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綜述：體外人工制做消化道類器官的原理和應(yīng)用

來(lái)源：泰然健康網(wǎng) 時(shí)間：2024年12月19日 08:44

綜述：體外人工制做消化道類器官的原理和應(yīng)用 | Cell Regeneration

2020-08-12

論文標(biāo)題：Generation of 3D human gastrointestinal organoids: principle and applications

期刊：Cell Regeneration

作者：Mengxian Zhang, Yuan Liu et.al

發(fā)表時(shí)間：2020/06/10

數(shù)字識(shí)別碼：10.1186/s13619-020-00040-w

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消化道疾病諸如癌癥、潰瘍等能夠影響人體正常的食物消化、營(yíng)養(yǎng)吸收、免疫保護(hù)與激素分泌等功能，對(duì)人類健康構(gòu)成巨大威脅。近十年來(lái)，基于干細(xì)胞體外3D培養(yǎng)技術(shù)制備的類器官（Organoids）由于其出色的自我更新和組織能力以及表現(xiàn)出一定的組織結(jié)構(gòu)與功能引起越來(lái)越多的關(guān)注。早在1975年，就有人用單個(gè)皮膚細(xì)胞在體外培養(yǎng)成多層結(jié)構(gòu)的克隆。但受限于對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)生物學(xué)和工藝學(xué)的充分認(rèn)識(shí)，這個(gè)技術(shù)一直到2009年隨著人工基質(zhì)膠Matrigel 的使用才得以突破瓶頸。人們第一次用單個(gè)小鼠腸隱窩，通過(guò)加入各種因子在體外培養(yǎng)出了一個(gè)微型腸管。這個(gè)腸管具有了許多體內(nèi)腸管才有的特性，甚至還有隱窩特有的芽結(jié)構(gòu)。迄今為止，借助捐贈(zèng)者的組織或細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)產(chǎn)生的胃腸類器官，不僅可以用來(lái)研究消化道形成的機(jī)制，還可以在體外建立消化道疾病模型以及藥物篩選模型。清華大學(xué)的陳曄光教授團(tuán)隊(duì)特地撰文總結(jié)了胃腸道類器官的上皮穩(wěn)態(tài)、制備方法以及應(yīng)用前景，發(fā)表在Cell Regeneration上。

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胃腸上皮細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)

人的胃分為底部、體部和竇部。這些部位都包含一層內(nèi)陷的腺體樣上皮細(xì)胞。這層細(xì)胞可以分泌水、電解質(zhì)、胃蛋白酶、胃酸以及一些激素比如胃泌素。將胃的三個(gè)部分從組織學(xué)上再進(jìn)行細(xì)分的話，可以發(fā)現(xiàn)更多不同的結(jié)構(gòu)和細(xì)胞類型（如圖1A），其中峽區(qū)（isthmus，圖中淺藍(lán)色部分）存在一些未分化的胃干細(xì)胞，可以產(chǎn)生六種不同的細(xì)胞類型。胃上皮細(xì)胞穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)涉及到多個(gè)信號(hào)通路。Notch通路負(fù)責(zé)峽區(qū)細(xì)胞的增殖；FGF10抑制壁細(xì)胞（parietal cell）和主細(xì)胞（chief cell）分化；BMP通路能抑制炎癥反應(yīng)、抑制Lgr5陽(yáng)性的干細(xì)胞活性、提高壁細(xì)胞的數(shù)量；Hedgehog通路中Sonic Hedgehog控制肩區(qū)（neck，圖中棕色部分）壁細(xì)胞胃泌素分泌；India Hedgehog和Wnt通路則可促進(jìn)窩區(qū)（pit，圖中米色部分）上皮細(xì)胞增殖。

小腸上皮包含大量的隱窩和絨毛結(jié)構(gòu)（如圖1B）。在突出的絨毛結(jié)構(gòu)中包括功能成熟的上皮細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、內(nèi)分泌細(xì)胞和簇細(xì)胞等；而內(nèi)陷的隱窩結(jié)構(gòu)主要由許多未成熟的前體細(xì)胞、短暫增殖細(xì)胞（transient amplifying cell）、Lgr5陽(yáng)性干細(xì)胞、潘氏細(xì)胞（Paneth cell）以及尚有爭(zhēng)議的“+4”細(xì)胞等混合而成。小腸上皮是一類快速自我更新的組織，Lgr5陽(yáng)性干細(xì)胞增殖分化產(chǎn)生短暫增殖細(xì)胞，隨后短暫增殖細(xì)胞遷移到絨毛進(jìn)一步分化形成成熟的各種細(xì)胞。與胃相似，Wnt、Notch、EGF、Hippo和BMP等通路在腸上皮細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中同樣重要。

