糖尿病是一種以高血糖為特征的代謝性疾病，目前全球糖尿病患者總數(shù)超 5.37 億人，國(guó)內(nèi)糖尿病患者總數(shù)超 1.4 億人，現(xiàn)階段糖尿病仍是國(guó)內(nèi)乃至全球主要的健康和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)之一。

糖尿病主要分為1 型糖尿病（T1D）和2 型糖尿病（T2D），現(xiàn)階段，針對(duì) T1D 的治療大都依賴于外源胰島素注射，此外，T2D 患者隨著病程延長(zhǎng)、胰島功能逐漸衰退，多數(shù)也需要長(zhǎng)期頻繁注射胰島素以維持血糖穩(wěn)態(tài)，然而，這種方法難以精準(zhǔn)調(diào)控機(jī)體血糖水平，還可能會(huì)出現(xiàn)低血糖等副作用，如何長(zhǎng)效、精準(zhǔn)、穩(wěn)定地控糖是當(dāng)今治療糖尿病面臨的一大挑戰(zhàn)。

近期，四川大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院王剛教授領(lǐng)導(dǎo)的研究團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)出一種單鏈胰島素類似物（SIA）釋放開關(guān)系統(tǒng)，能夠?qū)崿F(xiàn)長(zhǎng)效、精準(zhǔn)的血糖調(diào)控，有望開發(fā)成為治療糖尿病的新型療法。目前，這項(xiàng)研究成果已經(jīng)以“Glucose-Activated Switch Regulating Insulin Analog Secretion Enables Long-term Precise Glucose Control in Mice With Type 1 Diabetes”為題發(fā)表在Diabetes期刊上。

（來源：Diabetes）

近日，生輝采訪到了王剛教授和該論文第一作者、四川大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院謝麗芳博士，他們圍繞這項(xiàng)研究的發(fā)現(xiàn)、意義、未來研究方向，以及臨床轉(zhuǎn)化等多個(gè)方面進(jìn)行了解讀分享。

王剛在四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院獲得博士學(xué)位，隨后進(jìn)入國(guó)家生物醫(yī)學(xué)材料工程技術(shù)研究中心（NECBM）從事博士后研究，歷任 NECBM 副研究員、研究員，期間曾赴耶魯大學(xué)醫(yī)學(xué)院做訪問學(xué)者。

截至目前，他已在PNAS, Biomaterials, Diabetes, ACS Applied Materials & Interfaces等期刊發(fā)表論文 50 余篇，授權(quán)發(fā)明專利 6 項(xiàng)?，F(xiàn)階段，課題組專注于設(shè)計(jì)和構(gòu)建新型技術(shù)平臺(tái)，用于在體內(nèi)進(jìn)行蛋白類藥物的生產(chǎn)和免疫細(xì)胞的修飾改造，以建立新型基因治療體系并推進(jìn)臨床轉(zhuǎn)化。

▲圖｜四川大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院王剛教授（來源：受訪者）

此前，王剛課題組已經(jīng)建立了高效骨骼肌細(xì)胞原位基因遞送/表達(dá)體系，通過肌注可將功能基因（質(zhì)粒）高效遞送到機(jī)體骨骼肌細(xì)胞中，并以該細(xì)胞為“工廠”在體內(nèi)持續(xù)、高效“生產(chǎn)”治療性“藥物”，比如抗體、多肽等。

“這個(gè)體系最大的特點(diǎn)是使用質(zhì)粒作為表達(dá)載體，而非目前被廣泛使用的病毒載體。病毒載體雖然可以讓基因遞送和表達(dá)變得簡(jiǎn)單、高效，但其安全性是后續(xù)臨床應(yīng)用的一大障礙。”王剛指出。

