專利名稱：利用透性化細(xì)胞β-半乳糖苷酶制備低聚半乳糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種低聚半乳糖的制備方法，特別是一種利用透性化細(xì)胞β -半乳糖苷酶制備低聚半乳糖的方法，屬于酶制劑制備與功能性低聚糖生產(chǎn)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
隨著公眾飲食結(jié)構(gòu)的變化，具有調(diào)節(jié)生理活性功能的食品——功能性食品需求量增大，其中功能性低聚糖尤其受到人們的青睞。我國于2007年啟動(dòng)了 “國家公眾營養(yǎng)改善OLIGO (低聚糖)項(xiàng)目”，使功能性低聚糖的市場(chǎng)需求大幅增加。其中，低聚半乳糖因具有水溶性好、粘度低，對(duì)熱和酸穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，可用于提高食品色澤、風(fēng)味、質(zhì)地以及延長(zhǎng)貨架期； 同時(shí)，低聚半乳糖還可增殖腸道內(nèi)的雙歧桿菌，改善人體腸道菌群分布與脂質(zhì)代謝，并可促進(jìn)鈣、維生素吸收，提高人體免疫力，因此開發(fā)低成本制備低聚半乳糖的技術(shù)方法具有重要意義。目前，低聚半乳糖多以乳糖為底物，利用β-半乳糖苷酶的催化活性將乳糖水解生成的半乳糖基轉(zhuǎn)移至乳糖上而制得，其中β-半乳糖苷酶的提取純化是制約低聚半乳糖工業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵。β -半乳糖苷酶廣泛存在于動(dòng)、植物和微生物中，已報(bào)道的產(chǎn)酶微生物包括細(xì)菌、霉菌和酵母菌等，其中酵母菌產(chǎn)酶的最適PH為中性，適于牛乳水解及治療乳糖不耐癥；但由于乳酸克魯維酵母產(chǎn)生的半乳糖苷酶為胞內(nèi)酶，使得提取純化過程復(fù)雜、且難度大、效率低，因此利用游離β-半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖的工藝成本較高。細(xì)胞膜具有選擇透過性，采用透性化技術(shù)處理細(xì)胞，可改變其通透性，同時(shí)保持細(xì)胞整體結(jié)構(gòu)完整，并可保證胞內(nèi)酶仍具有催化活性。滲透處理方法包括物理法(如滲透壓法、反復(fù)凍融法、熱休克法和超聲細(xì)胞破碎法)、化學(xué)法(如表面活性劑法、有機(jī)溶劑法和螯合劑法)以及生物化學(xué)法(如抗生素法和酶法)等。專利CN 1225389Α利用無水乙醇和氯仿，經(jīng)過冷凍干燥處理得到透性化乳酸克魯維酵母細(xì)胞β -半乳糖苷酶，但制備過程中因使用氯仿，使產(chǎn)品不能直接用于食品行業(yè)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用透性化細(xì)胞β -半乳糖苷酶，操作簡(jiǎn)便且低成本的制備低聚半乳糖的方法。本發(fā)明的另一目的是提供一種無毒性的透性化細(xì)胞β -半乳糖苷酶的制備方法，該透性化細(xì)胞半乳糖苷酶是由乳酸克魯維酵母經(jīng)細(xì)胞滲透處理技術(shù)而獲得，能夠以乳糖為底物催化合成低聚半乳糖。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所選產(chǎn)半乳糖苷酶的菌株為乳酸克魯維酵母，購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(北京)，菌種名稱乳酸克魯維酵母(Kluyveromyceslactis), CICC 編號(hào)1773。