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導(dǎo)讀  

生態(tài)浮床可以使根系懸浮，這使得水下的根系可以成為各種微生物的港灣。但對微生物群落結(jié)構(gòu)變化及其影響機(jī)制尚缺乏系統(tǒng)的研究。本研究采用選定的植物[風(fēng)車草(Cyp)、水竹芋(Tha)和鳶尾(Iri)]構(gòu)建生態(tài)浮床，并與對照組[靜水(S)]進(jìn)行比較。結(jié)果表明，秋季根際微生物群落豐度和多樣性最高，優(yōu)勢類群為變形菌門、放線菌門、藍(lán)藻門、綠彎菌門、厚壁菌門、擬桿菌門和酸桿菌門。Tha組和Cyp組的微生物群落有很大的重疊，而Iri組和對照組則表現(xiàn)出明顯的多樣性。同一植物的根系微生物種群在不同季節(jié)也會(huì)有較大的變化。相反的，光合自養(yǎng)生物和專性厭氧生物更傾向于在較高溫度和較低溶解氧(DO)濃度下生長，并且會(huì)逐漸成為優(yōu)勢種。Tha組和對照組的微生物共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜，既有合作也有競爭。此外，TOC是塑造微生物群落結(jié)構(gòu)的重要環(huán)境因素，而DO通過影響好氧和厭氧細(xì)菌的豐度來改變微生物群落。具有低/無相應(yīng)代謝途徑的微生物顯示出降解和代謝非食用物質(zhì)的潛力。  

論文ID

原名：Seasonal changes driving shifts of aquatic rhizosphere microbial community structure and the functional properties

譯名：季節(jié)性變化驅(qū)動(dòng)水生根際微生物群落結(jié)構(gòu)和功能特性的變化

期刊：Journal of Environmental Management

IF：8.91

發(fā)表時(shí)間：2022.9

通訊作者：張繼彪

通訊作者單位：復(fù)旦大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程系

DOI號(hào)：10.1016/j.jenvman.2022.116124

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

結(jié)果與討論

1.水質(zhì)結(jié)果    

樣品的物理化學(xué)性質(zhì)因季節(jié)和植物類型而異。DO水平在春季最高，Tha_2和Iri_2達(dá)到12.17 mg L?1和10.21 mg L?1。這可能是由于它們旺盛的水下根系的尋氧活動(dòng)。相反，S_3、Iri_3和Tha_3以及Cyp_3的DO濃度在秋季下降(7.39-8.77 mg L?1)。這表明，較低的DO濃度可能會(huì)抑制好氧細(xì)菌的繁殖，增加厭氧細(xì)菌的豐度，最終改變微生物群落的組成。TP在秋季和冬季達(dá)到最高值0.23 mg L?1(Cyp_1)和0.22 mg L?1(S_4)，但在夏季下降至0.08 mg L?1(S_2)。全氮與全磷呈相似趨勢，在冬季增加至3.85 mg L?1(Cyp_1)，但在夏季下降至1.19 mg L?1(Tha_3)。這些結(jié)果表明，宛山蕩水體富營養(yǎng)化程度較高。在春季和夏季，由于水中的植物需要更多的氮和磷進(jìn)行自養(yǎng)代謝以維持自身的生長和繁殖，水體富營養(yǎng)化程度降低。此外，TOC在秋季達(dá)到最佳水平，S_4組顯示11.31 mg L?1。產(chǎn)生這些結(jié)果的一個(gè)可能原因是秋季水體中的微生物多樣性和活性高，以及微生物之間物質(zhì)的頻繁交換。相反，冬季和春季的TOC水平較低，降至5.11 mg L?1(Iri_1)和5.89 mg L?1(S_2)，這可能反映出冬季和春季微生物的多樣性和代謝活性降低。在Mu等人的研究中，溫度的變化影響了微生物群落的α多樣性和組成，從而抑制了水體中TN、TP和COD濃度的降低，這與本研究的結(jié)果一致。    

