本發(fā)明屬于功能性低聚糖制備技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種高純度低聚半乳糖的綠色制備方法，包括含β-半乳糖苷酶胞內(nèi)酶的酵母全細(xì)胞的發(fā)酵制備，也包括利用乙醇溶液透性化處理酵母全細(xì)胞，且包括利用透性化酵母細(xì)胞催化乳糖制備低聚半乳糖，還包括利用酵母全細(xì)胞反應(yīng)純化低聚半乳糖粗品獲得高純度低聚半乳糖，而且該方法中透性化酵母細(xì)胞和酵母全細(xì)胞都可重復(fù)循環(huán)利用，實(shí)現(xiàn)了“一種酵母，兩種用途”的高純度低聚半乳糖綠色循環(huán)制備。

背景技術(shù)：

低聚半乳糖(galacto-oligosaccharides,gos)是一類重要的益生因子，能有效促進(jìn)腸道內(nèi)的雙歧桿菌增殖，具有防止便秘、改善礦物質(zhì)吸收和脂質(zhì)代謝、促進(jìn)維生素生成、提高免疫力、抗衰老和抗腫瘤等功能，是一種重要的功能性食品添加劑。gos通常由乳糖經(jīng)β-半乳糖苷酶(β-d-galactosidegalactohydrolases，ec3.2.1.23)的轉(zhuǎn)糖苷作用催化制得。但是，由于β-半乳糖苷酶本身也是一種糖苷水解酶，在gos的合成反應(yīng)中，不僅存在著乳糖通過(guò)轉(zhuǎn)糖苷作用催化合成目標(biāo)產(chǎn)物gos的反應(yīng)，還存在著乳糖被水解生成葡萄糖和半乳糖的副反應(yīng)，這不僅降低目標(biāo)產(chǎn)物gos的收率，而且使gos粗品中同時(shí)存在著葡萄糖、半乳糖和未反應(yīng)的乳糖等產(chǎn)品，為后續(xù)高純度gos產(chǎn)品的純化制備帶來(lái)了困難。

目前對(duì)于gos的純化方法主要有膜分離法、色譜層析法、乙醇沉淀法和超臨界流體萃取法等。這些方法對(duì)設(shè)備要求高，操作復(fù)雜且成本高，通常所得產(chǎn)品純度不超過(guò)65％，不利于大規(guī)模生產(chǎn)高純度gos。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決上述純化難題，本發(fā)明開(kāi)發(fā)了一種酵母發(fā)酵法反應(yīng)純化gos的新技術(shù)。酵母能以葡萄糖、半乳糖和乳糖作為碳源進(jìn)行繁殖生長(zhǎng)，是一種可以應(yīng)用在食品領(lǐng)域中的對(duì)人類安全的微生物。而且酵母在適宜的培養(yǎng)條件下，生長(zhǎng)代謝速率快，周期短，便于工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)。將酵母全細(xì)胞添加至gos粗品中，可以利用其可代謝消耗葡萄糖、半乳糖和乳糖，但不降解gos的特點(diǎn)，將gos粗品中的雜糖組分去除，提高gos的純度。本發(fā)明利用一種酵母實(shí)現(xiàn)gos催化制備與反應(yīng)純化的兩種用途，操作簡(jiǎn)單、成本低、可循環(huán)利用，所得gos產(chǎn)品純度高，有利于工業(yè)應(yīng)用和推廣。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下:

一種高純度低聚半乳糖的綠色制備方法，包括如下步驟：

1)含β-半乳糖苷酶胞內(nèi)酶的酵母全細(xì)胞的發(fā)酵制備；

2)利用乙醇溶液透性化處理酵母全細(xì)胞；

3)利用透性化酵母細(xì)胞催化乳糖制備低聚半乳糖；

4)利用酵母全細(xì)胞反應(yīng)純化低聚半乳糖粗品獲得高純度低聚半乳糖。

所述步驟1)的方法是：將酵母單克隆接種到種子液培養(yǎng)基中制備酵母種子液，然后向富含乳糖的生物質(zhì)培養(yǎng)基加入0.1～10％(v/v)酵母種子液，在溫度為16～37℃，攪拌轉(zhuǎn)速為50～500rpm，ph值為4～10的條件下發(fā)酵制備，發(fā)酵時(shí)間為8～48h，發(fā)酵液為濃度1～20g/l的酵母全細(xì)胞的發(fā)酵液。

