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【資料】自由基損傷與神經(jīng)系統(tǒng)疾病

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自由基損傷與神經(jīng)系統(tǒng)疾病
一、自由基和氧化應(yīng)激
自由基是外部軌道中至少有一個(gè)不成雙電子的原子或分子。在需氧有機(jī)體中，含有氧和 / 或氮的自由基不斷的產(chǎn)生。在正常條件下，線粒體是氧自由基的主要來(lái)源。自由基可以和任何生物分子（蛋白質(zhì)、脂質(zhì)體、糖、DNA）反應(yīng)以改變它的結(jié)構(gòu)和功能。因此，活的有機(jī)體擁有豐富的抗氧化劑系統(tǒng)，其防護(hù)的主要目的是防止自由基侵犯其它分子。氧化應(yīng)激被定義為“氧化劑和抗氧化劑在氧化劑可能導(dǎo)致?lián)p傷中的不平衡”。腦梗塞、腦出血、顱腦外傷、蛛網(wǎng)膜下腔出血、腦膜炎、腦水腫、老年性癡呆、帕金斯癥、多發(fā)性硬化，甚至精神分裂癥，都應(yīng)當(dāng)注意自由基的損傷。
二、自由基的測(cè)定
由于自由基活性強(qiáng)，半衰期短，因此很難被直接測(cè)定。根據(jù)它們的變化是與基反應(yīng)的結(jié)果這一假設(shè)，許多研究用間接的方法來(lái)檢測(cè)自由基的產(chǎn)生，另外有人提出，抗氧化劑的變化反映了幾種病理狀態(tài)的氧化還原作用平衡的改變。換言之，抗氧化劑將會(huì)在與自由基的反應(yīng)中耗盡。因此，抗氧化劑濃度或活性的測(cè)量已經(jīng)被用作評(píng)估氧化應(yīng)激的數(shù)量。目前自由基的檢測(cè)大多是通過(guò)與其他分子如 DNA 、脂質(zhì)體或蛋白質(zhì)反應(yīng)的產(chǎn)物或抗氧化劑的水平來(lái)間接反映的。
三、自由基損傷的機(jī)制
大量證據(jù)表明，過(guò)氧化物和氧化氮通過(guò)許多獨(dú)立機(jī)制介導(dǎo)氧化損傷，產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用，包括：脂質(zhì)過(guò)氧化物、DNA 損傷，激活抗多聚二磷酸核糖腺苷抗體 poly（ADP-ribose）和聚腺苷二磷酸核糖基聚合酶 polymerase （PARP）。一旦自由基產(chǎn)生，自由基就可能和所有的細(xì)胞大分子反應(yīng)，導(dǎo)致脂質(zhì)體過(guò)氧化、DNA和蛋白質(zhì)的氧化。脂質(zhì)體過(guò)氧化可能導(dǎo)致膜損傷，而且脂質(zhì)體過(guò)氧化的最終產(chǎn)物，如 4-hydoxynonenal ，對(duì)神經(jīng)元和白質(zhì)包括軸突和少突膠質(zhì)細(xì)胞有毒性，并能夠?qū)е录?xì)胞死亡。對(duì)蛋白質(zhì)的損害，尤其是酶，可以導(dǎo)致其功能的損傷。最后 DNA 過(guò)氧化可以產(chǎn)生修復(fù)酶的活化作用，如多（ADP- 核糖酸）聚合酶（PARP），使得細(xì)胞內(nèi)能量迅速衰竭，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。