本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種利用透性化細(xì)胞β_半乳糖苷酶制備低聚半乳糖的方法，其特征在于，向乳糖溶液中加入透性化細(xì)胞β -半乳糖苷酶，乳糖溶液濃度為10(T500g/L，透性化細(xì)胞β -半乳糖苷酶加入量為20(Tl500mg/g乳糖，30^450C，反應(yīng)2 15h后，離心分離，得到的上清液即為低聚半乳糖溶液。本發(fā)明所述透性化細(xì)胞β -半乳糖苷酶的制備方法為由乳酸克魯維酵母經(jīng)細(xì)胞滲透處理技術(shù)獲得，所用乳酸克魯維酵母購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，菌種名稱乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)，CICC 編號(hào)1773。上述細(xì)胞滲透處理技術(shù)為向每克乳酸克魯維酵母細(xì)胞中加入5(T200mL的PBS緩沖液(50mmol/LpH 8. ONaH2PO4-Na2HPO4)制得懸浮細(xì)胞；再向其中加入無水乙醇，無水乙醇與懸浮細(xì)胞的體積比為2:5 1:1，于25°C下振蕩fl5min，離心后棄去上清液，所得沉淀經(jīng)PBS緩沖液洗滌兩次后即得透性化細(xì)胞β -半乳糖苷酶。上述乳酸克魯維酵母的發(fā)酵條件為溫度28 30°C，搖床轉(zhuǎn)速10(T250rpm，接種量5 10% (v/v)，在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)8tT30h。
上述乳酸克魯維酵母發(fā)酵所用液體培養(yǎng)基組成與配制方法為酵母膏3. 0g，麥芽浸膏3. 0g，蛋白胨5. 0g，乳糖20. 0g，蒸餾水1. 0L, pH 7. 0,121°C高壓滅菌20min。本發(fā)明利用透性化乳酸克魯維酵母細(xì)胞β -半乳糖苷酶制備低聚半乳糖，其有益效果在于(I)利用透性化細(xì)胞半乳糖苷酶制備低聚半乳糖，避免了胞內(nèi)酶的提取純化過程，簡(jiǎn)化了工藝操作，降低了生產(chǎn)成本。(2)透性化細(xì)胞中β -半乳糖苷酶所處環(huán)境仍為胞內(nèi)環(huán)境，使其表現(xiàn)出比游離酶更高的催化合成低聚半乳糖的活性，更有利于發(fā)揮其催化功能。(3)本發(fā)明采用無水乙醇處理乳酸克魯維酵母制備透性化細(xì)胞，未引入氯仿等具有毒性的化學(xué)試劑，無食品安全問題，可廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)。(4)透性化細(xì)胞中β -半乳糖苷酶類似囊化固定化酶形式，易于從反應(yīng)體系中分離回收，并可多次重復(fù)利用，可顯著降低低聚半乳糖的生產(chǎn)成本。

圖1透性化細(xì)胞β -半乳糖苷酶制備低聚半乳糖色譜分析圖；圖2 (a)透性化細(xì)胞β -半乳糖苷酶最適pH曲線圖；圖2 (b)透性化細(xì)胞β -半乳糖苷酶最適溫度曲線圖；圖3乳酸克魯維酵母發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)β -半乳糖苷酶酶活的影響曲線圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不僅限于實(shí)施例。實(shí)施例中所用的無水乙醇、蛋白胨、酵母膏、麥芽糖等均為市售產(chǎn)品。乳酸克魯維酵母，購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(北京)，菌種名稱乳酸克魯維酵母(Kluyveromyceslactis), CICC 編號(hào)1773。實(shí)施例中低聚半乳糖的含量及收率采用高效液相色譜檢測(cè)計(jì)算而得，色譜條件為示差檢測(cè)器，Aminex ΗΡΧ-87Η色譜柱，流動(dòng)相為O. 05Μ H2SO4,流速O. 6mL/min,柱溫65°C，進(jìn)樣量20 μ L。