編譯：微科盟Moon，編輯：微科盟居居、江舜堯。

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導(dǎo)讀  

術(shù)前新輔助放化療(nCRT)是局部晚期直腸癌(LARC)患者的標(biāo)準(zhǔn)治療方法，但目前對(duì)其療效異質(zhì)性的影響因素知之甚少。在這項(xiàng)縱向研究中，研究人員對(duì)353份糞便樣本進(jìn)行了16S rRNA測(cè)序，發(fā)現(xiàn)患者接受nCRT后腸道微生物多樣性降低。多組學(xué)數(shù)據(jù)整合顯示，普通擬桿菌(Bacteroides vulgatus)介導(dǎo)的核苷酸生物合成與LARC患者的nCRT耐藥性有關(guān)，而對(duì)nCRT無(wú)反應(yīng)的腫瘤的特征是DNA修復(fù)和核苷轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)。補(bǔ)充核苷或普通擬桿菌灌胃處理可以保護(hù)癌細(xì)胞免受5-氟尿嘧啶或放療的影響。研究人員分析735例患者的2205份血清樣本后發(fā)現(xiàn)，尿酸是接受nCRT治療的LARC患者的潛在預(yù)后標(biāo)志物。綜上所述，本研究揭示了腸道菌群介導(dǎo)的核苷酸生物合成在直腸癌對(duì)nCRT的反應(yīng)中具有重要作用，并強(qiáng)調(diào)了在癌癥治療過(guò)程中破譯癌細(xì)胞和腸道微生物之間的相互作用的重要性。

圖文摘要

論文ID

原名：Gut microbiota-mediated nucleotide synthesis attenuates the response to neoadjuvant chemoradiotherapy in rectal cancer

譯名：腸道菌群介導(dǎo)的核苷酸合成減弱了直腸癌對(duì)新輔助放化療的反應(yīng)

期刊：Cancer Cell

IF：38.585

發(fā)表時(shí)間：2022.12

通訊作者：詹啟敏，王維虎

通訊作者單位：北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院

DOI號(hào)：10.1016/j.ccell.2022.11.013  

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

結(jié)果

1. LARC患者的臨床特征及放化療對(duì)其糞便微生物群落的影響

本研究納入了2018年1月至2019年11月期間接受nCRT治療的126例LARC患者。根據(jù)研究設(shè)計(jì)，研究人員在患者接受nCRT治療前2周至1天(Pre-nCRT [Pre])和治療后相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)(Post-nCRT [Post])收集353份糞便樣本[(治療后采樣時(shí)間點(diǎn)包括治療開(kāi)始后2周(Post1)、治療結(jié)束后3天內(nèi)(Post2)和治療結(jié)束后2個(gè)月(Post3)(圖1A和附表1))。此外，研究人員根據(jù)腫瘤退縮分級(jí)(TRG)和客觀緩解情況，將116名可評(píng)估反應(yīng)的患者分為應(yīng)答者(TRG評(píng)分為0至1分，或達(dá)到臨床完全緩解狀態(tài)，共有82例)和無(wú)應(yīng)答者(TRG評(píng)分2至3分，或nCRT后2個(gè)月內(nèi)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，共有34例)。排除混雜變量對(duì)組別的影響后，兩組的臨床基線(xiàn)變量沒(méi)有顯著性差異(附表1)。然后，通過(guò)16S rRNA測(cè)序(353份糞便樣本)和宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(91份糞便樣本)(附表2)評(píng)估和分析患者腸道細(xì)菌特征的動(dòng)態(tài)變化。

首先，研究人員基于Bray-Curtis距離進(jìn)行置換多元方差分析，探討了nCRT對(duì)LARC患者糞便樣本中整體微生物群組成的影響(圖1B)。主坐標(biāo)分析結(jié)果顯示，nCRT前后的樣本存在明顯的分離(圖1B)，且nCRT后樣本的個(gè)體間Bray-Curtis距離明顯低于nCRT前樣本(圖1C)。根據(jù)16S rRNA擴(kuò)增子序列變異(ASV)(圖1D和1F)和宏轉(zhuǎn)錄組屬組成(圖1E和1G)估計(jì)的Shannon指數(shù)和逆Simpson指數(shù)顯示，放化療后糞便微生物多樣性顯著降低。α和β多樣性的降低突出了放化療對(duì)腸道菌群的影響，提示放化療可能使LARC患者的腸道菌群復(fù)雜性降低并且更均勻。

圖1. 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和患者接受nCRT后糞便微生物群落的變化。

(A)本研究的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。(B)使用Bray-Curtis距離對(duì)所有LARC患者糞便樣本進(jìn)行ASV水平的主坐標(biāo)分析。(C) nCRT前后LARC患者糞便樣本ASV水平Bray-Curtis差異距離的分布。(D和E) LARC患者接受nCRT前后基于糞便樣本16S rRNA ASV(D)(Pre組為125份，Post組為228份糞便樣本)和基于宏轉(zhuǎn)錄組的屬組成獲得的Shannon指數(shù)(E)(Pre組為34份，Post組為57份糞便樣本)。(F和G) nCRT前后樣本中基于16S rRNA ASV(F)(Pre組為125份糞便樣本，Post組為228份糞便樣本)和宏轉(zhuǎn)錄組屬組成(G)(Pre組為34份糞便樣本，Post組為57份糞便樣本)獲得的逆辛普森指數(shù)。使用Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)計(jì)算統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。  

