技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于食品生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株用于合成低聚半乳糖的解脂亞羅威酵母(Yarrowialipolytica)CGMCCNO.11369菌株，及其用乳糖合成低聚半乳糖的方法。

背景技術(shù)

低聚半乳糖(Galactooligosaccharides，GOS)是一類非消化性短鏈聚糖(non-digestiblepolysaccharides)，聚合度大多是3-6(即：低聚三糖，低聚四糖，低聚五糖以及低聚六糖)，即在半乳糖分子的還原端聚合1-4分子的半乳糖，半乳糖分子之間大多以β-1，6-糖苷鍵連接，少數(shù)以β-1，4-糖苷鍵連接。

低聚半乳糖具有優(yōu)良的物理性質(zhì)。具有很好的保濕效果以及高的溶解性能，在高溫以及低pH值下很穩(wěn)定，在180℃或者pH＝3的條件下幾乎不水解，每克的熱量只有1.7Kcal(Sakaetal.1999.Recentprogressonresearchandapplicationofnon-digestiblegalacto-oligosaccharides.IntDairy，9：69-80)。

低聚半乳糖還具有優(yōu)良的生理特性。它通過(guò)機(jī)體小腸不會(huì)被分解吸收，只有通過(guò)大腸的過(guò)程中才會(huì)被其中的有益菌群分解吸收，能顯著的促進(jìn)有益菌群的增殖，并合成對(duì)機(jī)體有益的揮發(fā)性短鏈脂肪酸如乙酸、丙酸、丁酸，這些短鏈脂肪酸還能降低消化道的pH值，抑制有害菌群的增殖(MacfarlaneGT，etal.2008.Bacterialmetabolismandhealth-relatedeffectsofgalacto-oligosaccharidesandotherprebiotics.JournalofAppliedMicrobiology，104：305-344)。還能有效地降低消化道有毒物質(zhì)的累積，降低大腸癌的發(fā)生，促進(jìn)礦物質(zhì)元素的吸收，降低脂的含量(NiittyenL，etal.2007.Galacto-oligosaccharidesandbowelfunction.ScandinavianJournalofFoodandNutrition，51：62-66)。由于低聚半乳糖能提高有益菌群尤其是雙歧桿菌類菌群的增殖，最新研究發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌能顯著降低機(jī)體的膽固醇的含量(Zanottietal.2015.Evidenceforcholesterol-loweringactivitybyBifidobacteriumbifidumPRL2010throughgutmicrobiotamodulation.AppliedMicrobiologyandBiotechnology，99：6813-6829)。

由于低聚半乳糖具有良好的物理性質(zhì)與生理特性，歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家早在十年前就批準(zhǔn)其作為食品配料，在烘焙食品、發(fā)酵乳制品、乳粉(包括嬰幼兒奶制品)、釀造品中添加使用。我國(guó)在2008年也批準(zhǔn)其作為新資源食品，允許在乳粉中添加使用。隨著低聚半乳糖的市場(chǎng)也逐年增加，研究其先進(jìn)的生產(chǎn)方法就具有重要的價(jià)值。

迄今為止，已經(jīng)有很多文獻(xiàn)報(bào)道以乳糖為原料合成低聚半乳糖的方法。這些方法主要分成兩種，一種是采用酶轉(zhuǎn)化的方法，另一種是采用細(xì)胞轉(zhuǎn)化的方法。這兩種方法還可以分別采取游離的或者固定化的形式進(jìn)行轉(zhuǎn)化。如采用游離的酶或者固定化的酶，采用游離的細(xì)胞或者固定化的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化。VeraCarlos等人采用來(lái)自米曲霉的β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)轉(zhuǎn)化40％乳糖，在55℃條件下轉(zhuǎn)化，最高得到27％的轉(zhuǎn)化率(生成的低聚半乳糖與起始乳糖的質(zhì)量比)(VeraC，etal.2012.Synthesisofgalacto-oligosaccharidesbyβ-galactosidasefromAspergillusoryzaeusingpartiallydissolvedandsupersaturatedsolutionoflactose.EnzymeandMicrobialTechnology，50：188-194.)。中國(guó)發(fā)明專利CN201210172977.2描述了一種采用來(lái)自環(huán)狀芽孢桿菌的β-半乳糖苷酶，并將該酶進(jìn)行固定化來(lái)轉(zhuǎn)化乳糖生成低聚半乳糖。首先發(fā)酵環(huán)狀芽孢桿菌得到酶液，再用戊二醛進(jìn)行固定在樹(shù)脂上，然后以固定酶的樹(shù)脂進(jìn)行轉(zhuǎn)化。AlbayrakN與YangS等人采用多層棉布固定米曲霉的β-半乳糖苷酶轉(zhuǎn)化乳糖合成低聚半乳糖，在200克/升與400克/升的乳糖溶液中轉(zhuǎn)化分別獲得21％與26％的轉(zhuǎn)化率(Albayraketal.2002.Productionofgalacto-oligosaccharidesfromlactosebyAspergillusoryzaeβ-galactosidaseimmobilizedoncottoncloth.BiotechnologyandBioengineering，77：8-19)。上述酶轉(zhuǎn)化的方法需要購(gòu)買或者自行制備純酶，成本較高。而且固定酶的制備步驟較多，首選需要發(fā)酵培養(yǎng)芽孢桿菌，然后分離酶液，再進(jìn)行固定，存在固定效率低下，需要固定介質(zhì)等問(wèn)題。

