專利名稱：：一種用于抗艾滋病病毒和抗菌的青梅提取物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥，具體涉及一種用于抗艾滋病病毒和抗菌的青梅提取物。
背景技術(shù)：
：由HIV感染而引起的疾病稱為艾滋病，全稱為獲得性免疫缺陷綜合征(acquiredimmunodeficiencysyndrome,AIDS),該病患者的免疫功能部份或完全喪失，CD4+細(xì)胞數(shù)目減少，繼而發(fā)生機(jī)會(huì)性感染、腫瘤等，臨床表現(xiàn)多種多樣。該病傳播速度快、病死率高，且目前無法治愈，引起了各國政府和社會(huì)關(guān)注。目前已發(fā)現(xiàn)兩種HIV，分別為HIV-1和HIV-2。兩者具有相似的病毒結(jié)構(gòu)和傳播途徑。HIV-2主要分布于非洲西部，在歐洲和美洲的一些感染者中也被檢測到。其毒力和傳播力都低于HIV-1，引起的艾滋病病程較慢且較緩和。HIV-1廣泛分布于世界各地，是引起全世界AIDS流行的病原，目前HIV的研究也是以HIV-1為主進(jìn)行的。目前的問題在于防治艾滋病的藥物研究進(jìn)展緩慢。由于HIV病毒的易變性，缺乏適當(dāng)?shù)膭?dòng)物模型，疫苗研制面臨很大困難，現(xiàn)有抗病毒的治療藥物尚不能從根本上殺滅病毒。在這樣的形勢下，傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)異乎尋常地引起人們的關(guān)注。我國有五千多年的文化傳統(tǒng)，特別是獨(dú)具一格的中醫(yī)藥是世界科學(xué)文化中的一朵奇葩，由于具有獨(dú)特的理論體系和用藥方式，理應(yīng)在防治艾滋病中發(fā)揮較大的作用，為世界攻克艾滋病作出貢獻(xiàn)。雖然艾滋病是一種新的人類疾病，中醫(yī)藥文獻(xiàn)及經(jīng)驗(yàn)從未有所記載，但是以中醫(yī)癥侯學(xué)及病因病理學(xué)為基礎(chǔ)，診治艾滋病及相關(guān)綜合癥是完全可行的。尤其是幾千味傳統(tǒng)的天然藥物歷經(jīng)數(shù)千年臨床應(yīng)用，從中一定能開發(fā)出有相當(dāng)療效的防治艾滋病的藥物?；诖?，目前全世界尋找天然抑制艾滋病病毒(HIV)藥物的研究正在蓬勃開展。青梅(^jf//caw""gac/2/o/Blanco)又禾爾為青皮、海梅、油楠，屬于龍腦香科(Dipterocarpaceae)青梅屬(&//ca植物，主要分布于我國海南省的保亭、三亞、東方、白沙、樂東、萬寧和瓊中等地，是海南島熱帶雨林中具有代表性、最普遍的樹種。在民間長期用作治療肝炎的藥物。經(jīng)全面查閱國內(nèi)外文獻(xiàn)資料，未見關(guān)于其化學(xué)成分和藥理活性研究的報(bào)道，也未見其有關(guān)抑菌的報(bào)道。國外學(xué)者對青梅屬植物的化學(xué)成分進(jìn)行了研究，得到苯乙烯衍生物一白藜蘆醇低聚物、倍半萜類、三萜類和黃酮類化合物。藥理實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇類化合物hopeaphenolA禾口vaticaphenolA對而情霉素的菌株Staphylococcusaureus和Mycobacteriumsmegmatis具有中等程度的抑制作用(JoannaRZ-Petal.，2002)，而化合物VaticanolC對受試的七種人腫瘤細(xì)胞和DNA的拓?fù)洚悩?gòu)酶II(topoll)具有生長抑制作用(ItoTetal.，2003;YamadaMetal.,2006)，三蔽化合物Vaticinone能抑制HIV—1的復(fù)制(ICso值為6.5嗎/ml)(ZhangHJetal.，2003)，因此青梅屬植物被認(rèn)為是能產(chǎn)生新的抗HIV活性化合物的目標(biāo)原料之一。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種青梅提取物的應(yīng)用，其具有顯著的抗艾滋病病毒和抗菌效果。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種青梅提取物的應(yīng)用，該提取物在制備抗艾滋病病毒或抗菌藥物中的應(yīng)用。青梅提取物，即將青梅經(jīng)過有機(jī)溶劑提取、萃取所得的植物提取物或在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步經(jīng)過精制所得的梳物提取物。