2. 放化療后LARC患者糞便微生物群發(fā)生改變

為了進(jìn)一步分析患者放化療前后糞便菌群的變化，研究人員在門(mén)水平上估算了組間的細(xì)菌豐度。結(jié)果顯示，各組樣本之間的腸道微生物群有相當(dāng)大的差異(圖2A)，厚壁菌門(mén)(Firmicutes)和擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)是最主要的兩個(gè)門(mén)，分別占所有組ASV的74.47%和10.10%。此外，整個(gè)治療期間不同時(shí)間點(diǎn)的微生物組成和多樣性出現(xiàn)波動(dòng)性變化(圖2B和圖2C)，這表明縱向采樣對(duì)于準(zhǔn)確識(shí)別微生物群變化非常重要，這一點(diǎn)在之前的研究中可能被遺漏。基于縱向樣本，研究人員在不同分類(lèi)水平探索與放化療相對(duì)應(yīng)的糞便菌群變化。在門(mén)水平上，與nCRT治療后的樣本相比，擬桿菌門(mén)(14.87% vs. 8.01%)在nCRT治療前的樣本中豐度更高；而厚壁菌門(mén)(75.47%)在nCRT治療后的樣本中豐度更高(圖2D)。在屬水平上，兩組間共有36個(gè)屬存在顯著性差異(圖2E和圖2F)。在這些存在差異的分類(lèi)群中，有幾個(gè)是已確定的與結(jié)直腸癌有關(guān)的細(xì)菌，包括Alistipes、擬桿菌屬(Bacteroides)和狄氏副擬桿菌屬(Parabacteroides)，這些細(xì)菌在pre-nCRT組中豐度更高，而Actinomyces、糞球菌屬(Coprococcus)和Dorea這三個(gè)曾被報(bào)道在結(jié)直腸腺瘤樣本中豐度較高的菌屬，在post-nCRT組中豐度更高(圖2E和圖2F)。為了進(jìn)一步研究癌癥患者放化療后微生物群落的變化模式，研究人員表征了放化療前后樣本中細(xì)菌ASV的共豐度模式。結(jié)果表明，pre-nCRT組和post-nCRT組的大部分相關(guān)性都是正相關(guān)，表明微生態(tài)系統(tǒng)中微生物的關(guān)系以合作而非競(jìng)爭(zhēng)為主(圖2G)?；贜etShift分析，研究人員發(fā)現(xiàn)與丁酸生成相關(guān)的細(xì)菌屬，包括Peptoniphilus、Blautia、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)和Turicibacter，是直腸癌患者接受放化療后微生物群中的潛在驅(qū)動(dòng)分類(lèi)群(圖2H)。丁酸是正常結(jié)腸細(xì)胞的重要能量來(lái)源，可通過(guò)調(diào)節(jié)基因表達(dá)、炎癥、分化和凋亡等方式影響腸道健康。研究表明，產(chǎn)生丁酸的細(xì)菌具有抗腫瘤活性。因此，由產(chǎn)丁酸微生物驅(qū)動(dòng)的有益網(wǎng)絡(luò)深化了對(duì)放化療治療直腸癌的認(rèn)識(shí)。

圖2. LARC患者放化療后糞便菌群的變化。

(A)基于ASV注釋的物種，治療前(Pre)和治療后(Post)癌癥樣本中門(mén)水平微生物的相對(duì)豐度。每組僅展示前10個(gè)豐度最高的門(mén)。(B和C)在不同時(shí)間點(diǎn)，基于16S rRNA ASV(B)和屬豐度(C)的Shannon指數(shù)和逆Shannon指數(shù)的動(dòng)態(tài)變化。(D)直腸癌患者糞便微生物中兩個(gè)發(fā)生顯著變化的與放化療相關(guān)的細(xì)菌門(mén):擬桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén)。(E)在Post組(棕色)或Pre組(藍(lán)色)中顯著富集的細(xì)菌屬。(F)比較(E)中兩組Actinomyces、Coprococcus、Alistipes、Dorea、Bacteroides、Oscillospira、Blautia和Parabacteroides的相對(duì)豐度。(B、D和F)中Pre組和Post組的糞便樣本分別為125和228份。使用Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)計(jì)算統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。(G)基于Pre(左)和Post(右)組糞便樣本構(gòu)建的微生物組共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)。節(jié)點(diǎn)代表ASV，并根據(jù)門(mén)著色，節(jié)點(diǎn)大小代表與其他節(jié)點(diǎn)的連接數(shù)量。綠色和紅色的線(xiàn)分別代表正相關(guān)和負(fù)相關(guān)。(H)潛在驅(qū)動(dòng)菌屬，基于原始微生物組的細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)分析的潛在驅(qū)動(dòng)屬，然后將這些微生物組與放化療相關(guān)聯(lián)。大的紅色節(jié)點(diǎn)表示放療后特別重要的驅(qū)動(dòng)類(lèi)群。線(xiàn)的顏色表示Post組(紅色邊)和Post組(綠色邊)的連接。  