由于酶的成本較大，使用細(xì)胞直接發(fā)酵合成低聚半乳糖的方法也得到使用。中國(guó)發(fā)明專利CN200910018452.1描述了一種采用米曲霉(Aspergillusoryzae)直接發(fā)酵乳糖合成低聚半乳糖的方法。該方法在含有碳源(包含20-40％底物乳糖)、氮源以及無(wú)機(jī)鹽的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)米曲霉，曲霉細(xì)胞一邊生長(zhǎng)一邊轉(zhuǎn)化乳糖合成低聚半乳糖。該方法雖然不需要單獨(dú)制備酶，但由于發(fā)酵培養(yǎng)基的成分復(fù)雜，細(xì)胞無(wú)法全部將加入的營(yíng)養(yǎng)成分利用完全，而且還會(huì)產(chǎn)生初級(jí)或者次級(jí)代謝產(chǎn)物，因此發(fā)酵產(chǎn)物除了含有低聚半乳糖外，還含有其它未知成分，增加了低聚半乳糖分離的難度與成本。而采用細(xì)胞轉(zhuǎn)化的方法則能降低培養(yǎng)副產(chǎn)物成分，提高產(chǎn)物的純度。因此，采用固定化細(xì)胞轉(zhuǎn)化的方法也得到一定的使用。雖然固定化細(xì)胞合成低聚半乳糖具有能循環(huán)使用以及使用周期較長(zhǎng)的優(yōu)點(diǎn)，但是細(xì)胞的固定化與酶的固定化一樣，存在步驟較多，需要使用戊二醛等有機(jī)溶劑，在反復(fù)使用的過(guò)程中細(xì)胞容易脫落以及污染，而且固定化的過(guò)程中存在固定化效率的問(wèn)題，使得很多細(xì)胞沒(méi)有被固定未得到利用，同時(shí)固定化柱的制備需要介質(zhì)(比如微孔樹(shù)脂、殼聚糖、纖維素珠、瓊脂糖珠等)，本身也增加了成本，難以大規(guī)模使用。

因此，研究開(kāi)發(fā)一種即能夠自我合成β-半乳糖苷酶，又具有類似固定化酶能循環(huán)利用，并且容易高密度培養(yǎng)的微生物對(duì)于提高低聚半乳糖的合成效率、降低生產(chǎn)成本具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有的酶合成或細(xì)胞合成低聚半乳糖的不足之處，提供了一株合成低聚半乳糖的專用菌株及用其合成低聚半乳糖的方法。本發(fā)明提供的能合成β-半乳糖苷酶的解脂亞羅威酵母(Yarrowialipolytica)CGMCCNO.11369菌株，該菌株除了具備出發(fā)菌株的性能之外(合成赤蘚糖醇)，還具有出發(fā)菌株所沒(méi)有的功能，即：能合成低聚半乳糖。因此可以用合成赤蘚糖醇后的酵母泥作為細(xì)胞催化劑，再轉(zhuǎn)化乳糖生成低聚半乳糖，還可以直接培養(yǎng)細(xì)胞發(fā)酵乳糖合成低聚半乳糖。

本發(fā)明中使用的合成低聚半乳糖的酵母菌株是解脂亞羅威酵母(Yarrowialipolytica)，已經(jīng)于2015年9月14日保存于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)，保藏編號(hào)為CGMCCNo.11369。

本發(fā)明所使用的解脂亞羅威酵母(Yarrowialipolytica)CGMCCNO.11369來(lái)源于出發(fā)菌株解脂亞羅酵母(YarrowialipolyticaBLC13)CGMCCNO.7326，該菌株在中國(guó)發(fā)明專利ZL201310282059.X中已經(jīng)做了描述，該菌株不能同化乳糖，不能在含乳糖為唯一碳源的基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)繁殖(基本培養(yǎng)基成分：酵母氮堿6.7克/升，硫酸銨5克/升，乳糖10克/升，pH6.0)。而本發(fā)明所采用的酵母菌株--解脂亞羅威酵母(Yarrowialipolytica)CGMCCNO.11369含有β-半乳糖苷酶基因，該基因編碼產(chǎn)物具有水解酶活性，也具有糖基轉(zhuǎn)移酶活性。能將乳糖分解為D-半乳糖與D-葡萄糖，能在含乳糖為唯一碳源的基本培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，同時(shí)合成低聚半乳糖。因此，本發(fā)明使用的解脂亞羅威酵母(Yarrowialipolytica)CGMCCNO.11369菌株不但能合成赤蘚糖醇，還具備新的特性，能同化乳糖并合成低聚半乳糖。這是第一次報(bào)道能夠以乳糖為底物合成低聚半乳糖的解脂亞羅威酵母，具有發(fā)明創(chuàng)造性。

