如何“繞開抗體”實時檢測植物內(nèi)源蛋白？近日，上海交通大學(xué)陸鈺明教授課題組在國際權(quán)威期刊Plant Communications在線發(fā)表了題為“Rapid and dynamic detection of endogenous proteins through in-locus tagging in rice”的研究論文。該研究將新型熒光素酶系統(tǒng)與基因敲入技術(shù)結(jié)合，在植物上建立了一種無需抗體、超快速、高通量地動態(tài)檢測植物內(nèi)源蛋白的新技術(shù)——TagBIT。

利用該團隊前期開發(fā)的高效片段敲入技術(shù)（TR-HDR），TagBIT系統(tǒng)將只有11個氨基酸的新型蛋白標簽HiBiT原位敲入至目標蛋白的N/C端（原位標簽，In-locus tagging）；然后利用篩選得到新型熒光素底物“Fluorofurimazine”開發(fā)了適用于植物的熒光素酶反應(yīng)體系。對10+個水稻內(nèi)源蛋白進行的實時追蹤實驗表明，TagBIT可實現(xiàn)各種類型的蛋白研究，對內(nèi)源蛋白實現(xiàn)：（1）超快速的Western blot（無需抗體）；（2）像GUS/GFP一樣的原位發(fā)光成像；（3）像Luciferase一樣的酶動力學(xué)動態(tài)追蹤；（4）像Flag一樣的高效的co-IP和質(zhì)譜檢測互作蛋白。值得注意的是，TagBIT技術(shù)通過原位標簽，繞開了傳統(tǒng)的基因克隆和載體構(gòu)建限制，首次實現(xiàn)了對水稻超大基因TOR（~26k）的動態(tài)檢測和蛋白互作研究。

研究團隊首先設(shè)計了一個用于N端標記的通用的供體DNA序列，并選擇了3個候選基因：MDH2、TT1和SLR1。在使用商業(yè)HiBiT蛋白檢測試劑盒的初步試驗中，他們遇到了信號強度低和穩(wěn)定性有限等問題，這對于TT1和SLR1等大量中低豐度蛋白的檢測構(gòu)成了挑戰(zhàn)。HiBiT系統(tǒng)由Promega公司開發(fā)并商業(yè)化應(yīng)用，其檢測靈敏度已經(jīng)非常高，要在該基礎(chǔ)上進一步提升檢測效率非常困難。研究團隊通過大量研究，另辟蹊徑地篩選采用了一種新型熒光素底物——Fluorofurimazine；并根據(jù)植物組織的特點系統(tǒng)性優(yōu)化了整個酶促反應(yīng)體系。最終的檢測結(jié)果表明，系列優(yōu)化使該超高靈敏度檢測系統(tǒng)又進一步大幅提升了近7倍。這一重大改進，使植物上大量的低豐度內(nèi)源蛋白的檢測成為可能。

利用TagBIT系統(tǒng)，研究團隊首先發(fā)展了超快速的Western Blot體系。由于該技術(shù)無需抗體，可轉(zhuǎn)膜后直接顯影（無需反復(fù)洗滌和抗體孵育），極大地簡化了整個免疫印跡過程。動態(tài)檢測應(yīng)用上，研究人員成功實現(xiàn)了對赤霉素信號通路中關(guān)鍵蛋白SLR1豐度的動態(tài)追蹤。盡管赤霉素GA3刺激SLR1的mRNA水平上升，但TagBIT酶促分析顯示蛋白水平在40分鐘內(nèi)急劇下降61.6%，揭示了mRNA與蛋白質(zhì)豐度不一致的現(xiàn)象。這項技術(shù)為實時監(jiān)測植物蛋白豐度提供了有效手段。

研究內(nèi)源蛋白的時空分布對于理解其功能至關(guān)重要。傳統(tǒng)的免疫化學(xué)染色技術(shù)依賴于特異性抗體進行空間檢測，在植物中常常面臨挑戰(zhàn)；而基于轉(zhuǎn)基因的（GFP標記）檢測方法由于其異位效應(yīng)，往往不能準確反應(yīng)內(nèi)源蛋白的真實時空分布。HiBiT標簽因其發(fā)光特性，在哺乳動物研究中顯示出用于原位蛋白可視化的潛力，但需要另一配體蛋白LgBiT，因此植物上尚無相關(guān)研究。為了解決這一問題，研究團隊構(gòu)建了表達LgBiT的轉(zhuǎn)基因系（LgBiT-OE）并得到了穩(wěn)定的T1代后代。為了測試這種方法，他們以水稻中具有根特異性表達的基因Lsi2為目標蛋白，構(gòu)建了Lsi2-TagBIT原位標簽株系。將其與LgBiT-OE雜交后，對F1代幼苗（Lsi2-TagBIT×LgBiT-OE）進行了原位生物發(fā)光檢測。將F1代幼苗浸入Fluorofurimazine溶液中，并用冷凍CCD相機成像，揭示了Lsi2在根部的特定定位，證實了該方法的有效性。這種通用的雜交策略實現(xiàn)了植物蛋白的有效原位可視化，并為闡明植物內(nèi)源蛋白分布提供了一種多功能工具。

研究團隊進一步探究了TagBIT技術(shù)在檢測植物內(nèi)源蛋白-蛋白互作（PPIs）方面的應(yīng)用潛力。盡管HiBiT和LgBiT具有出強烈的相互作用，但其實驗表明單獨的LgBiT并未能有效沉淀目標蛋白，這表明此類應(yīng)用需要額外的相互作用強度。因此，他們采用抗HiBiT抗體進行co-IP實驗，以檢測內(nèi)源TagBIT蛋白及其互作蛋白。他們選擇了雷帕霉素靶蛋白（TOR）基因作為研究對象，該基因?qū)τ谀芰看x、作物產(chǎn)量、抗病性和耐逆性至關(guān)重要，并且由于其龐大的基因長度（約26kb），研究起來頗具挑戰(zhàn)。研究團隊通過原位標簽，成功獲得TagBIT-TOR基因編輯植株。接著，在T3代幼苗上使用HiBiT抗體進行了co-IP實驗。通過質(zhì)譜分析共沉淀產(chǎn)物，揭示了772個潛在互作蛋白，證實了TagBIT系統(tǒng)的有效性。這項研究首次為水稻內(nèi)源TOR的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)提供了基礎(chǔ)信息，表明TagBIT技術(shù)是闡明大型基因編碼的內(nèi)源蛋白之間互作的可行方法。

田益夫博士為本文第一作者，上海交通大學(xué)陸鈺明教授和南方科技大學(xué)朱健康院士為通訊作者。該研究得到了科技部重點研發(fā)計劃、國家自然科學(xué)基金和博新計劃等項目資助。另外，該技術(shù)可以成為“水稻全基因組蛋白標簽計劃”的重要技術(shù)組成，有力推動“功能蛋白”研究。

“水稻全基因組蛋白標簽計劃（RPTP）”簡介

2020年11月13日，上海交大陸鈺明教授聯(lián)合李家洋院士、 韓斌院士和美國科學(xué)院朱健康院士、 Pamela Ronald院士在Molecular Plant雜志在線發(fā)表了一篇題為“Rice Protein Tagging Project: A Call for International Collaborations on Genome Wide in-locus Tagging of Rice Proteins”的論文，提出了一項名為“水稻全基因組蛋白標簽計劃（RPTP）”的倡議，旨在通過國際合作，在全基因組范圍內(nèi)為水稻的每一個蛋白編碼基因原位融合一個蛋白標簽，該計劃有望促進以蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的分子機理研究。

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