3. 接受放化療的LARC應(yīng)答者和無(wú)應(yīng)答者糞便微生物群的差異

為了進(jìn)一步確定糞便微生物群差異與放化療反應(yīng)之間的關(guān)系，研究人員根據(jù)NCCN TRG和客觀應(yīng)答情況將患者分為應(yīng)答者和無(wú)應(yīng)答者(圖3A和圖3B)，然后對(duì)兩組之間的宏轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行線(xiàn)性判別分析效應(yīng)分析，以確定影響患者對(duì)放化療反應(yīng)的物種。鑒定出7種和11種細(xì)菌分別與放化療應(yīng)答和無(wú)應(yīng)答狀態(tài)相關(guān)(附表3)。一項(xiàng)隨機(jī)臨床試驗(yàn)表明，在與放化療反應(yīng)相關(guān)的物種中，Bacteroides coprophilus與供體糞便菌群移植后潰瘍性結(jié)腸炎的疾病改善顯著相關(guān)。在放化療后的無(wú)應(yīng)答組患者中，普通擬桿菌(Bacteroides vulgatus)是豐度最高的物種(圖3C和3D)，而在放療前，普通擬桿菌并不占優(yōu)勢(shì)(附表4)，這表明它是放化療后被選擇的。這一結(jié)果與之前的觀察結(jié)果一致，之間的研究根據(jù)16S rDNA V1-V2高變區(qū)擴(kuò)增子測(cè)序推斷，放化療后無(wú)應(yīng)答組患者腸道菌群中的擬桿菌屬(Bacteroides)豐度升高。有研究發(fā)現(xiàn)，在潰瘍性結(jié)腸炎患者中，普通擬桿菌具有致病作用，因?yàn)閺倪M(jìn)展期結(jié)直腸腺瘤到癌變，普通擬桿菌的豐度顯著增加。由于應(yīng)答組和無(wú)應(yīng)答組樣本之間的微生物組組成不同，研究人員隨后比較了這兩組的細(xì)菌物種在群落水平上的共豐度關(guān)聯(lián)。與無(wú)應(yīng)答組的稀疏相關(guān)網(wǎng)絡(luò)相比(附圖1A)，放化療應(yīng)答組的相關(guān)網(wǎng)絡(luò)更強(qiáng)(附圖1B)，體現(xiàn)在節(jié)點(diǎn)數(shù)(115 vs. 97)和邊數(shù)(338 vs. 125)、平均度(2.939 vs. 1.289)和平均聚類(lèi)系數(shù)(0.042 vs. 0.015)等方面。在應(yīng)答組中，幾種細(xì)菌，包括Rothia mucilaginosa、V. parvula、W. confusa和嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)，在細(xì)菌相互作用中具有核心作用。據(jù)報(bào)道，R. mucilaginosa可以通過(guò)減少I(mǎi)κB-α磷酸化和NF-κB靶基因的表達(dá)來(lái)抑制NF-κB通路的激活，對(duì)病原體誘導(dǎo)的促炎反應(yīng)有抑制作用。嗜熱鏈球菌是一種產(chǎn)乳酸細(xì)菌，可以通過(guò)分泌β-半乳糖苷酶抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，從而抑制結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生。以這些有益菌為中心的網(wǎng)絡(luò)可能有利于化療后直腸癌患者的健康。如附圖1B所示，幾種擬桿菌屬細(xì)菌表現(xiàn)出很強(qiáng)的相關(guān)性，并在無(wú)應(yīng)答組的生態(tài)網(wǎng)絡(luò)中占據(jù)中心位置，表明它們?cè)诰W(wǎng)絡(luò)中起著關(guān)鍵作用。在NetShift分析中，除了普通擬桿菌外，其他幾種擬桿菌屬細(xì)菌，如Bacteroides faecis、Bacteroides ovatus和Bacteroides massiliensis，是化放療無(wú)應(yīng)答直腸癌患者腸道微生物組中的潛在驅(qū)動(dòng)物種(圖3E)。在LARC患者的糞便樣本中，B. ovatus、B. massiliensis或B. faecis的豐度與B. vulgatus的豐度呈正相關(guān)(圖3F)。在無(wú)應(yīng)答LARC患者中這些擬桿菌屬細(xì)菌的富集促使研究人員繼續(xù)探究它們?cè)谶@些患者對(duì)nCRT耐受性中的潛在功能。

圖3. 糞便微生物群與LARC患者對(duì)放化療的反應(yīng)有關(guān)。

(A和B) 34例無(wú)應(yīng)答者和82例應(yīng)答患者的代表性放射學(xué)(A)和蘇木精-伊紅染色病理(B)圖像(比例尺，50 μm)。紅色箭頭代表病變部位。(C)放化療后應(yīng)答組和無(wú)應(yīng)答組的物種顯著富集。(D)比較放化療前后應(yīng)答組和無(wú)應(yīng)答組普通擬桿菌的相對(duì)豐度。箱線(xiàn)圖展示了最小值和最大值、帶中位數(shù)的四分位距和離群值。在Pre組中，應(yīng)答組和無(wú)應(yīng)答組的糞便樣本分別為18和16份。Post組中，應(yīng)答組和無(wú)應(yīng)答組的糞便樣本分別為32和25份。使用Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)計(jì)算統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性：***p < 0.001。(E)基于初始微生物組的細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)的潛在驅(qū)動(dòng)物種，然后分析它們與放化療無(wú)反應(yīng)的相關(guān)性。大的紅色節(jié)點(diǎn)表示與放化療無(wú)反應(yīng)相關(guān)的特別重要的驅(qū)動(dòng)類(lèi)群。線(xiàn)的顏色表示無(wú)無(wú)應(yīng)答組(紅色線(xiàn))和應(yīng)答組(綠色線(xiàn))中存在的聯(lián)系。(F)從宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中獲得的普通擬桿菌的相對(duì)豐度(log2轉(zhuǎn)換)與B. ovatus、B. massiliensis和B. faecis的相對(duì)豐度(log2轉(zhuǎn)換)之間的Pearson相關(guān)性。  