所述的酵母選自畢赤酵母、釀酒酵母、乳酸克魯維酵母或脆壁克魯維酵母。

所述的種子液培養(yǎng)基是每升培養(yǎng)基中含有1～30g酵母膏，1～30g蛋白胨和1～10g氯化鈉；所述的富含乳糖的生物質(zhì)選自乳糖、乳清或乳清粉；所述的培養(yǎng)基是每升培養(yǎng)基中含有1～100g富含乳糖的生物質(zhì)，1～30g酵母膏和1～30g蛋白胨；所述的酵母全細(xì)胞含有β-半乳糖苷酶胞內(nèi)酶；所述的發(fā)酵液中還含有濃度為5～40g/l的乙醇。

所述步驟2)的方法是：將上述所述的發(fā)酵液進(jìn)行離心分離，獲得酵母全細(xì)胞沉淀和發(fā)酵上清液，酵母全細(xì)胞沉淀用于透性化處理和低聚半乳糖粗品的反應(yīng)純化；采用濃度為20％～50％(v/v)的乙醇溶液透性化處理濃度為1～100g/l的酵母全細(xì)胞，透性化處理溫度為0～37℃，透性化處理時(shí)間為5s～5min，離心分離獲得乙醇處理液和透性化酵母細(xì)胞，向透性化酵母細(xì)胞加入1％～10％(w/v)ph值為4～10的50mm磷酸鈉緩沖液洗滌，再離心除去上清液，獲得β-半乳糖苷酶胞內(nèi)酶酶活為每克干細(xì)胞1×103～4×104u的透性化酵母細(xì)胞。

所述步驟3)的方法是：在透性化酵母細(xì)胞濃度為5～40g/l，溫度為20～50℃，ph值為4～10和攪拌轉(zhuǎn)速為50～500rpm的條件下，采用透性化酵母細(xì)胞酶法催化濃度為100～500g/l的乳糖制備低聚半乳糖，催化反應(yīng)0.25～18h后，獲得濃度為1～150g/l的低聚半乳糖粗品，同時(shí)產(chǎn)生濃度為50～150g/l的葡萄糖和濃度為20～100g/l的半乳糖副產(chǎn)物，催化反應(yīng)結(jié)束后還含有濃度為10～200g/l的乳糖殘留；將低聚半乳糖粗品進(jìn)行離心分離，獲得低聚半乳糖上清液和透性化酵母細(xì)胞沉淀，低聚半乳糖上清液用于高純度低聚半乳糖的反應(yīng)純化。

所述步驟4)的方法是：將上述所述的低聚半乳糖上清液進(jìn)行1到10倍的稀釋，加入濃度為1～100g/l的酵母全細(xì)胞，在溫度為15～40℃，ph為4～10和攪拌轉(zhuǎn)速為10～500rpm的條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，消耗乳糖、葡萄糖和半乳糖以純化低聚半乳糖上清液，純化時(shí)間為1～30h，獲得純化后低聚半乳糖溶液，經(jīng)過(guò)離心分離獲得純化后低聚半乳糖上清液和酵母全細(xì)胞沉淀，低聚半乳糖上清液經(jīng)過(guò)蒸餾濃縮獲得純度為65％～99％的低聚半乳糖產(chǎn)品。

本發(fā)明的所述的離心條件為離心轉(zhuǎn)速1000～15000rpm，離心時(shí)間1～20min。

所述的發(fā)酵上清液通過(guò)蒸餾獲得濃度為20～50％(v/v)的乙醇溶液，用于酵母全細(xì)胞透性化處理；所述的蒸餾溫度為60～100℃；所述的乙醇處理液可在步驟2)中酵母全細(xì)胞沉淀透性化處理重復(fù)循環(huán)利用。