本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：

第一方面，本發(fā)明涉及一種解脂亞羅威酵母(Yarrowialipolytica)CGMCCNO.11369。該酵母能合成β-半乳糖苷酶。

第二方面，本發(fā)明涉及所述的解脂亞羅威酵母菌株在合成低聚半乳糖中的用途。

第三方面，本發(fā)明涉及所述的解脂亞羅威酵母菌株用于合成低聚半乳糖的方法，所述方法包括如下步驟：

S1、將解脂亞羅威酵母(Yarrowialipolytica)CGMCCNO.11369菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后菌液分離得到解脂亞羅威酵母(Yarrowialipolytica)CGMCCNO.11369細(xì)胞；

S2、在分離得到的細(xì)胞中加入乳糖水溶液，在40～60℃，pH4.0～8.0條件下振蕩或攪拌，進(jìn)行轉(zhuǎn)化合成低聚半乳糖。

優(yōu)選的，所述發(fā)酵培養(yǎng)為高密度發(fā)酵培養(yǎng)；該高密度發(fā)酵培養(yǎng)采用的培養(yǎng)基為含碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽以及水的培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為在pH值3.0～8.0，溫度25～35℃條件下振蕩或者攪拌。優(yōu)選發(fā)酵pH值為5.0～7.0。更優(yōu)選發(fā)酵溫度為28℃～32℃，最優(yōu)選30℃。所述發(fā)酵培養(yǎng)也可為常規(guī)發(fā)酵培養(yǎng)，其采用的發(fā)酵培養(yǎng)基以及培養(yǎng)條件同上述的高密度發(fā)酵培養(yǎng)。

優(yōu)選的，所述高密度發(fā)酵培養(yǎng)還包括如下步驟：經(jīng)過(guò)多級(jí)(一級(jí)、二級(jí)甚至是三級(jí))擴(kuò)大培養(yǎng)，以得到更多的所述酵母細(xì)胞。高密度培養(yǎng)中的高密度是指在吸光度600納米下細(xì)胞密度達(dá)到50及以上，常規(guī)發(fā)酵培養(yǎng)是指在吸光度600納米下細(xì)胞密度達(dá)到50以下。

優(yōu)選的，所述碳源為固體葡萄糖、葡萄糖母液中的一種或兩種，碳源用量為10～100克/升；所述氮源為蛋白胨、酵母粉、酵母浸膏、玉米漿干粉、玉米漿、磷酸氫二銨中的一種或幾種的混合，氮源的用量為5～25克/升；所述無(wú)機(jī)鹽為硫酸鎂、氯化錳、氯化銅中的一種或幾種，無(wú)機(jī)鹽用量為0～2.5克/升。更優(yōu)選碳源用量為25～100克/升。更優(yōu)選氮源為磷酸氫二銨、酵母粉、玉米漿干粉中的一種或幾種，氮源用量為5～22.5克/升。更優(yōu)選無(wú)機(jī)鹽用量為0.01～2克/升，最優(yōu)選為1～2克/升。

優(yōu)選的，所述發(fā)酵培養(yǎng)為高濃度碳源的發(fā)酵培養(yǎng)；該高濃度碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基為含高濃度碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽以及水的培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為在pH值3～8，溫度25～35℃條件下振蕩或者攪拌。

優(yōu)選的，所述高濃度碳源為固體葡萄糖、葡萄糖漿、葡萄糖母液中的一種或多種，折合葡萄糖含量為200～300克/升；所述氮源為酵母粉、酵母浸膏、玉米漿干粉、玉米漿、磷酸氫二銨中的一種或幾種的混合，氮源的用量為5～25克/升；所述無(wú)機(jī)鹽為硫酸鎂、氯化錳、氯化銅中的一種或幾種，無(wú)機(jī)鹽用量為0.01～2克/升。

采用高濃度碳源的發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)，菌液分離得到的上清液為含有赤蘚糖醇的溶液，用于純化分離赤蘚糖醇，沉淀為解脂亞羅威酵母(Yarrowialipolytica)CGMCCNO.11369細(xì)胞。

優(yōu)選的，采用高濃度碳源的發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)，步驟S2中可選擇加入葡萄糖氧化酶以及過(guò)氧化氫酶進(jìn)行轉(zhuǎn)化合成低聚半乳糖。

優(yōu)選的，步驟S2中的乳糖水溶液濃度為200～600克/升；更優(yōu)選為300～500克/升；最優(yōu)選為400克/升。

優(yōu)選的，步驟S2中轉(zhuǎn)化溫度為40～60℃，最優(yōu)選為40～55℃。轉(zhuǎn)化pH值優(yōu)選為5.0～7.0；更優(yōu)選為5.5～6.5。

優(yōu)選的，所述步驟S2后還包括當(dāng)轉(zhuǎn)化液中低聚半乳糖的含量不再增加時(shí)停止轉(zhuǎn)化，進(jìn)行純化精制，得到液體或者粉狀低聚半乳糖的步驟。低聚半乳糖的含量不再增加是指在連續(xù)轉(zhuǎn)化5小時(shí)期間，低聚半乳糖的含量沒(méi)有顯著的變化，這時(shí)可以停止轉(zhuǎn)化。所述純化精制包括：過(guò)濾分離細(xì)胞、濃縮、脫色、離子交換、納濾、噴霧干燥等工序。這些工序方法均為行業(yè)內(nèi)的通識(shí)方法。