所述青梅提取物的提取過程為將青梅烘干并粉碎成粉末，把青梅粉末用70%乙醇回流提取，合并提取液，過濾，減壓回收盡乙醇，加水稀釋，用有機(jī)溶劑萃取，將提取液濃縮，得到浸膏，真空干燥得到粉末即為青梅提取物。通過應(yīng)用現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)方法對青梅提取物的活性進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)該提取物具有顯著的抗艾滋病病毒和抗菌作用，可以作為制備抗艾滋病病毒或抗菌的藥物。本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)1、梳物體生物利用率高，效果顯著。本發(fā)明采用有機(jī)溶劑迸行提取，青梅的活性成分溶出率高，提取物具有顯著的抗艾滋病病毒和抗菌作用。2、原料來源廣泛，安全性高。青梅主要分布于我國海南省的保亭、三亞、東方、白沙、樂東、萬寧和瓊中等地，是海南島熱帶雨林中具有代表性、最普遍的樹種，因而資源極為豐富；本發(fā)明所提供的提取物來自于天然植物，作為藥物對人體無毒害等副作用。3、發(fā)展前景廣闊。利用天然植物的提取物開辟一條治療艾滋病或病毒性疾病的新途徑，并且可以進(jìn)一步分離純化提取物中的活性成分，設(shè)計(jì)開發(fā)出更高效的治療艾滋病或病毒性疾病的藥物，應(yīng)用范圍廣。具體實(shí)施方式下面用非限定性實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。將青梅烘干并粉碎成粉末，把青梅粉末用70%乙醇回流提取，合并提取液，過濾，減壓回收盡乙醇，加水稀釋，用乙酸乙酯萃取，將提取液濃縮，得到浸膏，真空干燥得到粉末即為青梅提取物。將青梅烘干并粉碎成粉末，把青梅粉末用90%乙醇回流提取，合并提取液，過濾，減壓回收盡乙醇，加水稀釋，用乙酸乙酯萃取，將提取液濃縮，得到浸膏，真空干燥得到粉末即為青梅提取物。實(shí)施例三、將青梅烘干并粉碎成粉末，把青梅粉末用70%甲醇回流提取，合并提取液，過濾，減壓回收盡乙醇，加水稀釋，用乙酸乙酯萃取，將提取液濃縮，得到浸膏，真空干燥得到粉末即為青梅提取物。利用青梅提取物抗HIV病毒活性實(shí)例待測樣品溶解于RPMI-1640完全培養(yǎng)基中0.22|um濾膜過濾除菌，4。C保存，貯存濃度為1.0mg/ml;AZT溶解于RPMI-1640完全培養(yǎng)基中0.22)im濾膜過濾除菌，分裝后-2(TC保存。所有細(xì)胞和病毒均以含10%小牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。按常規(guī)方法制備HIV-lmB，滴定并計(jì)算出病毒的TCID5。。病毒貯存液分裝后，置-70'C保存。細(xì)胞和病毒按常規(guī)方法凍存和復(fù)蘇。①HIV-l感染性滴定檢測將HIV-l貯存液在96孔板上作4倍稀釋，IO個(gè)梯度，每梯度6個(gè)重復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置對照孔6孔。每孔加入C8166細(xì)胞50^，每孔終體積為200ul。37°C，5%(^02培養(yǎng)。第三天補(bǔ)加新鮮RPMI-1640完全培養(yǎng)基100u1，第七天在倒置顯微鏡下觀察每孔中HIV-l誘導(dǎo)的細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)，以每孔是否有合胞體的形成確定；計(jì)算病毒的TCIDso。②對(:8166細(xì)胞的毒性實(shí)驗(yàn)4xl0"mlC引66細(xì)胞懸液100ul與待測藥物溶液混合，設(shè)三個(gè)重復(fù)孔。同時(shí)設(shè)置不含藥物的對照孔，37°"5%(:02培養(yǎng)3天，采用MTT比色法檢測細(xì)胞毒性。ELx800酶標(biāo)儀測定OD值，測定波長為595nm，參考波長為630nm。計(jì)算得到CCso值。③HIV-lmB致細(xì)胞病變(CPE)的抑制實(shí)驗(yàn)將8xl0"mlQ,66細(xì)胞50ul/孔接種到含有100iil/孔梯度倍比稀釋藥物的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，然后加入50nl的HIV-luro稀釋上清，1300TCID50/孔。設(shè)3個(gè)重復(fù)孔。同時(shí)設(shè)置不含藥物的正常細(xì)胞對照孔。