所述的透性化酵母細(xì)胞沉淀可在步驟3)中催化乳糖制備低聚半乳糖重復(fù)循環(huán)利用。

所述的純化后低聚半乳糖溶液含有乙醇；所述的純化后低聚半乳糖上清液經(jīng)過(guò)蒸餾濃縮可獲得20％～50％(v/v)乙醇溶液，可用于酵母全細(xì)胞透性化處理；所述的酵母全細(xì)胞沉淀可在步驟4)中反應(yīng)純化低聚半乳糖粗品重復(fù)循環(huán)利用。

本發(fā)明提供一種高純度低聚半乳糖的綠色制備方法，與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)：

(1)根據(jù)本發(fā)明所述的高純度低聚半乳糖的綠色制備方法，通過(guò)“一種酵母，兩種用途”實(shí)現(xiàn)低聚半乳糖的催化制備與反應(yīng)純化，低聚半乳糖終產(chǎn)物純度最高可達(dá)到99％，解決了現(xiàn)有技術(shù)中低聚半乳糖生產(chǎn)成本高、純度低的問(wèn)題。

(2)本發(fā)明采用透性化酵母細(xì)胞制備低聚半乳糖，避免β-半乳糖苷酶胞內(nèi)酶的提取和純化步驟，減少酶活損失，同時(shí)透性化酵母細(xì)胞可以重復(fù)循環(huán)利用，提高了酶的利用效率，降低了酶制劑的成本。

(3)本發(fā)明在酵母全細(xì)胞的發(fā)酵制備階段和低聚半乳糖粗品的反應(yīng)純化階段都可產(chǎn)生乙醇，實(shí)現(xiàn)了高純度低聚半乳糖和乙醇同步生產(chǎn)，降低了生產(chǎn)成本。

(4)本發(fā)明所獲得的乙醇可通過(guò)蒸餾濃縮得到高濃度乙醇產(chǎn)品，用于酵母全細(xì)胞的透性化處理，不僅降低透性化處理的成本，而且避免其他來(lái)源乙醇的使用，從而保證透性化酵母細(xì)胞的食品安全性。

(5)本發(fā)明所述的酵母全細(xì)胞、透性化酵母細(xì)胞和乙醇處理液都可以重復(fù)循環(huán)利用，可以大幅度降低低聚半乳糖的制備成本，在制備過(guò)程中也可避免對(duì)環(huán)境的污染，實(shí)現(xiàn)了綠色循環(huán)制備。

(6)本發(fā)明所述的高純度低聚半乳糖的綠色制備方法工藝簡(jiǎn)單，不添加有害物質(zhì)，所需設(shè)備成本低，產(chǎn)品純度高，易于大規(guī)模工業(yè)推廣。