優(yōu)選的，停止轉(zhuǎn)化后，過(guò)濾得到的細(xì)胞還可以循環(huán)利用3～5次，按照步驟S2的條件進(jìn)行轉(zhuǎn)化乳糖。

轉(zhuǎn)化得到的低聚半乳糖溶液經(jīng)過(guò)濃縮，離子交換，脫色，色譜分離、干燥等工藝，可以得到低聚半乳糖糖漿或者低聚半乳糖粉。這些工藝都是本領(lǐng)域內(nèi)常用的通識(shí)方法，一般技術(shù)人員既能掌握使用。

本發(fā)明提供的能合成低聚半乳糖的解脂亞羅威酵母(Yarrowialipolytica)CGMCCNo.11369是通過(guò)以下方法制備的：

合成β-半乳糖苷酶編碼序列的表達(dá)盒，并將該表達(dá)盒轉(zhuǎn)化出發(fā)菌株--解脂亞羅酵母(Yarrowialipolytica)CGMCC7326，在含乳糖為唯一碳源的基本培養(yǎng)基中篩選，只有含有β-半乳糖苷酶編碼序列的表達(dá)盒的酵母轉(zhuǎn)化子才能利用乳糖，將乳糖分解為葡萄糖與半乳糖(請(qǐng)見(jiàn)實(shí)施例1)，并長(zhǎng)出單菌落克隆，該單菌落克隆能轉(zhuǎn)化乳糖合成低聚半乳糖。β-半乳糖苷酶編碼序列的表達(dá)盒包含以下脫氧核糖核酸元件：5’端同源臂脫氧核糖核酸序列、啟動(dòng)子脫氧核糖核酸序列、β-半乳糖苷酶編碼序列、終止子脫氧核糖核酸序列以及3’端同源臂脫氧核糖核酸序列。表達(dá)盒中各脫氧核糖核酸元件按照如下順序連接：5’端同源臂脫氧核糖核酸序列+啟動(dòng)子脫氧核糖核酸序列+β-半乳糖苷酶編碼序列+終止子脫氧核糖核酸序列+3’端同源臂脫氧核糖核酸序列。同源臂序列可以為來(lái)自Yarrowialipolytica酵母自身的URA3編碼的序列，也可以為L(zhǎng)EU2編碼的序列，也可以為其自身核糖體18S核糖體脫氧核糖核酸編碼序列，也可以為長(zhǎng)末端重復(fù)脫氧核糖核酸序列(Zeta序列)等。啟動(dòng)子脫氧核糖核酸序列可以為來(lái)自Yarrowialipolytica酵母自身的任意編碼序列的啟動(dòng)子脫氧核糖核酸序列，比如TEF1編碼序列(轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)因子1編碼序列)的啟動(dòng)子，也可以為hp4d啟動(dòng)子(雜合啟動(dòng)子)，也可以為GPD編碼序列(3-磷酸甘油醛脫氫酶編碼序列)啟動(dòng)子，也可以是1，6-二磷酸果糖裂解酶編碼序列(FBA)的啟動(dòng)子，也可以是XPR2編碼序列的啟動(dòng)子等。β-半乳糖苷酶編碼序列可以是來(lái)自曲霉菌的β-半乳糖苷酶編碼序列，如黑曲霉(Aspergillusniger)，米曲霉(Aspergillusoryzae)，日本曲霉(Aspergillusjaponicus)等，也可以是來(lái)自酵母的β-半乳糖苷酶編碼序列，如來(lái)自乳酸克魯維酵母，還可以是來(lái)自細(xì)菌的β-半乳糖苷酶編碼序列，如來(lái)自環(huán)狀芽孢桿菌的β-半乳糖苷酶編碼序列。終止子脫氧核糖核酸序列可以為來(lái)自Yarrowialipolytica酵母的任何編碼序列的終止子脫氧核糖核酸序列，如TEF1編碼序列的終止子脫氧核糖核酸序列，也可以是XPR2編碼序列的終止子脫氧核糖核酸序列等。上述啟動(dòng)子脫氧核糖核酸序列、β-半乳糖苷酶編碼序列、終止子脫氧核糖核酸序列在公共數(shù)據(jù)庫(kù)中都已公開(kāi)，如在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中都能查詢并免費(fèi)得到序列。合成基因的表達(dá)盒的技術(shù)目前也是很成熟的技術(shù)，一般的基因合成公司都能合成。本發(fā)明使用的分子生物學(xué)技術(shù)(如脫氧核糖核酸元件的連接、轉(zhuǎn)化等)都是本領(lǐng)域的通用的公開(kāi)的技術(shù)。而且，本發(fā)明所使用的脫氧核糖核酸元件均來(lái)自食品安全的微生物，比如同源臂脫氧核糖核酸元件、啟動(dòng)子元件以及終止子元件都是來(lái)自Yarrowialipolytica，該酵母是合成赤蘚糖醇的安全菌株。β-半乳糖苷酶編碼序列來(lái)自黑曲霉、米曲霉、日本曲霉、環(huán)狀芽孢桿菌、乳酸克魯維酵母等，都是食品安全微生物。本發(fā)明提供的合成低聚半乳糖的專用菌株含有上述β-半乳糖苷酶編碼序列的表達(dá)盒，是食品安全的微生物。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