4. 宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)結(jié)合代謝組學(xué)揭示核苷酸生物合成與LARC患者的nCRT耐藥性有關(guān)

為了深入了解微生物群落變化可能帶來(lái)的功能后果，研究人員分析了從糞便宏轉(zhuǎn)錄組推斷出的功能模塊，并注釋了放化療后應(yīng)答組和無(wú)應(yīng)答組之間差異豐富的20個(gè)MetaCycle模塊(附表5)?；旌纤岚l(fā)酵和鳥(niǎo)苷二磷酸-甘露糖生物合成模塊在放化療后的應(yīng)答組中被鑒定為差異豐富，這與之前的研究結(jié)果一致，即甘露糖可通過(guò)影響三羧酸循環(huán)、糖酵解和磷酸戊糖途徑中的葡萄糖代謝來(lái)抑制腫瘤生長(zhǎng)并增強(qiáng)化療反應(yīng)中的細(xì)胞死亡。據(jù)報(bào)道，核苷酸從頭合成可增加乳腺癌轉(zhuǎn)移或膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的治療耐受性。有趣的是，在本研究中，放化療后，與核苷酸生物合成相關(guān)的幾個(gè)模塊在無(wú)應(yīng)答組中富集(圖4A)。在核苷酸生物合成相關(guān)基因中，我們發(fā)現(xiàn)放化療后無(wú)應(yīng)答組9個(gè)嘌呤合成相關(guān)基因(包括purF，編碼嘌呤從頭生物合成中的限速酶)和5個(gè)嘧啶核苷酸合成相關(guān)基因表達(dá)升高(圖4B和4C)，而它們?cè)诜呕熐暗臒o(wú)應(yīng)答組中表達(dá)量并不高。與轉(zhuǎn)錄組學(xué)觀察結(jié)果一致的是，放化療后兩組之間差異豐富代謝物的功能富集揭示了與核苷酸生物合成相關(guān)的幾種途徑，包括哺乳動(dòng)物中嘌呤和嘧啶核苷酸的補(bǔ)救通路以及嘧啶脫氧核糖核苷酸的補(bǔ)救通路(圖4D)。放化療后，無(wú)應(yīng)答組患者樣品中與核苷酸生物合成相關(guān)的底物水平升高，包括次黃嘌呤、尿苷、鳥(niǎo)苷、腺苷和胸腺嘧啶(圖4E)。為了探索引起這種糞便代謝物差異的微生物種類(lèi)，研究人員整合基于代謝模型的代謝物和物種豐度，對(duì)微生物組-代謝組數(shù)據(jù)集進(jìn)行了無(wú)偏倚整合分析。有趣的是，研究人員順利預(yù)測(cè)了與核苷酸生物合成相關(guān)的幾種代謝物(如鳥(niǎo)苷和肌苷)會(huì)受到擬桿菌(包括B. ovatus、Bacteroides thetaiotaomicron、B. vulgatus和Bacteroides xylanisolvens)的調(diào)控(圖4F)。HUMAnN分析進(jìn)一步揭示了普通擬桿菌在核苷酸從頭合成通路中發(fā)揮主要作用(圖4G)。接下來(lái)，研究人員分析了細(xì)菌培養(yǎng)上清，發(fā)現(xiàn)普通擬桿菌可以產(chǎn)生許多與核苷酸生物合成相關(guān)的代謝物(圖4E)。綜上，這些數(shù)據(jù)揭示了普通擬桿菌來(lái)源的核苷酸生物合成在在宿主患者放化療反應(yīng)中的潛在作用。

圖4. 與直腸癌對(duì)nCRT反應(yīng)相關(guān)的核苷酸合成途徑。

(A-C)放化療前后，應(yīng)答組和無(wú)應(yīng)答組微生物轉(zhuǎn)錄組改變的功能富集。圖中展示了簡(jiǎn)化的細(xì)菌嘌呤(B)和嘧啶(C)生物合成途徑與已識(shí)別的反應(yīng)相關(guān)基因。Pre組中應(yīng)答組和無(wú)應(yīng)答組的糞便樣本分別為n=18和n=16。Post組中應(yīng)答組和無(wú)應(yīng)答組的糞便樣本分別為n=32和n=25。采用Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)計(jì)算統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。*p < 0.05，**p < 0.01。(D)放化療后應(yīng)答組和無(wú)應(yīng)答組糞便中基于VIP評(píng)分的差異豐富代謝物的富集途徑。(E)放化療后應(yīng)答組(n = 11)和無(wú)應(yīng)答組(n = 14)糞便中差異代謝物的絕對(duì)豐度。圖中展示了平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；通過(guò)非配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行比較；*p < 0.05，**p < 0.01。(F)網(wǎng)絡(luò)圖表示糞便微生物類(lèi)群(紅色節(jié)點(diǎn))對(duì)特定代謝物(綠色節(jié)點(diǎn))的顯著貢獻(xiàn)(校正后的p < 0.05)。(G)通過(guò)HUMAnN分析，不同細(xì)菌物種對(duì)腺苷核苷酸從頭生物合成I途徑的貢獻(xiàn)。  