AZT為陽性藥物對照。37。C，5y。C02培養(yǎng)3天，倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)合胞體的形成。EC5Q(50%EffectiveConcentration)為抑制合胞體形成50%時(shí)的藥物濃度。計(jì)算公式根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果繪制劑量反應(yīng)曲線，計(jì)算出化合物抑制病毒的50%有效濃度(EC5Q)，50%抑制細(xì)胞生長濃度(CC5o)及抗HIV-1活性的治療指數(shù)TI值為TI=CC5Q/EC5()檢測結(jié)果青梅乙酸乙酯提取物CC5o為187.37ug/ml，Eq。為18.67ug/ml，治療指數(shù)(TI值)為13.65?？咕钚詫?shí)例供試菌種大腸桿菌、金黃色葡萄桿菌、枯草桿菌、根霉、黑曲霉。培養(yǎng)基①細(xì)菌培養(yǎng)基取19.5g營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基粉末溶于lL無菌水中，加15-20g的瓊脂，加熱待其溶解后滅菌。②真菌固體培養(yǎng)基:取28.5g真菌培養(yǎng)基粉末溶于1L無菌水中，加15-20g的瓊脂，加熱待其溶解后滅菌抑菌實(shí)驗(yàn)方法用半徑1.5cm的濾紙片分別將各藥品不同有機(jī)提取物及不同濃度浸透濾紙片。待其自然晾干后放入接有菌種的培養(yǎng)皿中。利用其擴(kuò)散作用，使濾紙片的藥品溶入培養(yǎng)基中。在另一個(gè)接有菌種的培養(yǎng)皿中放入浸過溶解樣品的溶劑的空白對照濾紙片。菌種在經(jīng)過培養(yǎng)后(細(xì)菌培養(yǎng)24小時(shí)、真菌培養(yǎng)48小時(shí))，觀察培養(yǎng)皿中有無抑菌圈，并用相機(jī)拍攝結(jié)果。有抑菌圈的用游標(biāo)卡尺測量其抑菌圈大小，十字交叉法測量菌落直徑，然后取平均值。由抑菌圈的有無證明其是否有抑菌作用，并由抑菌圈大小的比較說明抑菌作用的強(qiáng)弱。結(jié)論在青梅的有機(jī)提取物中，乙酸乙酯提取物抑菌效果最明顯。在三種細(xì)菌中，對金黃色葡萄球菌的抑菌最為明顯，對三種細(xì)菌的抑菌作用都隨藥物濃度的增大而增大。青梅乙酸乙酯提取物在三種濃度下的抑菌圈半徑見表一。表一青梅乙酸乙酯提取物在三種濃度下的抑菌圈半徑<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>權(quán)利要求1、一種用于抗艾滋病病毒和抗菌的青梅提取物，其特征在于該提取物用于制備抗艾滋病病毒和抗菌的藥物；所述提取物由如下方法制得將青梅經(jīng)過有機(jī)溶劑提取、萃取所得的植物提取物或在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步經(jīng)過精制所得的植物提取物。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于抗艾滋病病毒和抗菌的青梅提取物，其特征在于所述青梅提取物的提取過程為將青梅烘干并粉碎成粉末，把青梅粉末用70%乙醇回流提取，合并提取液，過濾，減壓回收盡乙醇，加水稀釋，用有機(jī)溶劑萃取，將提取液濃縮，得到浸膏，真空干燥得到粉末即為青梅提取物。全文摘要本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥，具體涉及一種青梅提取物的應(yīng)用，所述提取物是指將青梅經(jīng)過有機(jī)溶劑提取、萃取所得的植物提取物或在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步經(jīng)過精制所得的植物提取物，該提取物用于制備抗艾滋病病毒和抗菌的藥物。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)植物體生物利用率高，效果顯著；原料來源廣泛，安全性高；對該提取物藥物活性的深入研究和開發(fā)利用意義深遠(yuǎn)；發(fā)展前景廣闊。文檔編號A61P31/18GK101254224SQ20081008265公開日2008年9月3日申請日期2008年2月26日優(yōu)先權(quán)日2008年2月26日發(fā)明者宋小平,舒火明,莫崢嶸,忠陳,陳光英,韓長日申請人:陳光英;宋小平;舒火明

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