1.相比現(xiàn)有的曲霉細(xì)胞培養(yǎng)(米曲霉、黑曲霉等)，本發(fā)明采用的解脂亞羅威酵母(Yarrowialipolytica)CGMCCNO.11369更容易進(jìn)行液體深層培養(yǎng)發(fā)酵，更容易進(jìn)行高密度培養(yǎng)以獲得更多的細(xì)胞。而曲霉在培養(yǎng)過(guò)程中容易菌絲體成團(tuán)，不容易高密度培養(yǎng)。

2.由于解脂亞羅威酵母(Yarrowialipolytica)CGMCCNO.11369本身能高效率合成β-半乳糖苷酶，較其它野生型的酵母(如乳酸克魯維酵母)合成酶的效率更高。因此，無(wú)需購(gòu)買酶，能有效降低合成低聚半乳糖的成本。

3.解脂亞羅威酵母(Yarrowialipolytica)CGMCCNO.11369可以被循環(huán)利用3-5次，轉(zhuǎn)化乳糖合成低聚半乳糖，而采用游離的β-半乳糖苷酶只能被利用一次。

4.解脂亞羅威酵母(Yarrowialipolytica)CGMCCNO.11369還可以來(lái)自發(fā)酵赤蘚糖醇后經(jīng)過(guò)過(guò)濾得到的廢酵母泥，有效提高了資源的利用率。由于解脂亞羅威酵母(Yarrowialipolytica)CGMCCNO.11369來(lái)自于解脂亞羅酵母(Yarrowialipolytica)BLC13CGMCCNO.7326，具備其合成赤蘚糖醇的特性，同時(shí)又具備了合成低聚半乳糖的新性能。因此，可以先用其來(lái)合成赤蘚糖醇，再用得到的酵母細(xì)胞用來(lái)轉(zhuǎn)化乳糖合成低聚半乳糖，充分利用了酵母資源。

附圖說(shuō)明

通過(guò)閱讀參照以下附圖對(duì)非限制性實(shí)施例所作的詳細(xì)描述，本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點(diǎn)將會(huì)變得更明顯：

圖1為出發(fā)菌株解脂亞羅酵母CGMCCNO.7326以及解脂亞羅威酵母(Yarrowialipolytica)CGMCCNO.11369分解乳糖的HPLC分析圖；其中，A為出發(fā)菌株解脂亞羅酵母CGMCCNO.7326在含乳糖的基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天的HPLC分析；B為含有β-半乳糖苷酶編碼序列的新菌株解脂亞羅威酵母CGMCCNO.11369在含有乳糖的基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天的HPLC分析；

圖2為14.5克濕細(xì)胞轉(zhuǎn)化50毫升200克/升的乳糖水溶液結(jié)束時(shí)HPLC分析；

圖3為17.5克濕重細(xì)胞轉(zhuǎn)化50毫升400克/升的乳糖水溶液結(jié)束時(shí)HPLC分析；

圖4為在轉(zhuǎn)化反應(yīng)液中加入葡萄糖氧化酶以及過(guò)氧化氫酶后的HPLC圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。以下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干調(diào)整和改進(jìn)。這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

解脂亞羅威酵母屬于公認(rèn)安全的酵母菌株，在食品發(fā)酵領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用。有的能高效合成檸檬酸，有的能高效合成赤蘚糖醇，有的能高效由果糖合成甘露醇。同時(shí)，該酵母也是常用的異源蛋白表達(dá)宿主，用于高效表達(dá)具有功能的酶(Nicaudetal，ProteinexpressionandsecretionintheyeastYarrowialipolytica.FEMSYeastResearch，2002，Vol2：371-379)。我們經(jīng)過(guò)研究，以合成赤蘚糖醇的解脂亞羅酵母(Yarrowialipolytica)BLC13CGMCCNo.7326為出發(fā)菌株構(gòu)建了一株能夠合成β-半乳糖苷酶的新菌株解脂亞羅威酵母(Yarrowialipolytica)CGMCCNO.11369，該菌株除了能合成赤蘚糖醇外，還能夠由乳糖合成低聚半乳糖，并能夠高密度培養(yǎng)。因此，在利用該新菌株解脂亞羅威酵母(Yarrowialipolytica)CGMCCNO.11369合成赤蘚糖醇后，得到的酵母泥可以再用來(lái)轉(zhuǎn)化乳糖合成低聚半乳糖，充分利用了酵母資源，省卻了培養(yǎng)細(xì)胞的成本。