2.水生根際微生物群落組成    

不同EFB(Ecological floating beds，生態(tài)浮床)植物的微生物群落組成如圖1所示。對照組共獲得1417個(gè)獨(dú)特的OTU，而試驗(yàn)組的OTU介于369和1131之間(圖1a)。各實(shí)驗(yàn)組之間共享了高百分比(15.0%–18.3%)的OTU，這表明核心微生物群相當(dāng)小，EFB和植物之間的空間異質(zhì)性較低。對于實(shí)驗(yàn)組，與Iri和Cyp組相比，Tha組具有更獨(dú)特的OTU，這可以通過植物(水竹芋)的額外營養(yǎng)供應(yīng)來解釋。根據(jù)季節(jié)分組數(shù)據(jù)，秋季分配了大量獨(dú)特OTU(2400個(gè))，而春季、夏季和冬季分別由427、285和274個(gè)獨(dú)特OTU組成(圖1b)。秋季OTU數(shù)量高可能是由于該季節(jié)降雨量高，加上植物代謝速率加快，以及與根微生物的頻繁養(yǎng)分交換所致。這些結(jié)果與α-多樣性分析一致。    

樣品中優(yōu)勢門的分類組成如圖1c所示。微生物種群在門水平上相對相似，但豐度不同。主要的群落成員包括變形菌門(18.2%–51.8%)、放線菌門(5.73%–29.3%)、藍(lán)藻門(0.318%–51.8%)、綠彎菌門(0.543%–27.7%)、厚壁菌門(0.262%–39.9%)、擬桿菌門(1.47%–21.7%)和酸桿菌門(0.228%–12.1%)。變形菌門和擬桿菌門是常見的淡水類群，但也是EFB的主要類群。已知這兩類物種可代謝復(fù)雜的有機(jī)分子，它們的優(yōu)勢意味著在浮床中具有類似的能力。此外，藍(lán)藻在富含氮和磷的水體中生長旺盛，經(jīng)常被用作富營養(yǎng)化的指標(biāo)。總體而言，這些分類群的優(yōu)勢表明浮床存在一定程度的富營養(yǎng)化和/或營養(yǎng)富集。盡管富營養(yǎng)化水平隨季節(jié)波動(dòng)，但水質(zhì)數(shù)據(jù)證實(shí)了高TN和TP濃度與富營養(yǎng)化時(shí)間一致。這可能與不同季節(jié)優(yōu)勢門微生物豐度的差異有關(guān)。圖1d顯示了實(shí)驗(yàn)組和對照組之間在分類學(xué)組成上的重要差異，其中包括：(i)植物根中的硝化螺旋菌屬(Nitrospira)和假紅桿菌屬(Pseudorhodobacter)(α-變形菌)的豐度高于濕地水體。硝化螺旋菌通過將氨和亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化為硝酸鹽在水生氮循環(huán)中發(fā)揮重要作用，并最終防止氨和亞硝酸鹽的積累。此外，還檢測到反硝化菌，如芽孢桿菌(Bacillus)，并顯示出與硝化螺旋菌屬和假紅桿菌屬相似的富集趨勢。(ii)主要在對照組中檢測到Limnohabitans(變形菌門)，并且在植物根中的豐度極低(Tha、Cyp和Iri)。盡管我們的結(jié)果與之前的研究相矛盾，在根界面選擇特定的Limnohabitans物種和/或菌株的過程往往有利于水體中的某些微生物。冬季的低TOC水平與春季的高TOC水平可以解釋我們的結(jié)果。(iii)乳球菌屬(Lactococcus)是一種單性厭氧微生物，營養(yǎng)需求復(fù)雜，夏季比秋季生長更旺盛。較低的DO濃度和較高的水溫可能會(huì)導(dǎo)致其在較暖月份的豐度顯著增加。    

圖1. 不同浮床挺水植物的根系微生物種類組成：

(a)不同挺水植物微生物組成的相似性和重疊的維恩圖；(b)不同季節(jié)微生物組成相似性和重疊的維恩圖；(c)門水平不同挺水植物根微生物組成的條形圖；(d)屬水平群落組成相似性與差異性的熱圖。    

