn)“一罐多菌”培養(yǎng)，考察混合培養(yǎng)條件的活菌數(shù)及代謝產(chǎn)物活性。具體步驟如下：分別在不同菌的活化斜面(18×180mm)中刮一大環(huán)接種至相應(yīng)的茄子瓶斜面，30℃培養(yǎng)24h，每個(gè)茄子瓶加入50ml無菌水洗脫，制備菌懸液，od600nm控制在0.5-0.6之間，此即斜面種子液。將洗脫的菌懸液混合后，全量接種至50l混合培養(yǎng)罐，進(jìn)行菌株的擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)罐裝液量30l。培養(yǎng)溫度：30℃，罐壓0.05-0.08mpa，初攪拌250rpm，溶氧自然下降直至到0，ph自然下降后流加20％的氨水控制ph5.0左右，通氣量15l/min，周期：24h。每隔兩小時(shí)取樣檢測發(fā)酵液抑菌活性(g+與g-)和菌落總數(shù)。結(jié)果顯示：以初始(發(fā)酵0h)菌落總數(shù)(cfu)約1.0×107/ml進(jìn)入發(fā)酵體系，0-6h菌株處于適應(yīng)期，此時(shí)培養(yǎng)體系中還原糖的濃度沒有減少，這并不是說混合菌株沒有消耗還原糖，恰恰相反，混合菌株在適應(yīng)期通過合成系列的淀粉酶類，通過水解復(fù)合糖原保持著體系中的還原糖濃度，發(fā)酵6-8h后菌株進(jìn)入對數(shù)生長期，菌落數(shù)急劇增加，發(fā)酵泡沫急劇增加，還原糖的消耗也相應(yīng)增多，并且隨著混合的菌的繁殖，還原糖的量急劇減少，并在約16h還原糖的量基本檢測不到，泡沫的生長也基本停止，培養(yǎng)20h菌落數(shù)達(dá)到最大，cfu為3.5×1010/ml，說明混合菌能夠非常好的適應(yīng)混合培養(yǎng)體系，并且能夠充分利用混合培養(yǎng)成分進(jìn)行菌體的繁殖與代謝。從不同培養(yǎng)時(shí)期的菌體情況看，發(fā)酵0h時(shí)，視野中長桿和短桿菌數(shù)量基本一致，基本沒有芽孢的形成，而且菌體染色深，說明混合菌株的活力是可以的；培養(yǎng)12h鏡檢顯示，整個(gè)視野中菌落數(shù)明顯增加，短桿菌增多，而且開始出現(xiàn)少量芽孢，其中長桿菌由細(xì)長變粗，而且主要呈“對生”或“八字形”菌株較多，說明混合菌株正處于旺盛的繁殖生長期；培養(yǎng)結(jié)束前取樣，菌體數(shù)量進(jìn)一步增加，特別是芽孢數(shù)量增加明顯，同時(shí)視野中偶見個(gè)別短桿菌，染色，視野中菌落類型的比例大致為芽孢：桿菌＝9：7。另外，鑒于功能菌株本身的代謝特性，采用瓊脂擴(kuò)散法檢測混合培養(yǎng)各個(gè)時(shí)期上清液的抑菌性能，結(jié)果如下表3。表3功能菌株混合培養(yǎng)下的抑菌性能從抑菌性能來說，整個(gè)取樣期的抑菌活性以g+抑菌活性為主，而且在混合菌培養(yǎng)前期，隨著短小芽孢桿菌數(shù)量增加，發(fā)酵過程泡沫的增加，其發(fā)酵液上清的抑菌活性也相應(yīng)增加，并且在12h時(shí)達(dá)到最大，g+抑菌圈直徑達(dá)到22.2±0.2mm，隨著發(fā)酵泡沫的減少，其它類型菌株的增殖，g+抑菌性能也略有降低，從其g+抑菌特性與泡沫的聯(lián)系，g+的抑菌活性成分可能為脂肽類成分(如表面活性素、伊枯草菌素等)。