實(shí)施例1、解脂亞羅威酵母(yarrowialipolytica)CGMCCNO.11369能分解乳糖

由于解脂亞羅威酵母(Yarrowialipolytica)CGMCCNO.11369來(lái)源于解脂亞羅酵母(YarrowialipolyticaBLC13)CGMCCNO.7326，解脂亞羅酵母CGMCCNO.7326不能分解乳糖，不能在含乳糖為唯一碳源的基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)(基本培養(yǎng)基成分：乳糖10克/升，酵母氮堿6.7克/升，硫酸銨5克/升，pH6.0)。而解脂亞羅威酵母CGMCC11369含有β-半乳糖苷酶編碼序列，編碼翻譯的β-半乳糖苷酶是一個(gè)雙功能酶，即具有半乳糖基轉(zhuǎn)移功能，還具有水解乳糖的功能，水解乳糖釋放出葡萄糖，而釋放的葡萄糖能作為碳源支持其生長(zhǎng)。因此，解脂亞羅威酵母CGMCCNO.11369能在含乳糖為唯一碳源的基本培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。將解脂亞羅威酵母CGMCCNO.11369接種在含10克/升的乳糖的基本液體培養(yǎng)基中(乳糖：10克/升，酵母氮堿6.7克/升，硫酸銨5克/升，pH6.0)，在30℃培養(yǎng)60小時(shí)，HPLC分析，乳糖部分解為半乳糖為葡萄糖，同時(shí)測(cè)定細(xì)胞在600納米的吸光值，由培養(yǎng)0時(shí)的0.12提高到9.4。分解蔗糖的HPLC分析圖如圖1所示；保留時(shí)間8.115min為乳糖，8.623min為葡萄糖，10.023min為半乳糖。由圖1可見(jiàn)，新菌株解脂亞羅威酵母(Yarrowialipolytica)CGMCCNO.11369能分解乳糖，而出發(fā)菌株解脂亞羅酵母CGMCCN0.7326不能分解乳糖，新菌株獲得了新的性能。

實(shí)施例2、轉(zhuǎn)化200克/升乳糖合成低聚半乳糖

按照如下步驟實(shí)施：

(1)在50毫升發(fā)酵培養(yǎng)基中接種解脂亞羅威酵母(Yarrowialipolytica)CGMCCNO.11369。發(fā)酵培養(yǎng)基的成分為(克/升)：葡萄糖25，酵母粉2.5，蛋白胨2.0克，磷酸氫二銨0.5，硫酸鎂2，pH3.0。

(2)接種后在25℃振蕩培養(yǎng)直到葡萄糖消耗完全即停止培養(yǎng)。

(3)離心保留細(xì)胞，獲得14.5克濕細(xì)胞。將細(xì)胞用無(wú)菌水洗滌1次，再用50毫升200克/升的乳糖水溶液懸浮細(xì)胞，調(diào)節(jié)pH至4.0，在40℃振蕩轉(zhuǎn)化。

(4)每隔5小時(shí)取樣HPLC檢測(cè)低聚半乳糖生成的量，在連續(xù)5小時(shí)期間若低聚半乳糖的量沒(méi)有增加(或者略微減少)即停止轉(zhuǎn)化(25小時(shí))。

(5)離心，菌液分離。此時(shí)HPLC檢測(cè)蔗糖轉(zhuǎn)化為低聚半乳糖的轉(zhuǎn)化率為22％。在乳糖濃度比較低的情況下，由乳糖轉(zhuǎn)化合成低聚半乳糖的轉(zhuǎn)化率也比較低。HPLC檢測(cè)圖如圖2所示，圖2中，保留時(shí)間7.710min與8.088min為低聚半乳糖；8.635min為未轉(zhuǎn)化完的乳糖；9.455min為葡萄糖；9.917min為半乳糖。

實(shí)施例3、轉(zhuǎn)化400克/升乳糖合成低聚半乳糖

按照如下步驟實(shí)施：

(1)在50毫升發(fā)酵培養(yǎng)基中接種解脂亞羅威酵母(Yarrowialipolytica)CGMCCNO.11369。發(fā)酵培養(yǎng)基的成分為(克/升)：葡萄糖50，酵母粉5，玉米漿干粉10克，磷酸氫二銨5，硫酸鎂1.5，pH8。

(2)接種后在35℃振蕩培養(yǎng)直到葡萄糖消耗完全即停止培養(yǎng)。

(3)離心保留細(xì)胞，獲得17.5克濕細(xì)胞。將細(xì)胞用無(wú)菌水洗滌1次，再用50毫升400克/升的乳糖水溶液懸浮細(xì)胞，調(diào)節(jié)pH至8，在60℃振蕩轉(zhuǎn)化。

(4)每隔3小時(shí)取樣HPLC檢測(cè)低聚果糖生成的量，在連續(xù)5小時(shí)期間若低聚果糖的量沒(méi)有增加(或者略微減少)即停止轉(zhuǎn)化(25小時(shí))。

(5)轉(zhuǎn)化結(jié)束后離心，菌液分離。此時(shí)HPLC檢測(cè)蔗糖轉(zhuǎn)化為低聚果糖的轉(zhuǎn)化率為35％。HPLC檢測(cè)轉(zhuǎn)化反應(yīng)液結(jié)果如圖3所示，圖3中，保留時(shí)間7.735min與8.112min為低聚半乳糖；8.655min為未轉(zhuǎn)化完的乳糖；9.470min為葡萄糖；9.953min為半乳糖。

實(shí)施例4、轉(zhuǎn)化600克/升乳糖合成低聚半乳糖

(1)在50毫升發(fā)酵培養(yǎng)基中接種解脂亞羅威酵母(Yarrowialipolytica)CGMCCNO.11369。發(fā)酵培養(yǎng)基的成分為(克/升)：葡萄糖100，酵母粉5，玉米漿干粉15克，磷酸氫二銨2.5，硫酸鎂1，氯化錳0.005，pH5.5。