低聚半乳糖的含量通過標(biāo)準(zhǔn)糖樣品(葡萄糖、半乳糖、乳糖)的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到。低聚半乳糖收率=低聚半乳糖實(shí)際生成量/低聚半乳糖理論生成量X 100%。以乳糖為底物，采用透性化細(xì)胞β-半乳糖苷酶催化乳糖制備的低聚半乳糖溶液經(jīng)高效液相色譜檢測(cè)分析，包含有葡萄糖、半乳糖、轉(zhuǎn)移二糖、低聚半乳糖以及部分未被分解的乳糖，各組分的保留時(shí)間及出峰順序如圖1所示。實(shí)施例1:乳酸克魯維酵母透性化細(xì)胞的制備對(duì)乳酸克魯維酵母進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)基組成為酵母膏3.0g，麥芽浸膏3.0g，蛋白胨5.0g，乳糖20.0g，蒸餾水L0L，pH 7.0，121°C高壓滅菌20min。發(fā)酵條件為28°C，搖床轉(zhuǎn)速lOOrpm，接種量5%(v/v)，培養(yǎng)8h，所得乳酸克魯維酵母發(fā)酵液的酶活約為1. OOU/mL。將發(fā)酵液在5000rpm、4°C下離心5min，沉淀經(jīng)水洗后加入PBS緩沖液稀釋至50g/L，制得懸浮細(xì)胞。按無水乙醇與懸浮細(xì)胞稀釋液體積比為2:5加入無水乙醇,251€下震蕩處理lmin。在5000rpm、4°C下離心5min后,沉淀用PBS緩沖
液洗滌兩次，棄去上清液，取沉淀即可得到透性化細(xì)胞β -半乳糖苷酶，并用PBS緩沖液稀釋至20g/L。透性化細(xì)胞β-半乳糖苷酶制備低聚半乳糖取100mL100g/L乳糖溶液，按透性化細(xì)胞加入量為(200mg/g乳糖)加入100mL20g/L的透性化細(xì)胞溶液，在30° C、160rpm的水浴搖床中反應(yīng)2h，取100 μ L酶解液稀釋20倍，在12000rpm下離心2min，上清液過0. 45 μ m水膜后進(jìn)高效液相色譜檢測(cè)，得到低聚半乳糖含量為10g/L，收率為10%。實(shí)施例2 乳酸克魯維酵母透性化細(xì)胞的制備對(duì)乳酸克魯維酵母進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)基組成為酵母膏3.0g，麥芽浸膏3.0g，蛋白胨5.0g，乳糖20.0g，蒸餾水L0L，pH 7.0，121°C高壓滅菌20min。發(fā)酵條件為30°C，搖床轉(zhuǎn)速160rpm，接種量8% (v/v)，培養(yǎng)12h，所得乳酸克魯維酵母發(fā)酵液的酶活約為7. 00U/mL。將發(fā)酵液在5000rpm、4°C下離心5min，沉淀經(jīng)水洗后加入PBS緩沖液稀釋至50g/L，制得懸浮細(xì)胞。按無水乙醇與懸浮細(xì)胞稀釋液體積比為4:5加入無水乙醇,25°C下震蕩處理lOmin。在5000rpm、4°C下離心5min后,沉淀用PBS緩沖液洗滌兩次，棄去上清液，取沉淀即可得到透性化細(xì)胞β -半乳糖苷酶，并用PBS緩沖液稀釋至300g/L。透性化細(xì)胞半乳糖苷酶制備低聚半乳糖取100mL300g/L乳糖溶液，按透性化細(xì)胞加入量為(1000mg/g乳糖)加入100mL300g/L的透性化細(xì)胞溶液，在45° C、160rpm的水浴搖床中反應(yīng)6h，取100 μ L酶解液稀釋20倍，在12000rpm下離心2min，上清液過0. 45 μ m水膜后進(jìn)高效液相色譜檢測(cè)，得到低聚半乳糖的含量為54g/L，收率為18%。實(shí)施例3 乳酸克魯維酵母透性化細(xì)胞的制備對(duì)乳酸克魯維酵母進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)基組成為酵母膏3.0g，麥芽浸膏3.0g，蛋白胨5.0g，乳糖20.0g，蒸餾水L0L，pH 7.0，121°C高壓滅菌20min。發(fā)酵條件為30°C，搖床轉(zhuǎn)速250rpm，接種量10% (v/v)，培養(yǎng)20h。