一氧化氮（NO）也是一種自由基，它在缺血過(guò)程中與被激活的 NO 合酶的同功酶的關(guān)系中顯示了雙重作用：由組成的內(nèi)皮氧化氮合酶產(chǎn)生的 NO 有血管擴(kuò)張作用，因此有神經(jīng)保護(hù)作用，而來(lái)自包含在小膠質(zhì)和內(nèi)皮的神經(jīng)元氧化氮和可誘導(dǎo)氧化氮的 NO，已經(jīng)顯示出了神經(jīng)毒性，至少部分地通過(guò)與超氧化物反應(yīng)，導(dǎo)致活性很高的過(guò)氧化亞硝酸鹽。氧化應(yīng)激可以引起神經(jīng)元壞死和細(xì)胞死亡。除了與細(xì)胞分子直接反應(yīng)，越來(lái)越多的證據(jù)顯示自由基也可以通過(guò)氧化還原敏感信號(hào)傳感途徑起作用。實(shí)驗(yàn)研究說(shuō)明自由基可以引起線粒體釋放細(xì)胞鉻，這是導(dǎo)致細(xì)胞死亡的重要一步。而且氧化應(yīng)激在腦缺血可引起的細(xì)胞凋亡。氧化應(yīng)激引起細(xì)胞死亡的另一個(gè)可能的原因是脫嘌呤apirimidinic核酸內(nèi)切酶的活性（APE/Ref-1）的減低。最后氧化還原已經(jīng)被證明激活了幾個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，尤其是 NF-kB 。 NF-kB 在短暫和永久缺血后被激活后可以導(dǎo)致脯氨酸死亡細(xì)胞基因的轉(zhuǎn)錄。
四、大腦尤其容易被自由基損傷的原因
腦組織對(duì)于自由基損傷缺乏足夠的抗氧劑保護(hù)作用。當(dāng)自由基戰(zhàn)勝了細(xì)胞抗氧化劑的防御，氧化應(yīng)激可能發(fā)生，導(dǎo)致細(xì)胞損傷。由于以下幾種原因，大腦尤其容易被自由基損傷：首先，它有豐富的多不飽和脂肪酸，多不飽和脂肪酸特別容易被自由基導(dǎo)致的過(guò)氧化反應(yīng)損傷。其次，抗氧化物酶含量低，如過(guò)氧化氫酶和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶。另外，腦組織含有鐵，雖然它的鐵含量不是很高，但鐵離子可以刺激自由基的產(chǎn)生。
五、自由基損傷與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的關(guān)系
1．自由基與腦梗死
動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)，嚴(yán)重缺血 30 分鐘后再灌注，多聚不飽和脂肪酸的共軛雙鍵增加，缺血再灌注后蛋白質(zhì)氧化增加，缺血 / 再灌注時(shí)，抗氧化劑 VC 、 VE 、輔酶 9 水平降低，超氧化物水平增加 ( 化學(xué)發(fā)光技術(shù) ) 。提示缺血再灌注時(shí)自由基增加。
臨床研究發(fā)現(xiàn)，中風(fēng)患者 VA,VC,VE 和類胡蘿卜素的水平低于健康人，腦缺血 2 天之后， TBARS 顯著增加。提示急性腦梗死自由基增加。
抗氧化劑治療： VC,VE 減小大鼠及靈長(zhǎng)類動(dòng)物缺血和再灌注后的梗死面積和神經(jīng)損傷， VE 預(yù)防有中風(fēng)傾向的高血壓大鼠因短暫缺血引起的神經(jīng)細(xì)胞凋亡， VE 缺乏的大鼠更容易受到脂類氧化的損傷，經(jīng)修飾過(guò)的 SOD( 可透過(guò) BBB) 可減輕缺血引起的腦損傷，提示抗氧化劑可以減少腦缺血及再灌注的損傷。有研究表明，抗氧化劑預(yù)防有中風(fēng)傾向的高血壓大鼠因短暫缺血引起的神經(jīng)細(xì)胞凋亡。
2．自由基損傷與腦出血
