本發(fā)明屬于化合物提取領(lǐng)域，尤其涉及一種番石榴葉三萜類化合物的提純方法。

背景技術(shù)：

番石榴(psidiumguajavalinn.)桃金娘科喬木，原產(chǎn)南美洲。中國華南各地栽培，常見有逸為野生種，北達(dá)四川西南部的安寧河谷，生于荒地或低丘陵上；果供食用；葉含揮發(fā)油及鞣質(zhì)等，供藥用，有止痢、止血、健胃等功效；葉經(jīng)煮沸去掉鞣質(zhì)，曬干作茶葉用，味甘，有清熱作用。對(duì)番石榴葉的化學(xué)成分研究表明：番石榴葉中含有蛋白質(zhì)、多糖、多酚、黃酮類化合物和三萜類化合物等。三萜類化合物(triterpenoids)是指在生源關(guān)系上由鯊烯衍生而來的萜類物質(zhì)，通常由6個(gè)異戊二稀結(jié)構(gòu)單元聯(lián)結(jié)而成，構(gòu)成含有30個(gè)碳原子的化合物，廣泛存在于菌類﹑蕨類﹑單子葉﹑雙子葉植物以及動(dòng)物和海洋生物中。據(jù)研究，三萜類化合物具有抗癌、抗炎、抗菌、抗病毒、降低膽固醇、殺軟體動(dòng)物等活性，因而具有很強(qiáng)的研究和開發(fā)價(jià)值。

為數(shù)不多的現(xiàn)有技術(shù)中，三萜類化合物的提取一般多采用傳統(tǒng)的溶劑萃取法，傳統(tǒng)方法提取時(shí)間較長、工藝繁瑣而且純度較低，難以滿足現(xiàn)代化發(fā)展的需求。且目前，尚未見番石榴葉三萜類化合物的提取純化方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，克服以上背景技術(shù)中提到的不足和缺陷，提供一種番石榴葉三萜類化合物的提純方法。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提出的技術(shù)方案為提供一種番石榴葉三萜類化合物的提純方法，包括如下步驟：

(1)將新鮮的番石榴葉清潔、烘干、粉碎成粉末后，過篩備用；

(2)以體積濃度為75％的乙醇作為浸提液，用超聲波提取法對(duì)所述步驟(1)后得到的番石榴葉粉末進(jìn)行浸提，收集提取液，該提取液為三萜類粗提液；

(3)將所述步驟(2)后得到的三萜類粗提液進(jìn)行抽濾并收集濾液，然后濃縮濾液并收集濃縮液，過濾得到三萜類富集物；

(4)將所述步驟(3)后得到的三萜類富集物采用ab-8大孔吸附樹脂吸附三萜類物質(zhì)，洗脫后即獲得純化的番石榴葉三萜類化合物。

采用的超聲波提取法需要的溶劑較少，提取的時(shí)間短、產(chǎn)品的含量高和操作簡(jiǎn)單方便，超聲波提取番石榴葉中三萜類化合物具有可行性。本發(fā)明以體積濃度為75％的乙醇作為浸提液，相較于甲醇毒性大易殘留，乙醇無毒易分離，且75％的體積濃度的浸提效果更好。

不同類型的樹脂對(duì)不同天然產(chǎn)物(如多酚、黃酮、萜類等)的吸附特性不一樣，ab-8型大孔吸附樹脂是苯乙烯型弱極性共聚體，比表面積高于dm-301，最適宜水溶性、具有弱極性物質(zhì)的提取、分離、純化，因此本發(fā)明的番石榴葉中三萜類化合物純化適合采用ab-8樹脂。

上述的提純方法，優(yōu)選的，所述步驟(1)中，過篩為過40-60目篩。

優(yōu)選的，所述步驟(2)中，超聲波提取法采用的超聲頻率為800-1000w，番石榴葉與乙醇的料液比為1:10-15g/ml，提取溫度為25-30℃。

優(yōu)選的，所述步驟(2)中，浸提的次數(shù)為2-4次，總提取時(shí)間為30-35min，其中每次超聲提取的時(shí)間不低于2s，間歇時(shí)間不低于0.5s。