3.水生根際微生物群落的α多樣性    

與其他季節(jié)相比，秋季的豐富度估計(jì)值(Shannon：3.802–6.726；Chao1:905–3874)顯著較高(P＜0.05)。Cyp_4、Iri_4，Tha_4和S_4(秋季)的Chao1值異常高，而Cyp_3、Iri_3、Tha_2和S_4(總和)的Chao1值降低，因此反映了較低的微生物豐度。后者可能歸因于夏季期間進(jìn)水口流量受到限制，導(dǎo)致水位較低。此外，較高的溫度可能導(dǎo)致水體中需氧細(xì)菌的數(shù)量減少。對照組的Chao1指數(shù)顯示出與實(shí)驗(yàn)組相似的趨勢，表明出現(xiàn)的水生植物不是影響微生物多樣性和豐度的關(guān)鍵因素。與其他組(Cyp_4、Iri_4，Tha_4和S_4)相比，實(shí)驗(yàn)組Cyp_1、Cyp_3、Iri_1、Tha_1、Tha_3、S_1和S_3(冬季和夏季)的Shannon指數(shù)顯示出較低的物種多樣性，這意味著微生物群落在冬季和夏季可能都受到溫度的嚴(yán)重影響。高覆蓋指數(shù)意味著通常被測量的高概率。Wilcoxon秩和檢驗(yàn)證實(shí)了不同類型浮床和植物之間微生物豐富度的差異不顯著，驗(yàn)證了挺水植物/水生植物類型在微生物豐富性中不起作用。    

4.水生根際微生物群落的β多樣性    

不同挺水植物之間的微生物群落組成差異顯著(p=0.013)(圖2a)，這也得到了Adonis的證實(shí)。Tha和Cyp群落高度重疊，而Iri和對照組呈現(xiàn)出明顯的多樣性群落，可能是由于根系的尋氧能力和植物的常綠特性不同所致。此外，不同類型植物構(gòu)建的浮床導(dǎo)致影響微生物群落結(jié)構(gòu)的水體發(fā)生變化。例如，Iri根微環(huán)境中的TOC含量在一年中波動(dòng)很大，而TP含量在一年間保持相對穩(wěn)定。這些變化/波動(dòng)可能導(dǎo)致特定微生物群落的聚集。    

盡管在較冷的月份(秋季和冬季)觀察到了一定程度的異質(zhì)性，但群落結(jié)構(gòu)在季節(jié)之間變化不大(圖2b)。這種現(xiàn)象可能與較低水溫對微生物生存和功能的影響有關(guān)。相反，光合自養(yǎng)生物和專性厭氧生物更傾向于在較高溫度和較低DO濃度(即春季和夏季)下茁壯成長，逐漸發(fā)展為優(yōu)勢物種。    

基于屬水平的微生物群落差異通過單因素方差分析進(jìn)行評估(圖3)。與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組(Tha、Cyp和Iri)的Rhizobiales Incertae Sedis(根瘤菌科)和紅桿菌屬Rhodobacter(紅桿菌科)的豐度顯著(P＜0.05)更高。Rhizobiales Incertae Sedis可利用廣泛的碳水化合物，也可以與豆科植物根際建立共生關(guān)系以固氮。因此，我們推斷，實(shí)驗(yàn)組中的高豐度以及較高的營養(yǎng)水平與植物根系中的共生固氮有關(guān)。紅桿菌是一種重要的光自養(yǎng)生物，可以利用水生根系微環(huán)境中存在的硫化氫和/或硫代硫酸鈉進(jìn)行生長，從而增加其在植物根系中的豐度。相比之下，與實(shí)驗(yàn)組相比，對照組中CL500-29-marine-group和hgcI-clade(藍(lán)藻)的豐度顯著更高。這并不奇怪，因?yàn)橹暗难芯勘砻?，藍(lán)藻是宛山蕩太湖全年的主要分類群，偶爾會(huì)在夏季發(fā)生爆發(fā)的現(xiàn)象。    