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胃腸道類器官3D培養(yǎng)

人胃腸道類器官能夠通過(guò)原代上皮組織或干細(xì)胞培養(yǎng)獲得。其基本流程如下：從患者身上獲取的樣品經(jīng)HBSS緩沖液（Hank's平衡鹽溶液）清洗后，剝離肌肉和結(jié)締組織，將組織剪成小塊，2mM EDTA冰上孵育30分鐘后連續(xù)劇烈震蕩，上皮細(xì)胞分離出來(lái)后，可以通過(guò)流式分選進(jìn)一步得到單個(gè)干細(xì)胞。除了機(jī)械分離外，一些溫和的中性蛋白酶或膠原酶也可用于組織消化。接下來(lái)將上皮細(xì)胞或干細(xì)胞種植在基質(zhì)膠上。培養(yǎng)液3-5天更換，大約一周左右，就可以看到3D結(jié)構(gòu)的類器官了，類器官可以傳代也可以凍存，具備良好的顯微外觀和穩(wěn)定的基因組。除此之外，氣液界面培養(yǎng)系統(tǒng)也能夠用來(lái)獲得胃腸道類器官。將一個(gè)底部有滲透膜的內(nèi)皿放在含有培養(yǎng)基的外皿中，上皮細(xì)胞包被在內(nèi)皿上，培養(yǎng)基液面不能高于細(xì)胞以利于細(xì)胞與空氣充分接觸。大約幾天時(shí)間，一個(gè)由極化單層上皮構(gòu)成的3D球狀物就會(huì)形成。

胃腸道類器官培養(yǎng)的另一種方法需要利用多能干細(xì)胞，多能干細(xì)胞包括胚胎干細(xì)胞與誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，該方法走的是一條模擬體內(nèi)發(fā)育的路線，需要經(jīng)過(guò)內(nèi)胚層誘導(dǎo)、組織特異球體形成、類器官特化等過(guò)程。這個(gè)方法需要通過(guò)不斷地改變培養(yǎng)基和添加因子，缺點(diǎn)是周期長(zhǎng)、步驟復(fù)雜且費(fèi)用不菲，但更接近于體內(nèi)發(fā)育過(guò)程，而且可以通過(guò)對(duì)培養(yǎng)前細(xì)胞進(jìn)行基因編輯等手段，更好地用于胃腸器官形成的機(jī)制研究。

胃腸道類器官的成功培養(yǎng)需要合適的細(xì)胞外基質(zhì)與培養(yǎng)基。Matrigel 是目前使用最廣泛的細(xì)胞外基質(zhì)，它來(lái)自于小鼠肉瘤，富含多種膠原蛋白、粘連蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白多糖等成分。類器官的培養(yǎng)基需要添加各種生長(zhǎng)因子，前文中涉及到的各種信號(hào)通路對(duì)應(yīng)的各種因子都會(huì)以不同的比例做成不同的培養(yǎng)基配方。同時(shí)，需要哪種類型的細(xì)胞，需要加強(qiáng)哪類細(xì)胞的功能，研究者們可以添加合適的因子，通過(guò)調(diào)整比例、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)方式來(lái)達(dá)到研究需要。因此，類器官培養(yǎng)基的制備使用更像是一門工藝，所有人在材料和加工過(guò)程中都可以有自己獨(dú)家秘方，通過(guò)不斷地調(diào)整改進(jìn)完善，讓其漸臻完美。

胃腸道類器官應(yīng)用前景

胃腸道類器官的應(yīng)用前文中已有涉及，主要包括早期胚胎中消化道形成的分子機(jī)制研究；消化道疾病體外模型的建立；個(gè)性化治療中的藥物篩選；再生醫(yī)學(xué)中胃腸道體外再生和器官移植等。

總的來(lái)說(shuō)，胃腸道類器官具有前途光明，與其他組織工程相結(jié)合可以更好地模擬體內(nèi)器官組織間復(fù)雜的相互調(diào)控關(guān)系。

摘要：The stomach and intestine are important organs for food digestion, nutrient absorption, immune protection and hormone production. Gastrointestinal diseases such as cancer and ulcer are big threats to human health. Appropriate disease models are in sore need for mechanistic understanding and drug discovery. Organoids are three-dimensional in vitro cultured structures derived from tissues and pluripotent stem cells with multiple types of cells and mimicking in vivo tissues in major aspects. They have a great potential in regenerative medicine and personalized medicine. Here, we review the major signaling pathways regulating gastrointestinal epithelial homeostasis, summarize different methods to generate human gastrointestinal organoids and highlight their applications in biological research and medical practice.

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