附圖說(shuō)明

圖1高純度低聚半乳糖(gos)的綠色制備的操作流程。

圖2透性化畢赤酵母細(xì)胞催化100g/l乳糖制備gos的時(shí)程曲線圖(▼：乳糖；●：低聚半乳糖；▲：葡萄糖；■：半乳糖)。

圖3畢赤酵母全細(xì)胞反應(yīng)純化gos粗品的時(shí)程曲線圖(▼：乳糖；●：低聚半乳糖；▲：葡萄糖；■：半乳糖)。

圖4透性化釀酒酵母細(xì)胞催化500g/l乳糖制備gos的時(shí)程曲線圖(▼：乳糖；●：低聚半乳糖；▲：葡萄糖；■：半乳糖)。

圖5釀酒酵母全細(xì)胞反應(yīng)純化gos粗品的時(shí)程曲線圖(▼：乳糖；●：低聚半乳糖；▲：葡萄糖；■：半乳糖)。

圖6透性化乳酸克魯維酵母細(xì)胞催化400g/l乳糖制備gos的時(shí)程曲線圖(▼：乳糖；●：低聚半乳糖；▲：葡萄糖；■：半乳糖)。

圖7透性化乳酸克魯維酵母細(xì)胞催化制備gos的重復(fù)循環(huán)利用研究(ygos：gos在總糖中的百分含量)。

圖8乳酸克魯維酵母全細(xì)胞反應(yīng)純化gos粗品的時(shí)程曲線圖(▼：乳糖；●：低聚半乳糖；▲：葡萄糖；■：半乳糖)。

圖9乳酸克魯維酵母全細(xì)胞反應(yīng)純化gos粗品的重復(fù)循環(huán)利用研究(ygos：gos在總糖中的百分含量)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不限于此。對(duì)本發(fā)明內(nèi)容所做的等同替換，或相應(yīng)的改進(jìn)，仍屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

本發(fā)明所述的一種高純度低聚半乳糖的綠色制備方法(圖1)，包括下述步驟：

1)含β-半乳糖苷酶胞內(nèi)酶的酵母全細(xì)胞的發(fā)酵制備

將酵母單克隆接種到種子液培養(yǎng)基中制備酵母種子液，然后向富含乳糖的生物質(zhì)培養(yǎng)基加入0.1～10％(v/v)酵母種子液，在溫度為16～37℃，攪拌轉(zhuǎn)速為50～500rpm，ph值為4～10的條件下發(fā)酵制備，發(fā)酵時(shí)間為8～48h，可得含有濃度為1～20g/l的酵母全細(xì)胞的發(fā)酵液。

2)利用乙醇溶液透性化處理酵母全細(xì)胞

將上述所述的發(fā)酵液進(jìn)行離心分離，獲得酵母全細(xì)胞沉淀和發(fā)酵上清液，酵母全細(xì)胞沉淀用于透性化處理和低聚半乳糖粗品的反應(yīng)純化。采用濃度為20％～50％(v/v)的乙醇溶液透性化處理濃度為1～100g/l的酵母全細(xì)胞，透性化處理溫度為0～37℃，透性化處理時(shí)間為5s～5min，離心分離獲得乙醇處理液和透性化酵母細(xì)胞，向后者加入1％～10％(w/v)ph值為4～10的50mm磷酸鈉緩沖液洗滌，再離心除去上清液，獲得β-半乳糖苷酶胞內(nèi)酶酶活為每克干細(xì)胞1×103～4×104u的透性化酵母細(xì)胞。

3)利用透性化酵母細(xì)胞催化乳糖制備低聚半乳糖

在透性化酵母細(xì)胞濃度為5～40g/l，溫度為20～50℃，ph值為4～10和攪拌轉(zhuǎn)速為50～500rpm的條件下，采用透性化酵母細(xì)胞酶法催化濃度為100～500g/l的乳糖制備低聚半乳糖，催化反應(yīng)0.25～18h后，可獲得濃度為1～150g/l的低聚半乳糖粗品，同時(shí)也產(chǎn)生濃度為50～150g/l的葡萄糖和濃度為20～100g/l的半乳糖副產(chǎn)物，催化反應(yīng)結(jié)束后還含有濃度為10～200g/l的乳糖殘留；將低聚半乳糖粗品進(jìn)行離心分離，獲得低聚半乳糖上清液和透性化酵母細(xì)胞沉淀，前者用于高純度低聚半乳糖的反應(yīng)純化。

4)利用酵母全細(xì)胞反應(yīng)純化低聚半乳糖粗品獲得高純度低聚半乳糖

將上述所述的低聚半乳糖上清液進(jìn)行1到10倍的稀釋，加入濃度為1～100g/l的酵母全細(xì)胞，在溫度為15～40℃，ph為4～10和攪拌轉(zhuǎn)速為10～500rpm的條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，消耗乳糖、葡萄糖和半乳糖以純化低聚半乳糖上清液，純化時(shí)間為1～30h，可獲得純化后低聚半乳糖溶液，經(jīng)過(guò)離心分離獲得純化后低聚半乳糖上清液和酵母全細(xì)胞沉淀，前者經(jīng)過(guò)蒸餾濃縮可獲得純度為65％～99％的低聚半乳糖產(chǎn)品。