圖S3顯示了所有樣品中微生物群落的層次聚類樹。結(jié)果表明，Tha和Cyp組在相應(yīng)季節(jié)具有相似的物種組成，表明根微環(huán)境具有高度相似性。相反，對照組和Iri組單獨(dú)聚集，這表明兩組具有獨(dú)特的微環(huán)境。    

圖2. OTU層面的主坐標(biāo)分析(PCoA)。

不同顏色的圓圈代表不同的分組方法：(a)以不同植物作為分組標(biāo)準(zhǔn)的PCoA分析；(b)以不同季節(jié)作為分組標(biāo)準(zhǔn)的PCoA分析。    

圖3. Tha、Iri、Cyp和S組之間差異的顯著性檢驗(yàn)。

Y軸表示某一分類水平上的物種名稱，X軸表示不同物種組的平均相對豐度，不同顏色的條表示不同的組；最右邊是P值，* 0.01 < P ≤ 0.05, ** 0.001< P ≤ 0.01, *** P ≤ 0.001。    

5.環(huán)境因素對微生物多樣性的影響    

環(huán)境因素在RDA圖的第一軸上解釋了11.3%，在第二軸上解釋了20.43%。(圖4)。微生物群落主要受TOC(R2=0.9426)、TP(0.2679)、TN(0.153)和DO(0.0562)的影響。皮爾遜相關(guān)性證實(shí)，TOC對微生物群落的分布有顯著影響(p=0.001)。TOC對群落的巨大影響可歸因于污染物通過城市污水(促進(jìn)富營養(yǎng)化)和/或初秋降水流入。如果濕地長期處于富營養(yǎng)化狀態(tài)，TOC含量的變化將最終影響微生物群落組成。    

圖4. 環(huán)境因子(TP、TN、DO、TOC)與(a)預(yù)測代謝基因家族組成之間關(guān)系的冗余分析(RDA)。第一和第二軸上的百分比表示RDA對變異的解釋。    

6.共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)    

網(wǎng)絡(luò)分析用于證明不同實(shí)驗(yàn)組(Tha、Cyp和Ira)和對照組的OTU之間的共現(xiàn)(圖5)。對于Tha網(wǎng)絡(luò)(圖5a)，生絲微菌科(Hyphomicrobiaceae)和紅桿菌科(Rhodobacteraceae)被認(rèn)為是優(yōu)勢物種，占所有節(jié)點(diǎn)的23.4%。這兩個(gè)分類群的代謝多樣，策略范圍從光合作用到有機(jī)物分解。生絲微菌科和紅桿菌科與其他OTU的關(guān)系既合作又競爭。同樣，紅桿菌科是Cyp網(wǎng)絡(luò)中的一個(gè)重要分類單元，占節(jié)點(diǎn)的14.6%(圖5b)。紅桿菌科與其他OTU正相關(guān)，即推斷出合作關(guān)系。我們認(rèn)為，水竹芋(Tha)和風(fēng)車草(Cyp)的根系分泌的有機(jī)物質(zhì)適合各種微生物群的生長和繁殖，如反硝化細(xì)菌、聚磷酸鹽累積生物(PAOs)和其他異養(yǎng)細(xì)菌。    

在Iri網(wǎng)絡(luò)中確定的優(yōu)勢菌為Phormidiaceae(藍(lán)藻門)，占所有節(jié)點(diǎn)的16.7%(圖5c)。Phormidiaceae和其他OTU之間的大多數(shù)相互作用主要是正向的，這可能表明生態(tài)位重疊和共代謝。最后，對于S組(圖5d)，魚孢菌科Sporichthyacea(放線菌門)作為優(yōu)勢類群，與其他OTU表現(xiàn)出強(qiáng)烈的正相關(guān)和負(fù)相關(guān)。總體而言，OTU之間的共現(xiàn)受植物類型和微環(huán)境的影響，預(yù)測關(guān)系由正(即生態(tài)位重疊、共代謝)和負(fù)(即競爭、非重疊生態(tài)位或無營養(yǎng)狀態(tài))影響產(chǎn)生。這表明，除不同細(xì)菌的合作外，Tha和S組中存在更大的生態(tài)位重疊和功能冗余。這一結(jié)果與之前的研究結(jié)果一致，細(xì)菌的生態(tài)位重疊可導(dǎo)致積極的相互作用，可能由不同的細(xì)菌群引起。    