(2)接種后在30℃振蕩培養(yǎng)直到葡萄糖消耗完全即停止培養(yǎng)。

(3)離心保留細(xì)胞，獲得20.5克濕細(xì)胞。將細(xì)胞用無(wú)菌水洗滌1次，再用50毫升600克/升的乳糖水溶液懸浮細(xì)胞，調(diào)節(jié)pH至6.0，在50℃振蕩轉(zhuǎn)化。

(4)每隔5小時(shí)取樣HPLC檢測(cè)低聚半乳糖生成的量，在連續(xù)5小時(shí)期間若低聚乳糖糖的量沒(méi)有增加(或者略微減少)即停止轉(zhuǎn)化(45小時(shí))。

(5)轉(zhuǎn)化結(jié)束后離心，菌液分離。此時(shí)HPLC檢測(cè)乳糖轉(zhuǎn)化為低聚半乳糖的轉(zhuǎn)化率為40.5％。

實(shí)施例5、在發(fā)酵罐中合成低聚半乳糖

(1)在3升發(fā)酵罐中先培養(yǎng)解脂亞羅威酵母(Yarrowialipolytica)CGMCCNO.11369。培養(yǎng)基的成分為(克/升)：葡萄糖50，蛋白胨5，玉米漿干粉10克，磷酸氫二銨2.5，硫酸鎂1.5，氯化錳0.005，pH6.0。

(2)接種后在30℃攪拌培養(yǎng)，通氣，葡萄糖消耗完后再進(jìn)行補(bǔ)料葡萄糖，直到細(xì)胞密度達(dá)到80即停止培養(yǎng)(進(jìn)行高密度培養(yǎng))。

(3)離心保留細(xì)胞，獲得337克濕細(xì)胞。將細(xì)胞用無(wú)菌水洗滌1次，再用2000毫升400克/升的乳糖水溶液懸浮細(xì)胞，裝入發(fā)酵罐，調(diào)節(jié)pH至5.5，在50℃攪拌轉(zhuǎn)化。

(4)每隔5小時(shí)取樣HPLC檢測(cè)低聚半乳糖生成的量，在連續(xù)5小時(shí)期間若低聚半乳糖的量沒(méi)有增加(或者略微減少)即停止轉(zhuǎn)化(50小時(shí))。

(5)轉(zhuǎn)化結(jié)束后離心，菌液分離。此時(shí)HPLC檢測(cè)乳糖轉(zhuǎn)化為低聚半乳糖的轉(zhuǎn)化率為41.5％。

(6)離心后得到的細(xì)胞沉淀再加入2000毫升400克/升的乳糖水溶液，懸浮細(xì)胞，裝入發(fā)酵罐，調(diào)節(jié)pH至5.5，在50℃攪拌轉(zhuǎn)化。每隔5小時(shí)取樣HPLC檢測(cè)低聚半乳糖的合成量，在連續(xù)5小時(shí)期間若低聚半乳糖的量沒(méi)有增加(或者略微減少)即停止轉(zhuǎn)化，檢測(cè)分析，細(xì)胞第二次轉(zhuǎn)化率為38.5％，保留90％的酶活力。細(xì)胞依次重復(fù)使用3次。第三次的轉(zhuǎn)化率為34.5％。

實(shí)施例6、先發(fā)酵合成赤蘚糖醇，再以廢酵母泥轉(zhuǎn)化合成低聚半乳糖(1)

(1)在含500毫升發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中接種解脂亞羅威酵母(Yarrowialipolytica)CGMCCNO.11369。發(fā)酵培養(yǎng)基的成分為(克/升)：葡萄糖200，酵母粉2.5，玉米漿干粉2.5，硫酸鎂1，氯化錳0.005，氯化銅0.002，pH6.5。

(2)接種后在30℃，好氧振蕩培養(yǎng)直到葡萄糖全部轉(zhuǎn)化為赤蘚糖醇后即停止發(fā)酵。

(3)離心，上清依次經(jīng)過(guò)脫色、濃縮、離子交換、再濃縮、結(jié)晶的步驟提取赤蘚糖醇，這些步驟均為本領(lǐng)域內(nèi)常用的通識(shí)方法。得到細(xì)胞沉淀用于轉(zhuǎn)化。獲得57.5克濕細(xì)胞。將細(xì)胞用無(wú)菌水洗滌1次，再用500毫升600克/升的乳糖水溶液懸浮細(xì)胞，調(diào)節(jié)pH至5.5，在50℃振蕩轉(zhuǎn)化。

(4)每隔5小時(shí)取樣HPLC檢測(cè)低聚半乳糖生成的量，在連續(xù)5小時(shí)期間若低聚半乳糖的量沒(méi)有增加(或者略微減少)即停止轉(zhuǎn)化(50小時(shí))。

(5)轉(zhuǎn)化結(jié)束后離心，菌液分離。此時(shí)HPLC檢測(cè)乳糖轉(zhuǎn)化為低聚半乳糖的轉(zhuǎn)化率為38.5％。

實(shí)施例7、先發(fā)酵合成赤蘚糖醇，再以廢酵母泥轉(zhuǎn)化合成低聚半乳糖(2)