海馬 MDA（丙二醛）在腦出血后明顯升高，并隨時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸升高； DA 的升高早于水腫的產(chǎn)生，自由基增高幅度越大，水腫越嚴(yán)重。提示腦出血后自由基反應(yīng)增強(qiáng)，是腦出血后腦水腫的一個(gè)重要原因。
對(duì)高血壓大鼠模型，一組單獨(dú)使用 tPA ，另一組使用 tPA 和自由基清除劑。結(jié)果發(fā)現(xiàn) tPA 引起的出血被自由基清除劑降低 40% ，梗塞癥狀和神經(jīng)功能缺損也降低。提示自由基清除劑減輕與 tPA 引起的出血。
對(duì)兔子顱內(nèi)出血模型應(yīng)用自由基清除劑結(jié)果發(fā)現(xiàn)，自由基清除劑顯著降低出血量，與對(duì)照組相比，顯著改善行為評(píng)分。推論：自由基清除劑抑制腦組織的自由基損傷，因而能保護(hù)腦血管的完整性，從而減輕出血。
3．自由基與蛛網(wǎng)膜下腔出血
通過(guò)對(duì)蛛網(wǎng)膜下腔出血模型狗， 4, 7, 10, 14 或 21 天進(jìn)行血管造影，每組 4 只。靜脈注射水楊酸（100 mg/kg），用微型透析管對(duì)腦脊液分析 2,3/2,5 二羥基苯甲酸（DHBA），間接測(cè)量自由基變化。試驗(yàn)動(dòng)物處死時(shí)，測(cè)量腦橋部分離的蛛網(wǎng)膜凝血和基底動(dòng)脈丙二醛水平。結(jié)果：蛛網(wǎng)膜下腔出血后 4-14 天產(chǎn)生明顯的血管痙攣，丙二醛濃度只在蛛網(wǎng)膜下腔出血后 4 天顯著增加（p < 0.0001），二羥基苯甲酸在蛛網(wǎng)膜下腔出血后 4 天顯著增加（p < 0.05），基底動(dòng)脈丙二醛水平和血管痙攣之間存在明顯相關(guān)；腦脊液二羥基苯甲酸水平與血管痙攣也存在明顯相關(guān)。說(shuō)明蛛網(wǎng)膜下腔出血后的血管痙攣期產(chǎn)生大量自由基和脂質(zhì)過(guò)氧化物。
通過(guò)對(duì)蛛網(wǎng)膜下腔出血模型小鼠（n=10）， 5 分鐘、 6 小時(shí)、 12 小時(shí)后給予生理鹽水或者不同濃度的自由基清除劑 AVS 。測(cè)量小鼠的行為。應(yīng)用伊文氏藍(lán)（Evans blue）染色法觀察血腦屏障通透性。將其結(jié)果與假手術(shù)組比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，自由基清除劑顯著改善蛛網(wǎng)膜下腔出血?jiǎng)游锏男袨樵u(píng)分，顯著降低血腦屏障通透性。
4．自由基損傷與腦外傷
貓腦液壓沖擊性損傷試驗(yàn)中，用 NBT（四唑氮藍(lán)）法檢測(cè)氧自由基，顯示受傷后自由基增多，給予 SOD 則抑制氧自由基產(chǎn)生。
硫代巴比妥酸比色法檢測(cè) Wistar 大鼠落體撞擊腦損傷時(shí)的氧自由基反應(yīng)，顯示受傷后 3 小時(shí)腦組織和血漿中的自由基都增高了，應(yīng)用抗氧化劑則可明顯降低自由基水平。
腦損傷患者腦脊液中抗壞血酸水平降低：自由基增加。通過(guò)對(duì) 41 名不同神經(jīng)功能障礙患者的腦脊液的抗壞血酸濃度檢測(cè)，選 18 名沒(méi)有明顯神經(jīng)功能異常的患者（背痛 / 坐骨神經(jīng)痛）患者腦脊液的抗壞血酸濃度作為基準(zhǔn)值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，頭部創(chuàng)傷、顱內(nèi)壓增高（非感染性腦水腫）及腦腫瘤患者三組患者腦脊液中抗壞血酸濃度顯著降低?？赡艿脑颍嚎箟难釡p少意味著自由基增加，消耗了抗氧化劑；某些損傷（創(chuàng)傷、缺血或腫瘤）之后，自由基對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生損傷。