“通過前期研究，我們基本解決了質(zhì)粒體系遞送效率低、目標(biāo)蛋白表達(dá)量低等難題，當(dāng)把該體系的藥物產(chǎn)率提高到一定程度后，需要檢測(cè)它是否能真正用來治療疾病，我們首先考慮到的是 T1D?！彼榻B說，“由于目前針對(duì) T1D 治療手段單一但有效，即提供外源胰島素，而胰島素是一種肽類激素，可以利用這種質(zhì)粒體系來生產(chǎn)；肌肉在人體分布廣、體量大、血管豐富，細(xì)胞壽命也較長(zhǎng)，因此我們最初的設(shè)想是可否利用肌肉細(xì)胞替代胰島 β 細(xì)胞來生產(chǎn)胰島素，進(jìn)而有望通過一次肌注，肌肉細(xì)胞可以較長(zhǎng)時(shí)間為機(jī)體生產(chǎn)胰島素。”他補(bǔ)充道。

▲圖｜GAIS 體系運(yùn)作機(jī)制示意（來源：Diabetes）

據(jù)介紹，他們?cè)陂_展此次研究之前進(jìn)行了一個(gè)概念驗(yàn)證試驗(yàn)，觀察一次肌注質(zhì)粒能否降低血糖水平。試驗(yàn)結(jié)果顯示，質(zhì)粒原位遞送效率和 SIA 表達(dá)量都能滿足降糖要求，對(duì) T1D 小鼠一次肌注可持續(xù)控糖長(zhǎng)達(dá)一個(gè)多月。

“與此同時(shí)也出現(xiàn)了一個(gè)問題，即這種持續(xù)的、不受調(diào)控的 SIA 供給會(huì)帶來低血糖風(fēng)險(xiǎn)，比如動(dòng)物試驗(yàn)中在 SIA 表達(dá)量最高的時(shí)間段有多只小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重低血糖事件?！蓖鮿傊赋?，“所以，讓 SIA 供給量配合血糖濃度自行變化，即如何根據(jù)體內(nèi)血糖水平波動(dòng)對(duì)胰島素供給進(jìn)行仿生理性智能化實(shí)時(shí)調(diào)控，是我們這項(xiàng)研究面臨的一大挑戰(zhàn)?！?/p>

為此，他們?cè)O(shè)計(jì)并構(gòu)建出一種葡萄糖激活的 SIA 分泌開關(guān)體系（GAIS）?！霸谠O(shè)計(jì) GAIS 時(shí)又遇到新的問題，即把表達(dá)的 SIA 臨時(shí)儲(chǔ)存在何處。胰島 β 細(xì)胞是把胰島素儲(chǔ)存在囊泡中，能夠在血糖升高時(shí)迅速分泌釋放胰島素形成第一時(shí)相，然而肌肉細(xì)胞沒有這種功能的分泌囊泡。”他指出。

隨后，他們通過篩選并將內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為 SIA 的臨時(shí)儲(chǔ)存庫：讓質(zhì)粒編碼含 SIA 的融合蛋白 CAD-FCS-SIA。低血糖時(shí)，該融合蛋白通過 CAD 與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的 GRP78 蛋白結(jié)合實(shí)現(xiàn)暫時(shí)儲(chǔ)存；高血糖時(shí)，GRP78 與 CAD 解離，融合蛋白通過細(xì)胞正常的加工、分選流程進(jìn)入高爾基體，被 Furin 酶從 FCS 處切開形成單獨(dú)的 SIA 并被分泌出細(xì)胞外進(jìn)入血液循環(huán)發(fā)揮降糖功能。“其中，CAD 肽段需要優(yōu)化，我們選擇了不同種類與長(zhǎng)度的 CAD 肽段，進(jìn)行細(xì)胞與生化實(shí)驗(yàn)分析后，又在小鼠體內(nèi)進(jìn)行了大量篩選與驗(yàn)證，最終設(shè)計(jì)并確定了目前這套 GAIS 體系?！蓖鮿傉f道。

胰島素分泌的兩個(gè)時(shí)相

正常生理情況下，胰島素的分泌過程通常分為兩個(gè)時(shí)相：第一時(shí)相是快速過程，高血糖刺激后儲(chǔ)存在立即釋放池（RRP Readily Releasable Pool, RRP）中的胰島素迅速釋放，而第二時(shí)相發(fā)生在胰島素分泌的第一時(shí)相后，通常在進(jìn)食后 15 分鐘到幾個(gè)小時(shí)內(nèi)發(fā)生。第二時(shí)相胰島素分泌的速度比第一時(shí)相低，持續(xù)時(shí)間卻更長(zhǎng)，可以促進(jìn)攝入食物后的血糖代謝和能量?jī)?chǔ)存。