(1)在含2500毫升培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中接種解脂亞羅威酵母(Yarrowialipolytica)CGMCCNO.11369。發(fā)酵培養(yǎng)基的成分為(克/升)：葡萄糖300，酵母浸膏10，玉米漿5克，磷酸氫二銨5，硫酸鎂1，氯化錳0.005，氯化銅0.002，pH6.5。

(2)接種后在30℃，好氧攪拌培養(yǎng)直到葡萄糖全部轉(zhuǎn)化為赤蘚糖醇后即停止發(fā)酵。

(3)離心，上清依次經(jīng)過(guò)脫色、濃縮、離子交換、再濃縮、結(jié)晶的步驟提取赤蘚糖醇，這些步驟均為本領(lǐng)域內(nèi)常用的通識(shí)方法。得到細(xì)胞沉淀用于轉(zhuǎn)化。獲得315.5克濕細(xì)胞(酵母泥)。將細(xì)胞用無(wú)菌水洗滌1次，再用2000毫升550克/升的乳糖水溶液懸浮細(xì)胞，調(diào)節(jié)pH至6.0，在50℃振蕩轉(zhuǎn)化。

(4)每隔5小時(shí)取樣HPLC檢測(cè)低聚半乳糖生成的量，在連續(xù)5小時(shí)期間若低聚半乳糖的量沒(méi)有增加(或者略微減少)即停止轉(zhuǎn)化。

(5)轉(zhuǎn)化結(jié)束后離心，菌液分離。此時(shí)HPLC檢測(cè)乳糖轉(zhuǎn)化為低聚半乳糖的轉(zhuǎn)化率為43.2％。

(6)離心后得到的細(xì)胞沉淀再加入2000毫升550克/升的乳糖水溶液，懸浮細(xì)胞，裝入發(fā)酵罐，調(diào)節(jié)pH至6.0，在53℃攪拌轉(zhuǎn)化。每隔5小時(shí)取樣HPLC檢測(cè)低聚半乳糖的合成量，在連續(xù)5小時(shí)期間若低聚半乳糖的量沒(méi)有增加(或者略微減少)即停止轉(zhuǎn)化，檢測(cè)分析，細(xì)胞第二次轉(zhuǎn)化率為40.5％，保留93.7％的酶活力。細(xì)胞依次重復(fù)使用5次。第5次的轉(zhuǎn)化率為34.5％，細(xì)胞保留80％的活性。可見(jiàn)，隨著重復(fù)利用次數(shù)的增加，細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率會(huì)逐漸降低，因此，利用次數(shù)一般不超過(guò)5次。

實(shí)施例8、低葡萄糖含量低聚半乳糖的制備

為了得到低葡萄糖含量的低聚半乳糖，本實(shí)施例在轉(zhuǎn)化液中加入葡萄糖氧化酶以及過(guò)氧化氫酶，來(lái)氧化生產(chǎn)的副產(chǎn)物葡萄糖。由于在上述酶轉(zhuǎn)化合成低聚半乳糖的同時(shí)，會(huì)產(chǎn)生大約15-25％含量的葡萄糖。為了制備較高純度的低聚半乳糖糖，同時(shí)降低葡萄糖對(duì)β-半乳糖苷酶的反饋抑制，需要將這些葡萄糖去除。在轉(zhuǎn)化液里加入葡萄糖氧化酶以及過(guò)氧化氫酶，將葡萄糖氧化為葡萄糖酸，減低對(duì)β-半乳糖苷酶的反饋抑制。然后通過(guò)離子交換去除葡萄糖酸。

按照上述實(shí)施例7培養(yǎng)酵母細(xì)胞的方法得到酵母泥，用無(wú)菌水洗滌1次，再用2000毫升400克/升的乳糖水溶液懸浮細(xì)胞，調(diào)節(jié)pH至6.0，加入2克葡萄糖氧化酶(10000單位/克)與1克過(guò)氧化氫酶(20000單位/克)，在45℃振蕩轉(zhuǎn)化。每隔5小時(shí)取樣HPLC檢測(cè)低聚半乳糖生成的量，在連續(xù)5小時(shí)期間若低聚半乳糖的量沒(méi)有增加(或者略微減少)即停止轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化結(jié)束后離心，菌液分離。此時(shí)HPLC檢測(cè)乳糖轉(zhuǎn)化為低聚半乳糖的轉(zhuǎn)化率為30.5％，葡萄糖含量低于1％，與不用葡萄糖氧化酶與過(guò)氧化氫酶相比，降低了90％。采用葡萄糖氧化酶與過(guò)氧化氫酶處理后，HPLC分析如圖4所示，圖4中，保留時(shí)間為7.715min以及8.098min為低聚半乳糖；8.632min為未轉(zhuǎn)化完的底物乳糖；9.465min為葡糖糖；9.932min為半乳糖。

以上對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了描述。需要理解的是，本發(fā)明并不局限于上述特定實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在權(quán)利要求的范圍內(nèi)做出各種變形或修改，這并不影響本發(fā)明的實(shí)質(zhì)內(nèi)容。

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