通過(guò)腦損傷動(dòng)物模型在不同時(shí)間測(cè)量不同部位的丙二醛 (Malondialdehyde ， MDA) 濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腦前葉、頂葉、腦干濃度比假手術(shù)組分別高 36.7%, 41.8%, 35.1% （p<0.0001），損傷后逐步增加， 4 小時(shí)達(dá)峰，然后逐步降低， 24 小時(shí)后與假手術(shù)組對(duì)比，仍然具有顯著性。損傷后立即產(chǎn)生 MDA （脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的分解產(chǎn)物），表明腦損傷迅速形成自由基。
通過(guò)測(cè)量 41 名顱腦損傷患者的血漿 TBARS （ Thiobarbituricacid- reactive substances ，硫代巴比妥酸反應(yīng)物質(zhì)，為脂質(zhì)過(guò)氧化作用的主要產(chǎn)物）水平觀察其脂質(zhì)過(guò)氧化物濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：損傷后 24 小時(shí)，血漿脂質(zhì)過(guò)氧化物明顯增加，損傷程度越嚴(yán)重，血漿脂質(zhì)過(guò)氧化物濃度越高，愈后越差。在 24-72 小時(shí)內(nèi)，死亡患者血漿內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化物濃度顯著增加；而存活者的濃度相對(duì)平穩(wěn)。提示氧自由基增加顱腦損傷程度，也是顱腦繼發(fā)性損傷的主要因素。
5．自由基損傷與腦水腫
動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明氧自由基引起腦切片水分含量增加。大鼠斷頭，用腦的皮質(zhì)切片進(jìn)行體外腦水腫實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)在腦切片的培養(yǎng)液中加入一種外源性氧自由基產(chǎn)生劑黃嘌呤氧化酶時(shí)，腦組織過(guò)氧化物和水分含量均增加。
嬰兒原發(fā)性腦水腫中，有并發(fā)癥的水腫呈現(xiàn)較高的自由基濃度。水腫患兒中，有炎癥或者出血性并發(fā)癥的水腫，丙二醛和自由基濃度顯著高于單純的水腫，有出血性并發(fā)癥水腫的病情最嚴(yán)重。
Ortege (1972) 在貓的冰凍性腦損傷中，應(yīng)用一種自由基清除劑對(duì)苯二胺后，腦水腫明顯減輕，提示腦水腫的產(chǎn)生與自由基相關(guān)。
6．自由基與帕金森癥
氧化應(yīng)激 (oxidative stress) 參與帕金森癥的證據(jù)：有大量的證據(jù)表明，與同齡的健康人相比，帕金森患者的氧化應(yīng)激顯著增加，氧化應(yīng)激是帕金森癥的早期特點(diǎn)，帕金森癥模型試驗(yàn)顯示有氧化應(yīng)激和多巴胺神經(jīng)元惡化。毒素引起的神經(jīng)元惡化可被抗氧化劑所抑制。帕金森患者大腦有激活的微型神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞 ( 可釋放自由基和炎性物質(zhì) ) 存在。