“胰島素分泌第一時(shí)相響應(yīng)時(shí)間快、持續(xù)時(shí)間短，數(shù)分鐘內(nèi)胰島素出現(xiàn)峰值，隨后的第二時(shí)相中，胰島素供給相對(duì)平緩但持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)?！敝x麗芳說道。

“我們此次研究是模擬胰島素分泌的第一時(shí)相來設(shè)計(jì)的，質(zhì)粒編碼的含 SIA 的融合蛋白先臨時(shí)儲(chǔ)存在骨骼肌細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，當(dāng)血糖升高時(shí)融合蛋白與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)解離并被加工成獨(dú)立的 SIA，釋放出細(xì)胞并分泌到血液中發(fā)揮降糖功能?！彼硎?。

▲圖｜肌內(nèi)表達(dá)的 GAIS 對(duì) T1D 小鼠的長(zhǎng)期治療效果（來源：Diabetes）

他們通過研究發(fā)現(xiàn)，該 GAIS 體系可使骨骼肌細(xì)胞在高血糖刺激時(shí)可重復(fù)、脈沖式激活 SIA 的分泌，即血糖調(diào)節(jié)型的胰島素分泌。動(dòng)物試驗(yàn)表明，通過 2 次注射治療（30 天 1 次肌注）的 T1D 模型小鼠可穩(wěn)定控制血糖長(zhǎng)達(dá) 2 個(gè)月，其 HbA1c 水平與健康小鼠一致，并且還提高了葡萄糖耐量、改善了體內(nèi)氧化應(yīng)激和三多一少癥狀等。

“與此同時(shí)，我們還進(jìn)行了完整、嚴(yán)格的生物安全性檢測(cè)，包括病理、免疫、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、血常規(guī)、血液生化、肝功、腎功等，證實(shí)了該 GAIS 體系的安全性?！蓖鮿傊赋?。

“從臨床應(yīng)用角度來看，這項(xiàng)研究還需要有機(jī)地整合胰島素分泌第二時(shí)相等一系列問題，而我們目前已經(jīng)完成了模擬胰島素分泌第二時(shí)相的 SIA 基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控（GAIT）的研究工作，試驗(yàn)顯示整體效果較好，同樣具備智能、長(zhǎng)效、安全等優(yōu)勢(shì)?！敝x麗芳表示。

總的來說，該研究證明了這種質(zhì)粒遞送/表達(dá)體系可將骨骼肌細(xì)胞改造成胰島 β 細(xì)胞外的一個(gè)理想的 SIA 生產(chǎn)替代細(xì)胞，通過合理的仿生理性設(shè)計(jì)可讓骨骼肌細(xì)胞具備血糖響應(yīng)性 SIA 釋放功能，從而實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)效、安全的血糖調(diào)控。

長(zhǎng)期以來，王剛課題組專注于利用自主建立的技術(shù)平臺(tái)開發(fā)糖尿病和腫瘤的新型基因和免疫治療策略。“我們過去、現(xiàn)在以及將來都在集中精力做一件事：設(shè)計(jì)和構(gòu)建便捷、高效、安全、穩(wěn)定的技術(shù)平臺(tái)，將蛋白類藥物的生產(chǎn)和（免疫）細(xì)胞的修飾或改造這兩類復(fù)雜、昂貴、耗時(shí)的事情從體外工廠轉(zhuǎn)移到體內(nèi)的‘細(xì)胞工廠’，進(jìn)而建立安全、有效、經(jīng)濟(jì)、便捷的全新的基因治療體系，并努力向應(yīng)用方向推進(jìn)?！蓖鮿傉f道。

▲圖｜課題組部分成員：左起張嫣菡博士，謝麗芳博士，盧宛翎碩士（來源：受訪者）

據(jù)介紹，圍繞這項(xiàng)研究，他們目前正在整理葡萄糖激活的 SIA 基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控體系（GAIT）的相關(guān)數(shù)據(jù)，具體而言：