5. 補(bǔ)充核苷可以保護(hù)癌細(xì)胞免受5-氟尿嘧啶和電離輻射處理的影響

研究人員試圖確定補(bǔ)充核苷酸生物合成源是否會(huì)影響癌細(xì)胞對(duì)化療和放療的反應(yīng)。研究人員在結(jié)直腸癌細(xì)胞中添加細(xì)胞滲透性核苷混合物(胞苷、尿苷、胸苷腺苷和鳥(niǎo)苷)，然后通過(guò)MTS實(shí)驗(yàn)和集落形成法測(cè)定其對(duì)5-氟尿嘧啶(5-FU)和電離輻射的敏感性。結(jié)果表明，外源性補(bǔ)充混合核苷以劑量依賴(lài)性方式顯著增加了癌細(xì)胞在5-FU(圖5A和5B)和輻射(圖5C和5D)處理后的存活率，而分別通過(guò)布喹那(BQN)或霉酚酸(MPA)阻斷嘧啶或嘌呤的從頭生物合成，降低了癌細(xì)胞在治療中的存活率(圖5A和5C)，這些結(jié)果強(qiáng)調(diào)在這些治療過(guò)程中核苷酸生物合成在癌細(xì)胞存活中的重要作用。有趣的是，我們觀察到外源性核苷在治療期間補(bǔ)救了BQN和MPA對(duì)癌細(xì)胞存活的影響(圖5A和圖5C)，表明外源性核苷補(bǔ)救在抗癌治療期間癌細(xì)胞存活中起著關(guān)鍵作用，同時(shí)通過(guò)核苷轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑S-(4-硝基芐基)-6-硫代肌苷(NBMPR)阻斷外源性核苷的攝取，減弱了混合核苷類(lèi)物質(zhì)對(duì)5-FU或放射治療的保護(hù)作用(圖5E-5G)。磷酸化組蛋白H2A變體(γH2AX)是DNA修復(fù)蛋白在受損染色質(zhì)位點(diǎn)組裝所必需的，輻照后γH2AX的持續(xù)表達(dá)已被用于監(jiān)測(cè)腫瘤細(xì)胞對(duì)DNA損傷的敏感性和修復(fù)。通過(guò)免疫熒光檢測(cè)4-Gy輻射24小時(shí)后γH2AX的表達(dá)，觀察到補(bǔ)充核苷組γH2AX病灶數(shù)量顯著減少。相反，盡管存在混合核苷，但額外的NBMPR導(dǎo)致輻照后γH2AX處于高水平(圖5H)。在5-FU治療后的結(jié)直腸癌細(xì)胞中也觀察到類(lèi)似的效應(yīng)(附圖2)。核苷補(bǔ)充不太可能防止輻射引起的DNA損傷，據(jù)報(bào)道DNA損傷后數(shù)秒內(nèi)就開(kāi)始修復(fù)。因此，補(bǔ)充的核苷可能是核苷酸生物合成的來(lái)源，促進(jìn)了癌細(xì)胞受損DNA的修復(fù)，導(dǎo)致γH2AX豐度降低?？傊?，這些體外結(jié)果表明，外源性核苷通過(guò)更有效的DNA損傷修復(fù)能力來(lái)保護(hù)結(jié)直腸癌細(xì)胞免受輻射和5-FU的影響。

圖5. 補(bǔ)充核苷可以保護(hù)癌細(xì)胞免受5-FU或輻射的影響。

(A-F)用100μM 5-FU(A)/4-Gy輻射(C)、混合核苷和嘧啶生物合成抑制劑BQN或嘌呤生物合成抑制劑MPA處理的HCT116結(jié)直腸癌細(xì)胞的活力或存活率。梯度濃度的混合核苷對(duì)5-FU(B)或4-Gy輻射(D)處理下HCT116細(xì)胞活力或存活率(輻射后第8天)的影響。胸苷的濃度是其他核苷的1/3。HCT116細(xì)胞經(jīng)100 μM 5-FU (E)或4-GY輻射(F)、30 μM混合核苷和核苷轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑NBMPR處理后的存活率。(A-F)中的數(shù)據(jù)顯示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；單因素方差分析；*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。(G)輻射后第8天HCT116細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)的代表性圖像(3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn))。(H) 4-Gy輻射24 h后HCT116細(xì)胞γH2AX染色的代表性圖像(3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn))(比例尺為5 μm)。  