過(guò)去的 5 年里，發(fā)現(xiàn)了 5 種不同的與一種稀發(fā)家族性帕金森病相關(guān)的基因變異。其中一種變異蛋白（a）與突觸變形性和囊泡功能相關(guān)，這種蛋白功能障礙引起細(xì)胞質(zhì)多巴胺水平增加，細(xì)胞質(zhì)多巴胺容易自動(dòng)氧化和引起酶的降解，多巴胺未能進(jìn)入囊泡，引發(fā)氧化應(yīng)激。多巴胺引起的氧化應(yīng)激可能是帕金森病發(fā)病機(jī)理的最后一步。
7．自由基與癲癇
通過(guò)對(duì) 40 例癲癇病人比較發(fā)作期、間隙期脂質(zhì)過(guò)氧化物（LPO），并與健康正常參考值對(duì)照，發(fā)現(xiàn)癲癇病人發(fā)作期血中脂質(zhì)過(guò)氧化物增加。有研究發(fā)現(xiàn)癲癇后在腦局部地區(qū)產(chǎn)生自由基，自由基在癲癇患者血腦屏障的破壞中具有重要作用。
8．自由基與腦炎
最近研究資料表明，脂質(zhì)過(guò)氧化和 PARP 激活在與腦炎相關(guān)的并發(fā)癥和腦損傷中具有重要作用。
六、抗氧化劑治療
許多證據(jù)支持了神經(jīng)系統(tǒng)疾病時(shí)有自由基的產(chǎn)生。然而重要的問(wèn)題是，是否自由基促成了大腦損傷的發(fā)病機(jī)制，或它僅是其他的相關(guān)的生物過(guò)程的結(jié)果。如果大腦損傷歸咎于，或至少部分歸咎于自由基，那么抗氧化劑治療應(yīng)該可以減少缺血性腦卒中的后遺癥。
腦卒中動(dòng)物模型中，幾種研究已經(jīng)說(shuō)明天然和合成的抗氧化劑復(fù)合物的保護(hù)作用。飲食和補(bǔ)充的天然抗氧化劑，如 VC 減少了大鼠和猴子永久性缺血或缺血后再灌注的梗死范圍和神經(jīng)損傷。 VE 防止了易中風(fēng)的自發(fā)性高血壓大鼠短暫性缺血引起的細(xì)胞死亡。相反的，VE 使衰竭的大鼠更敏感于脂質(zhì)體過(guò)氧化作用。一些研究已經(jīng)證明可以通過(guò)抗氧化物酶治療減少神經(jīng)系統(tǒng)損傷?？寡趸锩敢呀?jīng)被修改，以能夠越過(guò)血腦屏障，如聚乙二醇共軛的超氧化歧化酶（SOD）和過(guò)氧化氫酶或脂質(zhì)體捕獲SOD 。幾種其他的藥物和抗氧化劑（替拉扎特甲磺酸，一種 21- 氨基類固醇和脂質(zhì)體過(guò)氧化物抑制劑）；自旋捕獲劑，如苯基Ntert 丁基硝基酮（PBN）和NXY-059；依布硒啉（一種有谷胱甘肽過(guò)氧化物酶類似作用的硒代有機(jī)化合物）； salenmanganese 化合物，它是合成 SOD/ 過(guò)氧化氫酶模仿物； BN80933 ，一種神經(jīng)元氧化氮合成酶和脂質(zhì)體過(guò)氧化的雙重抑制劑；銀杏 biloba 和硫辛酸已經(jīng)顯示出能夠減少大腦缺血后的梗死量和一些模型中的神經(jīng)損傷。一些制劑的服用顯示出了保護(hù)作用，甚至在缺血出現(xiàn)幾小時(shí)后，如 NXY-059 。在猴子中，對(duì)于右大腦中動(dòng)脈的永久性阻塞的模型，抗氧化劑復(fù)合物減少了功能殘疾，包括行動(dòng)和認(rèn)知缺陷。抗氧化劑藥物能夠越過(guò)血腦屏障，似乎對(duì)大腦缺血而言，比其他單純作用血管內(nèi)皮的藥物有更高的神經(jīng)保護(hù)作用。當(dāng)然也有無(wú)效的試驗(yàn)結(jié)果，如 1994 年 Takeshima 所做的研究。