圖5. Tha(a)、Cyp(b)、Iri(c)和S(d)組中附生生物膜微生物群落的共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)。

網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)根據(jù)不同的門著色。選擇科水平總豐度排名前50的物種，并根據(jù)不同的門對網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)進(jìn)行著色。圖中默認(rèn)顯示p ＜ 0.05的物種；圖中節(jié)點(diǎn)的大小表示物種豐度大小，不同顏色表示不同物種。連接表明存在強(qiáng)而顯著的(FDR-corrected P-values ＜ 0.05)相關(guān)性，分為正(Pearson’s ρ ＞ 0.6；紅色)或負(fù)(Pearson’s ρ ＜ -0.6；綠色)邊。    

7.水生根際微生物功能預(yù)測    

水生根際微生物群落的潛在功能如圖6a所示。值得注意的是，DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶、NADH：泛醌還原酶(H(+)-translocation、DNA解旋酶和組氨酸激酶的基因豐度顯著增加(P ＜ 0.05)。這表明微生物在細(xì)胞生殖代謝、光合作用、碳水化合物代謝、生物降解和異型生物量代謝以及氨基酸代謝方面更為活躍。Iri組、Cyp組和S組中3-氧酰基-(?；?載體-蛋白)還原酶和非特異性絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的基因豐度較低。結(jié)果表明，這些組的細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞分化和脂肪酸生物合成的調(diào)節(jié)活性降低。然而，基因豐度和活性降低的原因還有待進(jìn)一步研究。    

使用季節(jié)作為分類標(biāo)準(zhǔn)，DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶、NADH：泛醌還原酶(H(+)-translocation、DNA解旋酶和組氨酸激酶的基因豐度顯著較高。這表明季節(jié)性變化并沒有改變微生物基因的主導(dǎo)地位。結(jié)合圖6b中的FAPROTAX功能預(yù)測，許多基因豐度與海洋和湖泊生物地球化學(xué)有關(guān)，如硫、氮、氫和碳循環(huán)。這可能會(huì)在異養(yǎng)微生物和自養(yǎng)微生物之間創(chuàng)造一個(gè)競爭性的營養(yǎng)環(huán)境。植物根際有效氧和碳的釋放對于促進(jìn)銨氧化和固氮至關(guān)重要，并可能進(jìn)一步介導(dǎo)濕地氮循環(huán)。    

圖6. 基于PICRUSt(a)和FAPROTAX(b)的功能群落概況的熱圖。    

結(jié)論

本研究結(jié)果表明，不同挺水植物的水生根際微生物群落存在顯著差異。在同一季節(jié)，Tha組和Cyp組群落之間存在顯著重疊，而Iri組和對照組顯示出顯著多樣的群落。微生物共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)顯示，Tha組和S組微生物群落間呈正相關(guān)和負(fù)相關(guān)關(guān)系，而Cyp組和Iri組之間正相關(guān)關(guān)系占優(yōu)勢。對于同一植物，秋季的微生物多樣性和豐度也高于其他季節(jié)。TOC對微生物群落組成有顯著影響，DO通過影響好氧和厭氧細(xì)菌的豐度改變微生物群落。潛在功能包括細(xì)胞生殖代謝、光合作用、碳水化合物代謝、芳香化合物的生物降解和代謝以及氨基酸代謝。因此，種植水竹芋并調(diào)節(jié)TOC和DO濃度有助于提高生態(tài)浮床(EFBs)中根系微生物群落的多樣性和穩(wěn)定性。     

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