優(yōu)選的，所述步驟(3)中，抽濾為真空抽濾，所述濃縮濾液采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮。

優(yōu)選的，所述步驟(3)中，過濾用有機(jī)微孔濾膜進(jìn)行過濾，所述有機(jī)微孔濾膜的微孔直徑不大于0.45μm。

有機(jī)微孔濾膜為高分子聚合物在特殊工藝條件下制成的一種耐各種有機(jī)溶劑的篩網(wǎng)型精密濾材，產(chǎn)品化學(xué)性能穩(wěn)定，適應(yīng)范圍廣，在有機(jī)溶劑長時(shí)間浸泡下，不易發(fā)生膨脹、溶解、變形、破壞或變質(zhì)。

優(yōu)選的，所述步驟(4)中，采用大孔吸附樹脂吸附三萜類物質(zhì)的具體操作包括如下步驟：對(duì)大孔吸附樹脂進(jìn)行預(yù)處理，樹脂上柱，樣液上柱，大孔吸附樹脂解吸，洗脫以及洗脫液后續(xù)處理。

大孔吸附樹脂是一種常用的分離純化天然活性物質(zhì)的方法，原理是：先用大孔樹脂吸附三萜類化合物，再用乙醇溶液把吸附好的三萜類化合物洗脫下來進(jìn)行收集。其具體操作步驟為：1)裝柱：大孔吸附樹脂先用95％的乙醇浸泡24h，采用濕法裝柱，再用95％的乙醇沖洗樹脂至流出液與水1：2混合不產(chǎn)生白色混濁，最后改用大量水洗，至無乙醇味為止；2)濕法上樣：樣液濃度為0.8mg/ml的三萜類富集物，ph＝6.0，上柱流速為2bv/h；一般來說：大孔樹脂與進(jìn)料液的體積比為(8-10):1，從而保障絕大部分的三萜類富集物會(huì)吸附到大孔樹脂上；3)洗脫：所述清洗為用體積濃度為65％的乙醇以2bv/h進(jìn)行清洗，純的三萜類化合物就會(huì)逐步洗脫下來，進(jìn)行收集后進(jìn)行后續(xù)的高效液相色譜分析。

更優(yōu)選的，所述樣液上柱中，樣液為濃度為0.8mg/ml的三萜類富集物，ph＝6.0，上柱流速為2bv/h；所述洗脫用體積濃度為65％的乙醇以2bv/h的流速進(jìn)行洗脫。

優(yōu)選的，所述步驟(4)中，采用高效液相色譜法測(cè)定洗脫后得到的洗脫液中三萜類化合物的含量，含量達(dá)到要求后即獲得純化的番石榴葉三萜類化合物。

通過高效液相色譜檢測(cè)和分析，可準(zhǔn)確分析最后得到的三萜類化合物的純度，根據(jù)純度可考慮是否進(jìn)一步提純，有效提高純度。

更優(yōu)選的，采用高效液相色譜法測(cè)定是采用hypersilc18柱進(jìn)行檢測(cè)，流動(dòng)相為乙腈-水，檢測(cè)波長205nm；所述hypersilc18柱的規(guī)格為4.6×200mm，5μm，柱溫為30℃；所述乙腈的質(zhì)量百分比從5％增至100％，乙腈的流速為0.6ml/min。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

1、本發(fā)明的提純方法，建立了超聲波提取法、大孔吸附樹脂純化和高效液相色譜法(hplc)一體的分離純化方法，具有耗能少，提取速度快、產(chǎn)率和純度高的優(yōu)點(diǎn)，相比常規(guī)的溶劑萃取法的產(chǎn)率提高了60％以上，純度由原來的60-65％提高到了90％以上。