神經(jīng)保護(hù)治療已經(jīng)在腦卒中動(dòng)物模型中顯示出有效性。由于自由基損傷廣泛參與包括腦水腫，顱腦損傷，腦出血，蛛網(wǎng)膜下腔出血，腦梗死，帕金森癥，癲癇，腦炎等神經(jīng)系統(tǒng)疾病，所以積極探索有效的抗氧化劑在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的臨床應(yīng)用具有重要的實(shí)際意義。
在最近幾年里，醫(yī)學(xué)界對(duì)抗氧化劑在的神經(jīng)保護(hù)治療給予了越來(lái)越多的關(guān)注。其目的是為了減少大腦組織易受傷于缺血，為腦缺血疾病的治療拓展窗口，并通過(guò)減少再灌注損傷來(lái)增強(qiáng)治療的有效性。在人體研究中， tirilazad 甲磺酸鹽治療腦卒中患者的隨機(jī)對(duì)照實(shí)驗(yàn)在結(jié)束前被中斷，其原因是藥品缺乏有效性。對(duì)一種新型的自由基清除劑依達(dá)拉奉的研究顯示出了有效。在大鼠腦缺血模型中，依達(dá)拉奉可以抑制局部腦缺血后或缺血再灌注后腦內(nèi)? OH 的增加，同時(shí)可以抑制腦梗塞的進(jìn)展和遲發(fā)性神經(jīng)細(xì)胞死亡。此外，依達(dá)拉奉能減輕缺血所伴發(fā)的神經(jīng)癥狀和腦水腫。通過(guò)對(duì)嚴(yán)重頸內(nèi)動(dòng)脈梗塞患者應(yīng)用依達(dá)拉奉 + 甘油，對(duì)照組甘油治療 2 天， CT 檢查發(fā)現(xiàn)梗死體積和中線位移顯著小于對(duì)照組，治療組出血性轉(zhuǎn)變顯著低于對(duì)照組。第 5～7 天，依達(dá)拉奉組梗死體積和中線位移顯著小于第 2 天的情況。 14 天內(nèi)，治療組死亡率低于對(duì)照組且具有顯著差異，結(jié)果提示自由基清除劑依達(dá)拉奉顯著抑制嚴(yán)重頸內(nèi)動(dòng)脈梗塞患者的腦水腫，并且降低急性期死亡率。田中正彥對(duì)腦梗塞急性期患者進(jìn)行的二期及三期臨床實(shí)驗(yàn)也表明，依達(dá)拉奉對(duì)腦梗塞時(shí)的主要癥狀如神經(jīng)癥狀、日常生活動(dòng)作障礙和功能障礙均具有改善作用。2001 年 4 月，對(duì)腦梗塞急性期患者在發(fā)病后 24 小時(shí)以內(nèi)開(kāi)始給藥，其用法用量在已得到日本厚生省的批準(zhǔn)。依達(dá)拉奉作為新型的腦保護(hù)劑將在腦梗塞急性期的治療中發(fā)揮重要作用。
七、結(jié)語(yǔ)
多項(xiàng)動(dòng)物模型及臨床研究證實(shí)了自由基損傷廣泛參與包括腦水腫，顱腦損傷，腦出血，蛛網(wǎng)膜下腔出血，腦梗死，帕金森癥，癲癇，腦炎等神經(jīng)系統(tǒng)疾病，所以研究抗氧化劑在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的臨床應(yīng)用具有重要的實(shí)際意義。
目前經(jīng)研究證實(shí)依達(dá)拉奉是一種新型腦保護(hù)劑，可以清除自由基，抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，抑制各種腦血管障礙模型中神經(jīng)細(xì)胞的死亡、腦梗塞、腦水腫、神經(jīng)缺損癥狀等。依達(dá)拉奉對(duì)腦梗塞患者急性期所伴隨的神經(jīng)癥狀、日常生活動(dòng)作障礙和功能障礙均具有改善作用。
希望依達(dá)拉奉作為新型的腦保護(hù)劑會(huì)對(duì)腦梗塞急性期的治療做出重要貢獻(xiàn)。