不同于g+抑菌活性，g-抑菌活性直到培養(yǎng)12h后才勉強(qiáng)看到，而且抑菌圈也不清晰透明。總的來說，不同類型的菌株在這同一體系下能夠很好的共棲。不僅如此，菌株混合培養(yǎng)展現(xiàn)的良好抑菌活性也為后續(xù)的固體發(fā)酵及動物養(yǎng)殖應(yīng)用帶來益處。實(shí)施例4茶渣的菌酶協(xié)同發(fā)酵固體發(fā)酵茶渣試驗(yàn)步驟如下：發(fā)酵基質(zhì)由濕的綠茶茶渣和輔料構(gòu)成，茶渣：脫脂米糠：豆粕＝7：2：1。同時(shí)為了更好的促進(jìn)微生物對茶渣的轉(zhuǎn)化，選用酶的協(xié)同發(fā)酵，其中，纖維素酶終濃度為300μ/g，半纖維素酶終濃度為300μ/g，木聚糖酶終濃度為200μ/g，果膠酶終濃度為200μ/g。采用液體混合菌液(即短小芽孢桿菌bp-09和植物乳桿菌lp-08的混合菌液，初始菌落總數(shù)約1×106cfu/g；其中，短小芽孢桿菌bp-09：植物乳桿菌lp-08＝1：1.5)接種，接種量按混合菌液與發(fā)酵基質(zhì)的重量比為5：95計(jì)，同時(shí)，調(diào)節(jié)含水量，保證基質(zhì)一觸即散，且手捏成團(tuán)但不滴水為最佳(含水量約為40-45％)。然后將混合好的基質(zhì)裝入帶有單向閥的發(fā)酵袋中，常溫(25-30℃)發(fā)酵7-10d，直至有酸甜的酒曲香味，表明發(fā)酵完成且充分。發(fā)酵完成后主要測定發(fā)酵樣品的總活菌數(shù)、總酸、粗蛋白、酸溶蛋白、粗纖維、賴氨酸、蘇氨酸及甲硫氨酸等指標(biāo)，檢測方法參考國標(biāo)及行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法執(zhí)行。菌酶協(xié)同發(fā)酵9天，檢測結(jié)果見表4。表4菌酶協(xié)同發(fā)酵茶渣注：此次發(fā)酵指標(biāo)的檢測數(shù)據(jù)均以濕重計(jì)。表4中的結(jié)果顯示，采用混合菌液進(jìn)行茶渣發(fā)酵：(1)從發(fā)酵前后的水分含量來看，發(fā)酵后的水份含量較發(fā)酵前略有減少，說明bp-09和lp-08的混合功能菌株能夠在發(fā)酵基質(zhì)中有效生長，并在整個(gè)發(fā)酵過程中產(chǎn)氣或熱。(2)從菌落總數(shù)來看，發(fā)酵前接入混合菌的總菌落數(shù)為1×106cfu/g，該菌株能夠首先利用易消化的碳、氮源進(jìn)行基礎(chǔ)代謝(先好氧后厭氧)，特別是輔料豆粕，其中的氨基酸氮等最有利于菌株的生長(菌株增加兩個(gè)數(shù)量級)，同時(shí)其合成代謝產(chǎn)物如有機(jī)酸、酶等進(jìn)一步助力水解復(fù)雜底物，反過來促進(jìn)菌株的進(jìn)一步生長繁殖，體現(xiàn)了bp-09和lp-08菌株較好的茶渣基質(zhì)的適應(yīng)性和生長特性。(3)從蛋白含量來看，發(fā)酵后基質(zhì)的粗蛋白有提高，其中酸溶蛋白明顯增多。總粗蛋白的含量的增加可能與水分、產(chǎn)氣代謝等相關(guān)，畢竟輔料的添加有利于微生物繁殖，也有助于微生物的代謝。另外，bp-09和lp-08菌株也加速基質(zhì)中難溶蛋白分解，以及非蛋白氮的轉(zhuǎn)化與合成為可溶的小分子蛋白或肽，酸溶蛋白增加了83.6％。