2、本發(fā)明的提純方法，采用的超聲波提取法需要的溶劑較少、提取的時(shí)間短、產(chǎn)品的含量高和操作簡(jiǎn)單方便，超聲波提取番石榴葉中三萜類化合物具有可行性。

具體實(shí)施方式

為了便于理解本發(fā)明，下文將結(jié)合較佳的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做更全面、細(xì)致地描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于以下具體實(shí)施例。

除非另有定義，下文中所使用的所有專業(yè)術(shù)語與本領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解含義相同。本文中所使用的專業(yè)術(shù)語只是為了描述具體實(shí)施例的目的，并不是旨在限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。

除非另有特別說明，本發(fā)明中用到的各種原材料、試劑、儀器和設(shè)備等均可通過市場(chǎng)購買得到或者可通過現(xiàn)有方法制備得到。

實(shí)施例1：

一種本發(fā)明的番石榴葉三萜類化合物的提純方法，包括如下步驟：

(1)將新鮮番石榴葉清潔、烘干、粉碎成粉末后，過40篩備用；

(2)以體積濃度為75％的乙醇作為浸提液，用超聲波提取法對(duì)所述步驟(1)后得到的番石榴葉粉末進(jìn)行浸提，收集提取液，該提取液為三萜類粗提液；浸提的次數(shù)為2次，總提取時(shí)間為32min，超聲頻率為850w，番石榴葉與乙醇的料液比為1:15g/ml，提取溫度為30℃，收集提取液，該提取液為三萜類粗提液；

(3)將所述步驟(2)后得到的三萜類粗提液進(jìn)行真空抽濾并收集濾液，然后采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮并收集濃縮液，用0.45μm的有機(jī)微孔濾膜過濾得到三萜類富集物；

(4)將所述步驟(3)后得到的三萜類富集物采用大孔吸附樹脂進(jìn)行吸附以實(shí)現(xiàn)三萜類物質(zhì)的純化，包括大孔吸附樹脂預(yù)處理，樹脂上柱，樣液上柱，大孔吸附樹脂的解吸，大孔吸附樹脂的清洗、再生以及洗脫液后續(xù)處理(樹脂采用ab-8樹脂，上柱的樣液為濃度為0.8mg/ml的三萜類富集物，ph＝6.0，上柱流速為2bv/h，用體積濃度為65％的乙醇以2bv/h進(jìn)行清洗)，然后采用高效液相色譜法測(cè)定番石榴葉中三萜類化合物的含量(采用hypersilc18柱進(jìn)行檢測(cè)，4.6×200mm，5μm；流動(dòng)相為乙腈-水，乙腈的質(zhì)量百分比從5％增至100％，乙腈的流速為0.6ml/min，檢測(cè)波長205nm)，含量達(dá)到要求后即獲得純化的番石榴葉三萜類化合物。

該方法提純的番石榴葉三萜類化合物，經(jīng)檢測(cè)，產(chǎn)率為三萜類富集物中的72.8％左右，純度為90.1％左右。

實(shí)施例2：

一種本發(fā)明的番石榴葉三萜類化合物的提純方法，包括如下步驟：

(1)將新鮮番石榴葉清潔、烘干、粉碎成粉末后，過60篩備用；

(2)以體積濃度為75％的乙醇作為浸提液，用超聲波提取法對(duì)所述步驟(1)后得到的番石榴葉粉末進(jìn)行浸提，收集提取液，該提取液為三萜類粗提液；浸提的次數(shù)為4次，總提取時(shí)間為35min，超聲頻率為800w，番石榴葉與乙醇的料液比為1:15g/ml，提取溫度為28℃，收集提取液，該提取液為三萜類粗提液；

(3)將所述步驟(2)后得到的三萜類粗提液進(jìn)行真空抽濾并收集濾液，然后采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮并收集濃縮液，用0.45μm的有機(jī)微孔濾膜過濾得到三萜類富集物；