6. 補(bǔ)充核苷或普通擬桿菌灌胃可保護(hù)異種移植瘤或原位腫瘤免受輻射或5-FU治療的影響

然后，研究人員進(jìn)一步研究了補(bǔ)充核苷對(duì)體內(nèi)輻射處理的異種移植物存活的影響。鑒于HCT116細(xì)胞是對(duì)輻射最敏感的細(xì)胞系之一，研究人員將其用于異種移植瘤模型。當(dāng)移植瘤平均大小達(dá)到64 mm3時(shí)，研究人員將小鼠隨機(jī)分為3組，每組接受對(duì)照或放療(RT)。RT組分別于輻射前24 h和輻射后72 h在瘤周注射核苷混合物(Nuc + RT)或PBS (PBS + RT)(圖6A)。通過(guò)免疫熒光分析了輻射暴露4小時(shí)后的腫瘤亞群。結(jié)果顯示，放療后腫瘤中γH2AX水平升高，但補(bǔ)充核苷混合物后其水平顯著降低(圖6B和附圖3A)。在攜帶MC38細(xì)胞(小鼠結(jié)腸腺癌細(xì)胞系)的免疫正常小鼠中也觀察到類(lèi)似效應(yīng)(附圖4)。在PBS+RT組中，RT幾乎阻止了腫瘤的生長(zhǎng)，但放療和核苷混合物的聯(lián)合治療略微減緩了腫瘤生長(zhǎng)(圖6C、6D和附圖3B)。這些體內(nèi)研究結(jié)果證實(shí)，外源性補(bǔ)充核苷混合物可保護(hù)結(jié)直腸癌細(xì)胞免受RT的影響。

研究人員接下來(lái)試圖分析普通擬桿菌(BV)，這一在放化療后無(wú)應(yīng)答臨床患者中核苷酸生物合成中起主要作用的優(yōu)勢(shì)物種(圖3C、3D和4E-4G)，是否會(huì)影響體內(nèi)的治療反應(yīng)。為了模擬臨床患者的結(jié)直腸腫瘤與腸道微生物群之間的相互作用，研究人員通過(guò)將MC38細(xì)胞注射到小鼠盲腸壁上建立了原位結(jié)直腸癌模型。由于對(duì)小鼠盲腸中的原位腫瘤進(jìn)行精確輻射具有局限性，研究人員還利用5-FU為基礎(chǔ)的化療方案，該方案可引起DNA損傷(尤其是S期雙鏈斷裂)，以評(píng)估普通擬桿菌對(duì)原位腫瘤小鼠模型的作用(圖6E)。接種兩天后，小鼠隨機(jī)分為對(duì)照、普通擬桿菌灌胃(BV)、5-FU、5-FU與BV組合(5-FU+BV)、5-FU與BV和NBMPR組合(5-FU+BV+NBMPR)組(圖6F-6I)。研究人員分析了普通擬桿菌給藥四個(gè)周期后的腫瘤亞群。BV組和對(duì)照組之間的腫瘤大小沒(méi)有明顯變化(圖6F和6G)，表明BV在沒(méi)有治療的情況下不能加速腫瘤生長(zhǎng)。然后，研究人員還比較了5-FU、5-FU+BV和5-FU+BV+NBMPR組的腫瘤體積，發(fā)現(xiàn)與臨床患者的觀察結(jié)果一致，即普通擬桿菌給藥極大地減弱了5-FU治療的效果，而這種減弱可以通過(guò)核苷轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑NBMPR逆轉(zhuǎn)(圖6I)。同樣，與5-FU組相比，BV+5-FU組的γH2AX水平下降，而在NBMPR給藥后上升(圖6H)。總之，這些結(jié)果表明，普通擬桿菌介導(dǎo)的核苷酸生物合成可以保護(hù)原位結(jié)直腸腫瘤免受5-FU治療的影響。

圖6. 補(bǔ)充核苷或BV可保護(hù)異種移植瘤或原位腫瘤免受輻射或5-FU治療的影響。

(A) HCT116異種轉(zhuǎn)移瘤模型的原理設(shè)計(jì)。分別于放療前1天和放療后第3天經(jīng)瘤周注射核苷混合物(Nuc)。(B)用抗γH2AX抗體(每組3只小鼠)通過(guò)免疫熒光分析放療4 h后各組小鼠腫瘤的代表性圖像(比例尺，5 μm)。(C和D)輻射后第5天各治療組間腫瘤體積的比較(n = 6只/組，均值±標(biāo)準(zhǔn)差，單因素方差分析)。(E-G) MC38原位小鼠模型的時(shí)間線(xiàn)示意圖和化療方案。BV, 普通擬桿菌；i.p. 腹腔注射。NBMPR，核苷轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑。(F)顯示了代表性的原位腫瘤，(G)計(jì)算相應(yīng)治療組原位小鼠模型的腫瘤體積(對(duì)照組n =5只，BV組n =6只，均值±標(biāo)準(zhǔn)差，t檢驗(yàn))。(H)各治療組γH2AX免疫組化結(jié)果。下圖為原位小鼠腫瘤和鄰近小腸的蘇木精-伊紅(H&E)染色形態(tài)學(xué)圖像(比例尺，100 μm)。(I)計(jì)算各治療組的原位腫瘤體積(n = 6只/組，均值±標(biāo)準(zhǔn)差，單因素方差分析)。 ?p < 0.05。  

