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細胞培養(yǎng)生物污染有哪些？

來源：泰然健康網(wǎng) 時間：2024年11月28日 00:34

生物污染簡介

細胞培養(yǎng)物污染往往是細胞培養(yǎng)實驗室中最常見的問題，有時會造成非常嚴(yán)重的后果。細胞培養(yǎng)污染物可分為兩大類，一類是化學(xué)污染物，如培養(yǎng)基、血清和水中的雜質(zhì)，包括內(nèi)毒素、增塑劑和洗滌劑，另一類是生物污染物，如細菌、霉菌、酵母、病毒和支原體，以及其他細胞系的交叉污染。雖然污染無法完全消除，但可以通過全面了解其來源并遵循良好的無菌技術(shù)來降低污染的發(fā)生頻率和嚴(yán)重性。這里將概述主要的生物污染類型。

01 細菌

細菌是一大類普遍存在的單細胞微生物。細菌的直徑通常只有幾微米，其形狀多樣，如球狀、桿狀和螺旋狀等。由于分布廣泛、生長迅速和體積大小等特點，細菌以及酵母和霉菌是細胞培養(yǎng)中最常見的生物污染物。細菌污染在培養(yǎng)物感染后幾天內(nèi)就很容易被肉眼觀察到；受感染的培養(yǎng)物通常會變得渾濁，有時表面會有一層薄膜。經(jīng)常還會出現(xiàn)培養(yǎng)基的pH值突然下降的情況。在低倍顯微鏡下，細菌以細小顆粒的形式出現(xiàn)在細胞之間，在高倍顯微鏡下觀察可以分辨出單個細菌的形狀。下面的模擬圖像顯示了貼壁培養(yǎng)的293細胞被大腸桿菌污染。

02 酵母

酵母是真菌界中的單細胞真核微生物，大小從幾微米（常見）到40μm（罕見）不等。與細菌污染一樣，被酵母污染的培養(yǎng)物會變得混濁，尤其是在污染的后期。被酵母污染的培養(yǎng)物，其pH值幾乎沒有變化，通常直到污染嚴(yán)重時，pH值才會升高。在顯微鏡下，酵母呈單個卵球形或球形顆粒，可能還會出芽產(chǎn)生更小的顆粒。下面的模擬圖像顯示了貼壁293細胞鋪板24小時后被酵母感染的情況。

03 黑膠蟲

黑膠蟲是一種生物還是非生物，學(xué)術(shù)界至今還有爭議。這里我們暫且將其認作是一種微生物。黑膠蟲污染主要來源于血清。黑膠蟲的出現(xiàn)常在培養(yǎng)條件改變、細胞接種密度降低、細胞狀態(tài)不佳時顯現(xiàn)并使實驗中斷，尤其在凍存細胞復(fù)蘇時可造成大量細胞死亡。黑膠蟲生長與細胞的生長有此消彼長的關(guān)系，即當(dāng)細胞狀態(tài)好時小黑點會相應(yīng)的減少；反之則增加，似乎有細胞競爭生長的關(guān)系。

黑膠蟲污染的特點是起初對細胞并無影響，當(dāng)達到一定數(shù)量時則會影響細胞生長。受黑膠蟲污染的細胞液通常清亮無變化，在高倍顯微鏡下可以觀察到點狀片狀的游動小體，做布朗運動。

04 支原體

支原體是最小的（0.3 μm）能夠自我復(fù)制的有機體，倒置顯微鏡下通常觀察不到。支原體沒有細胞壁，對常用的抗生素不敏感。支原體感染是極為不易察覺的，可能直到出現(xiàn)了可以觀察到的病變或發(fā)現(xiàn)細胞正常功能喪失的時候，才意識到是發(fā)生了支原體感染。一些生長緩慢的支原體可在培養(yǎng)物中持續(xù)存活，而不會導(dǎo)致細胞死亡，但它們可以改變培養(yǎng)體系中宿主細胞的行為和代謝。慢性支原體感染的可能表現(xiàn)包括：細胞增殖率降低、飽和密度下降以及懸浮培養(yǎng)物凝集；但是，檢測支原體污染的唯一可靠方法是通過使用熒光染色（例如Hoechst33258染色）、ELISA、PCR、免疫染色、放射自顯影或微生物測定法定期檢測培養(yǎng)物。

05 霉菌

霉菌是真菌界的真核微生物，以多細胞絲狀體生長，稱為菌絲。這些多細胞絲狀體構(gòu)成的交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)含有遺傳性相同的細胞核，被稱為集落或菌絲體。與酵母污染相似，培養(yǎng)物的pH值在污染的初期保持穩(wěn)定，然后隨著培養(yǎng)物感染程度加劇而迅速增加，并變得渾濁。在顯微鏡下，菌絲體通常呈細長的絲狀體，有時呈密集的孢子團。許多種霉菌的孢子在休眠階段能夠耐受極其惡劣和不宜生長的環(huán)境，當(dāng)其遇到合適的生長條件時才會被激活。

06 病毒

病毒是一種微小的感染性病原體，利用宿主細胞的結(jié)構(gòu)進行繁殖。它們的體積極小，難以在培養(yǎng)中被檢測到，也難以從細胞培養(yǎng)實驗室使用的試劑中去除。由于大多數(shù)病毒對宿主有非常嚴(yán)格的要求，因此，它們通常不會對宿主以外物種的細胞培養(yǎng)物產(chǎn)生不良影響。但被病毒感染的細胞培養(yǎng)物會對實驗室人員造成嚴(yán)重的健康威脅，尤其是當(dāng)實驗室培養(yǎng)的是人類或靈長類的細胞時。要檢測細胞培養(yǎng)物是否被病毒感染，可以使用電子顯微鏡觀察、用抗體組合進行免疫染色、ELISA檢測或是使用合適的病毒引物進行PCR擴增。

07 交叉污染

雖然不如微生物污染普遍，但許多細胞系與HeLa以及其他快速生長細胞系之間的廣泛交叉污染已經(jīng)是一個明確的問題，會產(chǎn)生嚴(yán)重的后果。從值得信賴的細胞庫中獲取細胞系，定期檢查細胞系的特性，并使用良好的無菌技術(shù)進行操作，這些做法都將幫助您避免交叉污染。DNA指紋圖譜分析、核型分析和細胞亞型分析可以確定細胞培養(yǎng)物中是否存在交叉污染。

08 使用抗生素

請勿在常規(guī)細胞培養(yǎng)中使用抗生素，因為抗生素的連續(xù)使用會促進耐藥菌株的生長，并導(dǎo)致輕度污染持續(xù)存在。一旦將抗生素從培養(yǎng)基中去除，就會發(fā)展成大規(guī)模污染。抗生素的持續(xù)使用還可能掩蓋支原體感染和其他隱性污染。此外，某些抗生素可能會與細胞發(fā)生交叉反應(yīng)，干擾正在研究的細胞過程。抗生素只能作為對付污染的最后手段且只能短期使用，并應(yīng)盡快從培養(yǎng)物中去除。如果長期使用抗生素，則應(yīng)同時進行無抗生素培養(yǎng)，作為檢測隱性感染的對照。