(4)將所述步驟(3)后得到的三萜類富集物采用大孔吸附樹脂進(jìn)行吸附以實(shí)現(xiàn)三萜類物質(zhì)的純化，包括大孔吸附樹脂預(yù)處理，樹脂上柱，樣液上柱，大孔吸附樹脂的解吸，大孔吸附樹脂的清洗、再生以及洗脫液后續(xù)處理(樹脂采用ab-8樹脂，上柱的樣液為濃度為0.8mg/ml的三萜類富集物，ph＝6.0，上柱流速為2bv/h，用體積濃度為65％的乙醇以2bv/h進(jìn)行清洗)，然后采用高效液相色譜法測(cè)定番石榴葉中三萜類化合物的含量(采用hypersilc18柱進(jìn)行檢測(cè)，4.6×200mm，5μm；流動(dòng)相為乙腈-水，乙腈的質(zhì)量百分比從5％增至100％，乙腈的流速為0.6ml/min，檢測(cè)波長205nm)，含量達(dá)到要求后即獲得純化的番石榴葉三萜類化合物。

該方法提純的番石榴葉三萜類化合物，經(jīng)檢測(cè)，產(chǎn)率為三萜類富集物中的73.6％左右，純度為93.7％左右。

對(duì)比例1：

一種番石榴葉三萜類化合物的提純方法，包括如下步驟：

(1)將新鮮番石榴葉清潔、烘干、粉碎成粉末后，過40篩備用；

(2)取所述步驟(1)后得到的番石榴葉粉末，加入8倍量50％的甲醇，回流提取三次，每次為1.5h，過濾，合并濾液，回收溶劑至浸膏狀；

(3)將所述步驟(2)制得的浸膏用水分散，用氯仿萃取3次，合并氯仿層，減壓濃縮到原體積的1/3，用飽和碳酸氫鈉溶液堿化，取氯仿層部分濃縮，得到棕色浸膏并用硅膠柱層析分離，得到提純的三萜類化合物。

該方法提純的番石榴葉三萜類化合物，經(jīng)檢測(cè)，產(chǎn)率為三萜類富集物中的45％左右，純度為65％左右。

對(duì)比例2：

一種番石榴葉三萜類化合物的提純方法，包括如下步驟：

(1)將新鮮番石榴葉清潔、烘干、粉碎成粉末后，過40篩備用；

(2)取所述步驟(1)后得到的番石榴葉粉末，加入8倍量50％的甲醇，回流提取三次，每次為1.5h，過濾，合并濾液，回收溶劑至浸膏狀；

(3)將所述步驟(2)制得的浸膏用水分散，用水飽和的乙酸乙酯萃取，合并萃取液，回收溶劑得浸膏，干燥；

(4)將所述步驟(3)后得到的三萜類富集物用50％乙醇溶解，采用大孔吸附樹脂進(jìn)行吸附以實(shí)現(xiàn)三萜類物質(zhì)的純化，包括大孔吸附樹脂預(yù)處理，樹脂上柱，樣液上柱，大孔吸附樹脂的解吸，大孔吸附樹脂的清洗、再生以及洗脫液后續(xù)處理(樹脂采用ab-8樹脂，上柱的樣液為濃度為0.8mg/ml的三萜類富集物，ph＝6.0，上柱流速為2bv/h，用體積濃度為65％的乙醇以2bv/h進(jìn)行清洗)。

該方法提純的番石榴葉三萜類化合物，經(jīng)檢測(cè)，產(chǎn)率為三萜類富集物中的60％左右，純度為73％左右。

本發(fā)明的提純方法，建立了超聲波提取法、大孔吸附樹脂純化和高效液相色譜法(hplc)一體的分離純化方法，具有耗能少，提取速度快、產(chǎn)率和純度高的優(yōu)點(diǎn)，相比常規(guī)的溶劑萃取法的產(chǎn)率提高了60％以上，純度由原來的60-65％提高到了90％以上。

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