7. DNA修復(fù)和核苷水平與直腸癌患者的放療反應(yīng)相關(guān)

由于外源性核苷酸生物合成在化放療反應(yīng)中具有關(guān)鍵作用，研究人員進(jìn)行了基因富集分析，以確定直腸癌患者放療相關(guān)腫瘤組織的轉(zhuǎn)錄組變化?；赥CGA數(shù)據(jù)庫(kù)中直腸癌患者的敏感和耐藥數(shù)據(jù)，研究人員觀察到參與DNA修復(fù)的基因在無(wú)應(yīng)答腫瘤中表達(dá)增加(圖7A和7B)。DNA修復(fù)基因集中靠前的子集包括兩個(gè)成熟的核苷酸補(bǔ)救合成基因，HPRT和APRT47，強(qiáng)調(diào)了放療期間核苷酸補(bǔ)救合成的重要性。研究人員還觀察到與含核苷酸化合物運(yùn)輸相關(guān)的基因富集(圖7C)，如SLC29A1和SLC35B3。SLC29A1定位于血漿和線(xiàn)粒體膜，可介導(dǎo)細(xì)胞從周?chē)橘|(zhì)中攝取核苷(特別是腺苷)。同樣，在化療后無(wú)反應(yīng)的直腸癌患者的血漿(圖7D)和腫瘤組織(圖7E)中，與核苷酸生物合成有關(guān)的代謝物水平升高。這些數(shù)據(jù)表明，已鑒定的核苷轉(zhuǎn)運(yùn)體和代謝物在治療后癌細(xì)胞存活或在核苷從頭生物合成活性有限或低效的情況下具有有益作用。血清尿酸是外源和內(nèi)源性嘌呤代謝的產(chǎn)物，其豐度隨核苷生物合成活動(dòng)發(fā)生變化，這啟發(fā)我們分析其在直腸癌患者血清中的水平，以尋找潛在的臨床應(yīng)用。放化療后無(wú)應(yīng)答(TRG2和TRG3)的直腸癌患者血清尿酸水平升高(圖7F)。二元邏輯回歸分析顯示，LARC患者nCRT后血清尿酸水平與預(yù)后不良相關(guān)(圖7G)。此外，放化療后血清尿酸每增加1 μM，預(yù)后不良的風(fēng)險(xiǎn)就會(huì)增加0.46%(圖7G)。尿酸水平在預(yù)測(cè)獨(dú)立數(shù)據(jù)集的直腸癌患者對(duì)放化療的反應(yīng)方面表現(xiàn)一般(曲線(xiàn)下面積=0.732)(圖7H)，這提高了尿酸水平可能用于評(píng)估直腸癌患者放化療后預(yù)后的可能性。

圖7. DNA修復(fù)和核苷水平與直腸癌患者對(duì)放療的反應(yīng)相關(guān)。

(A-C)直腸癌患者放療相關(guān)敏感和耐藥腫瘤組織的轉(zhuǎn)錄組基因集富集分析。(D和E)放化療后無(wú)應(yīng)答直腸癌患者血漿(D，應(yīng)答組n=14，無(wú)應(yīng)答組n=20)和腫瘤組織(E，應(yīng)答組n=12，無(wú)應(yīng)答組n=26)中核苷酸生物合成相關(guān)代謝物水平升高。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差展示；通過(guò)非配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行比較；*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。(F)放化療后應(yīng)答(TRG0和TRG1)和無(wú)應(yīng)答(TRG2和TRG3)直腸癌患者的尿酸水平。箱線(xiàn)圖展示最小值和最大值、四分位數(shù)、中位數(shù)以及離群值。采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)確定四組中位數(shù)之間的差異，用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)來(lái)比較每對(duì)的差異。TRG0、TRG1、TRG2和TRG3的n=199、253、257和26。**p < 0.01, ***p < 0.001。(G) 551名直腸癌患者的預(yù)后與三個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)的尿酸豐度之間的二元邏輯回歸分析。橫軸為放化療后尿酸水平的豐度(Post2)，縱軸為患者預(yù)后，0為改善，1為惡化。(H)根據(jù)551名直腸癌患者不同時(shí)間點(diǎn)的尿酸豐度構(gòu)建的廣義線(xiàn)性模型，研究了獨(dú)立數(shù)據(jù)集184名直腸癌患者尿酸水平對(duì)放化療反應(yīng)的預(yù)測(cè)性能。  

討論

術(shù)前放化療已應(yīng)用于直腸癌、胃腺癌、食管癌等多種癌癥的治療。不幸的是，許多患者對(duì)該療法反應(yīng)甚微或出現(xiàn)耐藥性，這阻礙了該療法的臨床應(yīng)用。為了解決這一問(wèn)題，研究人員以直腸癌為模型來(lái)解讀癌癥患者對(duì)nCRT耐藥的機(jī)制，并證明腸道微生物介導(dǎo)的核苷酸合成能夠調(diào)節(jié)LARC患者對(duì)nCRT的反應(yīng)。