其一，整合 GAIS 體系和 GAIT 體系（分別對(duì)應(yīng)機(jī)體胰島素分泌第一/第二時(shí)相兩種調(diào)控方式）以期能獲得更接近生理水平的血糖調(diào)控效果和響應(yīng)速度；

其二，在先前設(shè)計(jì)的高效骨骼肌細(xì)胞原位基因遞送材料的基礎(chǔ)上，通過計(jì)算機(jī)模擬對(duì)材料分子進(jìn)行大量?jī)?yōu)化設(shè)計(jì)，用新材料進(jìn)行基因遞送，可以省掉原來的低壓電場(chǎng)推動(dòng) DNA 分子入胞步驟，使操作更簡(jiǎn)單，進(jìn)一步提升穩(wěn)定性和安全性；

其三，設(shè)計(jì)多種速效 SIA來進(jìn)一步提高響應(yīng)速度。

“在完成以上三項(xiàng)工作后，我們計(jì)劃在大型靈長(zhǎng)類動(dòng)物中對(duì)這種治療體系的效果和安全性等進(jìn)行全面評(píng)估及優(yōu)化，為下一步申請(qǐng)臨床試驗(yàn)提供支持。”他說道。

關(guān)于接下來的研究方向，王剛表示，“我們發(fā)現(xiàn)通過 GAIT 體系治療后的 T1D 小鼠實(shí)現(xiàn)了‘痊愈’，這些小鼠所有糖尿病相關(guān)檢測(cè)指標(biāo)完全正常且存活滿一年，它們胰腺中出現(xiàn)與正常小鼠胰島 β 細(xì)胞團(tuán)相同的胰島素表達(dá)陽性細(xì)胞團(tuán)。但是，我們現(xiàn)階段還不確定這種再生的胰島 β 細(xì)胞是否會(huì)再次受到自身免疫系統(tǒng)的攻擊。”

“基于這些發(fā)現(xiàn)，我們下一步計(jì)劃深入探索這些再生的胰島 β 細(xì)胞的來源以及產(chǎn)生機(jī)制，以及這些細(xì)胞逃避免疫系統(tǒng)攻擊的機(jī)制，這可能會(huì)為真正‘治療’T1D 提供重要線索，同時(shí)我們將繼續(xù)探索構(gòu)建針對(duì)胰島的靶向遞送系統(tǒng)，為后續(xù)開展體內(nèi)原位誘導(dǎo)胰島 β 細(xì)胞再生的研究工作打下基礎(chǔ)。”他說道，“此外，我們還計(jì)劃用基因編輯技術(shù)將 GAIS-GAIT 體系的基因表達(dá)單元定點(diǎn)整合到骨骼肌細(xì)胞基因組的安全位點(diǎn)，建立更長(zhǎng)效的 SIA 智能供應(yīng)體系。”

“T1D 患者在發(fā)病早期可能還有 β 細(xì)胞殘存，由于免疫系統(tǒng)對(duì) β 細(xì)胞的攻擊是一個(gè)漸進(jìn)的過程，因此，胰島 β 細(xì)胞再生這條路我們會(huì)堅(jiān)持走下去，這可能將會(huì)是一個(gè)真正能夠“治愈”1 型或 2 型重癥糖尿病的方向。當(dāng)然，這需要配合免疫調(diào)節(jié)的策略，并且也存在很多重要基礎(chǔ)科學(xué)問題和技術(shù)難點(diǎn)需要攻克?！彼赋觥?/p>

（來源：Pixabay）

臨床轉(zhuǎn)化方面，王剛表示，“我們最初開展此次 T1D 的研究工作就是朝著臨床應(yīng)用方向推動(dòng)的，因此在研究過程中實(shí)時(shí)地申請(qǐng)了一系列專利，目前已經(jīng)授權(quán) 4 項(xiàng)。目前，我們正在與一些醫(yī)藥公司和投資機(jī)構(gòu)進(jìn)行溝通、商談，希望能夠展開合作加速推進(jìn)臨床轉(zhuǎn)化，同時(shí)也能夠創(chuàng)造更好的條件推進(jìn)其他一些前沿的、重要的研究工作，盡早盡快造?；颊?。”他說道。

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