實(shí)施例一

含β-半乳糖苷酶胞內(nèi)酶的畢赤酵母全細(xì)胞的發(fā)酵制備

將保存的畢赤酵母菌種接種至平板固體lb培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)72h，制得活化單菌落。取活化的單菌落接種至液體lb培養(yǎng)基中，30℃、160rpm震蕩擴(kuò)大培養(yǎng)20h，得到種子培養(yǎng)液。在500ml錐形瓶中，將0.1ml種子培養(yǎng)液接入100ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，在初始ph值4.0，轉(zhuǎn)速50rpm，溫度16℃條件下培養(yǎng)48h，獲得發(fā)酵液，離心分離得到畢赤酵母全細(xì)胞沉淀和發(fā)酵上清液，畢赤酵母全細(xì)胞沉淀用于透性化處理和低聚半乳糖(gos)粗品的反應(yīng)純化，發(fā)酵上清液除去。發(fā)酵培養(yǎng)基配方如下：乳清粉100g/l，蛋白胨1g/l，酵母膏1g/l，121℃滅菌20min。

利用乙醇溶液透性化處理畢赤酵母全細(xì)胞

利用20％(v/v)的乙醇溶液對(duì)濃度為1g/l的畢赤酵母全細(xì)胞在0℃條件下進(jìn)行透性化處理5s，離心分離獲得乙醇處理液和透性化畢赤酵母細(xì)胞沉淀，乙醇處理液除去，向透性化畢赤酵母細(xì)胞沉淀加入1％(w/v)ph值為4的濃度為50mmol/l磷酸鈉緩沖液洗滌，再離心除去上清液，獲得透性化畢赤酵母細(xì)胞。

利用透性化畢赤酵母細(xì)胞催化乳糖制備gos

配制乳糖溶液至質(zhì)量濃度為100g/l，加入5g/l透性化畢赤酵母細(xì)胞，反應(yīng)條件為溫度20℃，ph4.0，攪拌轉(zhuǎn)速50rpm，每半小時(shí)取一個(gè)樣，通過(guò)hplc檢測(cè)gos、乳糖、葡萄糖和半乳糖濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，反應(yīng)2.5h后，得到gos粗品，其含有2.6％的gos，19.2％的殘留乳糖，39.9％副產(chǎn)物葡萄糖和38.9％副產(chǎn)物半乳糖。經(jīng)過(guò)1000rpm離心20min，獲得gos上清液和透性化畢赤酵母細(xì)胞沉淀，gos上清液用于反應(yīng)純化，透性化畢赤酵母細(xì)胞沉淀除去。

利用畢赤酵母全細(xì)胞反應(yīng)純化gos粗品獲得高純度低聚半乳糖

將gos上清液稀釋至總碳水化合物濃度為100g/l，加入1g/l畢赤酵母全細(xì)胞，反應(yīng)條件為15℃，ph4，攪拌轉(zhuǎn)速10rpm，每3小時(shí)取一個(gè)樣，通過(guò)hplc檢測(cè)gos、乳糖、葡萄糖和半乳糖濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，隨著純化時(shí)間的延長(zhǎng)，乳糖、葡萄糖和半乳糖不斷被消耗，而gos不被降解消耗，純化18h后，乳糖、葡萄糖和半乳糖幾乎被完全消耗，實(shí)現(xiàn)了gos的純化。經(jīng)過(guò)1000rpm離心20min，得到純化后gos上清液和畢赤酵母全細(xì)胞沉淀，純化后gos上清液經(jīng)過(guò)蒸餾濃縮得到純度為65％的gos產(chǎn)品，畢赤酵母全細(xì)胞沉淀除去。