核苷酸代謝的增加是癌癥的一個(gè)標(biāo)志，可以合成用于DNA復(fù)制和細(xì)胞生物能量的嘧啶和嘌呤，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞不受控制的生長(zhǎng)。抑制DNA中核苷酸合成的治療方式被廣泛用于控制腫瘤生長(zhǎng)和誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。放化療可以通過(guò)破壞癌細(xì)胞的DNA來(lái)根除癌細(xì)胞或控制其增殖。因此，獲取用于修復(fù)受損DNA的核苷酸可能是腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性的原因。本研究的多組學(xué)分析揭示，在受輻射的菌群和對(duì)放化療無(wú)反應(yīng)的腫瘤中，參與核苷酸生物合成和DNA修復(fù)的分子的豐度增加。核苷酸補(bǔ)救合成途徑與從頭合成途徑的相對(duì)貢獻(xiàn)可能取決于生長(zhǎng)條件或特定組織。在以前的研究中，有人認(rèn)為循環(huán)核苷酸的濃度太低，無(wú)法僅通過(guò)補(bǔ)救合成途徑滿(mǎn)足腫瘤的核苷酸需求。最近，有研究發(fā)現(xiàn)核苷酸補(bǔ)救合成途徑及其代謝物可以在低葡萄糖條件下促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。胞苷可以通過(guò)尿苷-胞苷激酶產(chǎn)生的單磷酸胞苷更直接地通過(guò)補(bǔ)救途徑合成。嘌呤補(bǔ)救合成途徑比嘌呤從頭合成使用更少的三磷酸腺苷，因此，核苷酸補(bǔ)救合成途徑能量效率更高，可能賦予癌細(xì)胞更多生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。體外功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明，外源補(bǔ)充核苷通過(guò)更有效的DNA修復(fù)能力增加了結(jié)直腸癌細(xì)胞在輻射或5-FU治療中的存活率(圖5)，但是目前還不清楚體外使用的核苷濃度是否完全代表直腸癌的腫瘤微環(huán)境。

越來(lái)越多的證據(jù)顯示，腸道微生物的組成與其宿主的生理和病理狀態(tài)有關(guān)，包括癌癥的發(fā)生和發(fā)展以及腫瘤對(duì)治療的敏感性。然而，驅(qū)動(dòng)腫瘤細(xì)胞耐藥性的生物機(jī)制和宿主-微生物相互作用尚未闡明。在這項(xiàng)研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)nCRT治療后患者具有獨(dú)特的糞便微生物群落。多組學(xué)分析以及體外和體內(nèi)的功能驗(yàn)證結(jié)果表明，微生物介導(dǎo)的核苷酸合成與直腸癌患者對(duì)nCRT的耐藥性有關(guān)。同樣，以前發(fā)表的一些研究揭示了微生物群衍生或介導(dǎo)的核苷酸代謝對(duì)宿主健康和腸道疾病嚴(yán)重程度的影響。例如，腸道菌群中的部分細(xì)菌可以加強(qiáng)宿主嘌呤的代謝，從而加劇小鼠模型中的結(jié)腸炎，而微生物群衍生的嘌呤是粘液屏障功能和傷口愈合的關(guān)鍵底物來(lái)源。腸道微生物是人類(lèi)腸腔內(nèi)的共生生物，與直腸腫瘤緊密相關(guān)。即使體循環(huán)中與核苷酸生物合成有關(guān)的代謝物的濃度不是很高，但直腸腫瘤組織和微生物群之間的空間毗鄰關(guān)系可能有利于它們的相互作用，微生物群衍生的低濃度核苷也可能到達(dá)直腸腫瘤。相應(yīng)地，在化療后無(wú)反應(yīng)的直腸癌患者的腫瘤組織中觀察到與核苷酸生物合成有關(guān)的代謝物水平升高(圖7E)。雖然細(xì)菌核苷與直腸腫瘤治療反應(yīng)之間的確鑿因果關(guān)系需要在未來(lái)的研究中進(jìn)一步確定，但可以推斷的是，微生物群介導(dǎo)的核苷酸生物合成在調(diào)節(jié)直腸腫瘤對(duì)放化療的反應(yīng)中發(fā)揮了不可或缺的作用。

有趣的是，觀察到LARC患者放化療后血清尿酸水平與預(yù)后不良相關(guān)(圖7F-7H)。尿酸不僅是一種隨核苷酸生物合成活性波動(dòng)的下游代謝物，還可以作為一種抗氧化劑，在人體防御氧化應(yīng)激中發(fā)揮作用。因此，直腸癌細(xì)胞中尿酸水平升高可能保護(hù)腫瘤細(xì)胞免受氧化損傷，提高放化療后腫瘤細(xì)胞的存活率。以前也有研究表明，尿酸可以通過(guò)抑制尿苷單磷酸合成酶和積累5-FU的競(jìng)爭(zhēng)物質(zhì)乳清酸來(lái)降低結(jié)直腸癌細(xì)胞對(duì)5-FU的敏感性，這進(jìn)一步支持了本文關(guān)于尿酸參與直腸癌放化療敏感性的結(jié)論。在本研究中，血清尿酸水平可用于預(yù)測(cè)獨(dú)立數(shù)據(jù)集直腸癌患者的反應(yīng)。這表明，尿酸作為嘌呤代謝的下游代謝物，可用于評(píng)估直腸癌患者放化療后的預(yù)后，但在未來(lái)的研究中，尿酸對(duì)放化療療效影響的具體機(jī)制還需要大樣本驗(yàn)證。  

綜上所述，作者在此提出了直腸腫瘤對(duì)放化療的反應(yīng)可由腸道微生物群介導(dǎo)的核苷酸生物合成調(diào)節(jié)的概念，本研究的數(shù)據(jù)強(qiáng)調(diào)了考慮癌細(xì)胞和腸道微生物群之間的相互作用對(duì)于深入了解癌癥患者對(duì)臨床治療反應(yīng)的機(jī)制的重要性。

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