(4)從發(fā)酵后的總酸來看，總酸含量大幅度提高，表明bp-09和lp-08菌株都能夠適應(yīng)一定的酸性環(huán)境，并具備較好的產(chǎn)酸特性，特別是lp-08菌株，在厭氧條件下利用基質(zhì)進(jìn)行酸代謝，而作為發(fā)酵飼料，一定的酸度值不僅利于發(fā)酵基質(zhì)的防霉，而且作為生物飼料其也有一定的誘食作用，體現(xiàn)了較好的應(yīng)用特性。(5)從粗纖維的含量來看，發(fā)酵前后，粗纖維的含量差異明顯，這其中和外源添加的酶制劑有關(guān)，同時(shí)也與菌株bp-09和lp-08的生長代謝密切相關(guān)。bp-09菌株較好的茶渣耐受性和生長特性也充分展示了bp-09的粗纖維的降解能力，同時(shí)lp-08菌株的有機(jī)酸發(fā)酵特性，也為復(fù)雜基質(zhì)的代謝創(chuàng)造條件，這也是混合菌株能夠發(fā)酵茶渣基質(zhì)的基礎(chǔ)，菌、酶協(xié)同條件下，粗纖維含量降低了51.6％。(6)從氨基酸的含量看，發(fā)酵前后必需氨基酸中的賴氨酸、蘇氨酸和蛋氨酸都成倍的增加，分別增加了7.7倍、8.0倍和3.3倍。這三個(gè)氨基酸作為動物營養(yǎng)中的限制性氨基酸，直接影響動物對其他氨基酸的吸收利用，也充分體現(xiàn)了lp-08和bp-09菌株良好的茶渣發(fā)酵代謝能力。綜上，本發(fā)明首選符合國家飼料微生物目錄的安全菌株，為短小芽孢桿菌和植物乳桿菌，這兩種菌株組合有些具有正協(xié)同作用。短小芽孢桿菌具有較強(qiáng)的產(chǎn)酶能力，能夠產(chǎn)包含蛋白質(zhì)酶、糖苷酶、淀粉酶以及脂肪酶等多種酶，并且能夠代謝復(fù)合的碳氮源，分泌多種生物活性物質(zhì)如環(huán)脂肽、細(xì)菌素以及抗菌肽等等，這非常有利于降解綠茶茶渣中復(fù)雜含氮化合物，并且利用部分碳水化合，從而提高飼料中氨基酸含量；植物乳桿菌不僅可以分泌一些酶類，同時(shí)能夠代謝產(chǎn)生多種有機(jī)酸及乳酸菌素，而這對提高飼料的品質(zhì)大有幫助。在此基礎(chǔ)上，從artp誘變和茶渣的馴化定向選育出發(fā)，篩選能夠耐受一定濃度茶渣，并能夠以茶渣為主要營養(yǎng)源生長的菌株，并通過評估不同功能菌株混合培養(yǎng)的可能性，建立“一罐多菌”混合培養(yǎng)工藝，既解決單個(gè)菌株培養(yǎng)的費(fèi)時(shí)費(fèi)力費(fèi)錢的問題，又能大大增加混合菌株的“共生”特性，同時(shí)配以合適的輔料組合，促進(jìn)混合功能微生物的繁殖，結(jié)合外源酶的協(xié)同，消化茶渣中的大分子，釋放茶中的活性成分，進(jìn)一步挖掘原料利用空間，充分強(qiáng)化固體發(fā)酵中的群落優(yōu)勢，提供高含量的益生菌及其功能性活性物質(zhì)，有效的實(shí)現(xiàn)茶渣資源化利用，維護(hù)動物腸道健康，為健康養(yǎng)殖帶來益處。最后應(yīng)當(dāng)說明的是，以上內(nèi)容僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行的簡單修改或者等同替換，均不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。當(dāng)前第1頁12

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