實(shí)施例二

含β-半乳糖苷酶胞內(nèi)酶的釀酒酵母全細(xì)胞的發(fā)酵制備

將保存的釀酒酵母菌種接種至平板固體lb培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)72h，制得活化單菌落。取活化的單菌落接種至液體lb培養(yǎng)基中，30℃、160rpm震蕩擴(kuò)大培養(yǎng)20h，得到種子培養(yǎng)液。在500ml錐形瓶中，將10ml種子培養(yǎng)液接入100ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，在初始ph值為10，轉(zhuǎn)速為500rpm，溫度為37℃條件下培養(yǎng)8h，獲得發(fā)酵液，離心分離得到釀酒酵母全細(xì)胞沉淀和發(fā)酵上清液，釀酒酵母全細(xì)胞沉淀用于透性化處理和gos粗品的反應(yīng)純化，發(fā)酵上清液除去。發(fā)酵培養(yǎng)基配方如下：乳清100ml/l，蛋白胨30g/l，酵母膏30g/l，121℃滅菌20min。

利用乙醇溶液透性化處理畢赤酵母全細(xì)胞

利用50％(v/v)的乙醇溶液對(duì)濃度為100g/l釀酒酵母全細(xì)胞在37℃條件下進(jìn)行透性化處理5min，離心分離獲得乙醇處理液和透性化釀酒酵母細(xì)胞沉淀，乙醇處理液除去，向透性化釀酒酵母細(xì)胞沉淀加入10％(w/v)ph值為10的濃度為50mmol/l磷酸鈉緩沖液洗滌，再離心除去上清液，獲得透性化釀酒酵母細(xì)胞。

利用透性化釀酒酵母細(xì)胞催化乳糖制備gos

配制乳糖溶液至質(zhì)量濃度為500g/l，加入40g/l透性化釀酒酵母細(xì)胞，反應(yīng)條件為溫度50℃，ph10.0，攪拌轉(zhuǎn)速500rpm，每20分鐘取一個(gè)樣，通過(guò)hplc檢測(cè)gos、乳糖、葡萄糖和半乳糖濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，反應(yīng)60min后，gos濃度達(dá)到最高值，gos粗品含有20.0％的gos，37.6％的殘留乳糖，26.6％副產(chǎn)物葡萄糖和15.8％副產(chǎn)物半乳糖。經(jīng)過(guò)15000rpm離心1min，獲得gos上清液和透性化釀酒酵母細(xì)胞沉淀，gos上清液用于反應(yīng)純化，透性化釀酒酵母細(xì)胞沉淀除去。

利用釀酒酵母全細(xì)胞反應(yīng)純化gos粗品

將gos上清液稀釋至總碳水化合物濃度為50g/l，加入100g/l釀酒酵母全細(xì)胞，反應(yīng)條件為40℃，ph10.0，攪拌轉(zhuǎn)速500rpm，每3小時(shí)取一個(gè)樣，通過(guò)hplc檢測(cè)gos、乳糖、葡萄糖和半乳糖濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，隨著純化時(shí)間的延長(zhǎng)，乳糖、葡萄糖和半乳糖不斷被消耗，而gos不被降解消耗，純化12h后，乳糖、葡萄糖和半乳糖幾乎被完全消耗，實(shí)現(xiàn)了gos的純化。經(jīng)過(guò)15000rpm離心1min，得到純化后gos上清液和釀酒酵母全細(xì)胞沉淀，純化后gos上清液經(jīng)過(guò)蒸餾濃縮得到純度為99％的gos產(chǎn)品，釀酒酵母全細(xì)胞沉淀除去。

實(shí)施例三

含β-半乳糖苷酶胞內(nèi)酶的乳酸克魯維酵母全細(xì)胞的發(fā)酵制備

將保存的乳酸克魯維酵母菌種接種至平板固體lb培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)72h，制得活化單菌落。取活化的單菌落接種至液體lb培養(yǎng)基中，30℃、160rpm震蕩擴(kuò)大培養(yǎng)20h，得到種子培養(yǎng)液。在7-l發(fā)酵罐中，將200ml種子培養(yǎng)液接入4l發(fā)酵培養(yǎng)基中，在初始ph值8.48，轉(zhuǎn)速200rpm，通氣量1vvm，溫度27.6℃條件下培養(yǎng)16h，獲得發(fā)酵液，離心分離得到乳酸克魯維酵母全細(xì)胞沉淀和發(fā)酵上清液，乳酸克魯維酵母全細(xì)胞沉淀用于透性化處理和gos粗品的反應(yīng)純化，發(fā)酵上清液用于蒸餾濃縮。發(fā)酵培養(yǎng)基配方如下：乳糖60g/l，蛋白胨5g/l，酵母膏12g/l，121℃滅菌20min。

利用乙醇溶液透性化處理乳酸克魯維酵母全細(xì)胞

所得發(fā)酵上清液含有濃度為30g/l的乙醇，通過(guò)蒸餾濃縮(溫度為80℃)獲得35％(v/v)乙醇溶液，利用35％(v/v)的乙醇溶液對(duì)濃度為50g/l乳酸克魯維酵母全細(xì)胞在室溫下進(jìn)行透性化處理2min，離心分離獲得乙醇處理液和透性化乳酸克魯維酵母細(xì)胞沉淀，乙醇處理液繼續(xù)用于透性化處理，可重復(fù)3次，向透性化乳酸克魯維酵母細(xì)胞沉淀加入5％(w/v)ph值為8的濃度為50mmol/l磷酸鈉緩沖液洗滌，再離心除去上清液，獲得透性化細(xì)胞。

利用透性化乳酸克魯維酵母細(xì)胞催化乳糖制備gos

配制乳糖溶液至質(zhì)量濃度為400g/l，加入18.87g/l透性化乳酸克魯維酵母細(xì)胞，反應(yīng)條件為溫度40℃，ph8.0，攪拌轉(zhuǎn)速150rpm，每20分鐘取一個(gè)樣，通過(guò)hplc檢測(cè)gos、乳糖、葡萄糖和半乳糖濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示，反應(yīng)1.5h后，得到gos粗品，其含有35.0％的gos，27.4％的殘留乳糖，25.2％副產(chǎn)物葡萄糖和12.4％副產(chǎn)物半乳糖。經(jīng)過(guò)5000rpm離心5min，獲得gos上清液和透性化乳酸克魯維酵母細(xì)胞沉淀，gos上清液用于反應(yīng)純化，透性化乳酸克魯維酵母細(xì)胞沉淀繼續(xù)用于催化乳糖制備gos，可重復(fù)循環(huán)利用，如圖7所示，透性化細(xì)胞重復(fù)利用14次，gos粗品的得率維持在34.8％～35.7％之間。

利用乳酸克魯維酵母全細(xì)胞反應(yīng)純化gos粗品

將gos粗品稀釋至總碳水化合物濃度為100g/l，加入15g/l乳酸克魯維酵母全細(xì)胞，反應(yīng)條件為30℃，ph8.0，攪拌轉(zhuǎn)速150rpm，每小時(shí)取一個(gè)樣，通過(guò)hplc檢測(cè)gos、乳糖、葡萄糖和半乳糖濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8所示，隨著純化時(shí)間的延長(zhǎng)，乳糖、葡萄糖和半乳糖不斷被消耗，而gos不被降解消耗，純化15h后，乳糖、葡萄糖和半乳糖幾乎被完全消耗，實(shí)現(xiàn)了gos的純化。經(jīng)過(guò)5000rpm離心5min，得到純化后gos上清液和乳酸克魯維酵母全細(xì)胞沉淀，純化后gos上清液經(jīng)過(guò)蒸餾濃縮得到濃度為35％(v/v)的高濃度乙醇和濃縮的高純度gos產(chǎn)品，乳酸克魯維酵母全細(xì)胞沉淀繼續(xù)用于反應(yīng)純化，可重復(fù)循環(huán)利用，如圖9所示，重復(fù)利用9次以上，gos的純度維持在95％～99％。

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