所得乳酸克魯維酵母發(fā)酵液的酶活約為8. 69U/mL。將發(fā)酵液在5000rpm、4°C下離心5min，沉淀經(jīng)水洗后加入PBS緩沖液稀釋至50g/L，制得懸浮細(xì)胞。按無水乙醇與懸浮細(xì)胞稀釋液體積比為1:1加入無水乙醇，25°C下震蕩處理15min。在5000rpm、4°C下離心5min后，沉淀用PBS緩沖液洗滌兩次，棄去上清液，取沉淀即可得到透性化細(xì)胞β -半乳糖苷酶，并用PBS緩沖液稀釋至125g/L。采用oNPG比色法測(cè)定透性化細(xì)胞β -半乳糖苷酶的酶活力。以最高酶活力為100%，各次測(cè)定的酶活力與最高酶活力之比為相對(duì)酶活。由圖2 (a) (b)可知，透性化細(xì)胞β_半乳糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)最適反應(yīng)pH為7. O 9. O,為中性和弱堿性酶；最適溫度為37° C，溫度高于50°C時(shí)基本檢測(cè)不到酶活，該酶可用于乳清和乳糖的水解。透性化細(xì)胞半乳糖苷酶制備低聚半乳糖取100mL500g/L乳糖溶液，按透性化細(xì)胞加入量為(250mg/g乳糖)加入100mL125g/L的透性化細(xì)胞溶液，在37° C、200rpm的水浴搖床中反應(yīng)IOh，取100 μ L酶解液稀釋20倍，在12000rpm下離心2min，上清液過O. 45 μ m水膜后進(jìn)高效液相色譜檢測(cè)，得到低聚半乳糖的含量為100g/L，收率為20%。實(shí)施例4 乳酸克魯維酵母透性化細(xì)胞的制備對(duì)乳酸克魯維酵母進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)基組成為酵母膏3.0g，麥芽浸膏3.0g，蛋白胨5.0g，乳糖20.0g，蒸餾水L0L，pH 7.0，121°C高壓滅菌20min。發(fā)酵條件為:30°C，搖床轉(zhuǎn)速160rpm，接種量10% (v/v)，分別培養(yǎng)4、8、12、16、20、22、24、30h，采用oNPG比色法測(cè)定透性化細(xì)胞β _半乳糖苷酶的酶活力，如圖3所示，可知乳酸克魯維酵母的最佳發(fā)酵時(shí)間為20h，此時(shí)所得發(fā)酵液的酶活約為8. 69U/mL。將發(fā)酵液在5000rpm、4°C下離心5min,沉淀經(jīng)水洗后加入PBS緩沖液稀釋至50g/L,制得懸浮細(xì)胞。按無水乙醇與懸浮細(xì)胞稀釋液體積比為1:1加入無水乙醇，25°C下震蕩處理lOmin。在5000rpm、4°C下離心5min后,沉淀用PBS緩沖液洗漆兩次,棄去上清液,取沉淀即可得到透性化細(xì)胞β -半乳糖苷酶，并用PBS緩沖液稀釋至150g/L。透性化細(xì)胞β -半乳糖苷酶制備低聚半乳糖取100mL100g/L乳糖溶液，按透性化細(xì)胞加入量為(1500mg/g乳糖)加入100mL150g/L的透性化細(xì)胞溶液，在37° C、160rpm的水浴搖床中反應(yīng)15h，取100 μ L酶解液稀釋20倍，在12000rpm下離心2min，上清液過0. 45 μ m水膜后進(jìn)高效液相色譜檢測(cè)，得到低聚半乳糖的含量為14g/L，收率為14%。實(shí)施例5乳酸克魯維酵母透性化細(xì)胞的制備對(duì)乳酸克魯維酵母進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)基組成為酵母膏3.0g，麥芽浸膏3.0g，蛋白胨5.0g，乳糖20.0g，蒸餾水L0L，pH 7.0，121°C高壓滅菌20min。發(fā)酵條件為30°C，搖床轉(zhuǎn)速160rpm，接種量10%(v/v)，培養(yǎng)20h，所得乳酸克魯維酵母發(fā)酵液的酶活約為8. 69U/mL。將發(fā)酵液在5000rpm、4°C下離心5min，沉淀經(jīng)水洗后加入PBS緩沖液稀釋至50g/L，制得懸浮細(xì)胞。按無水乙醇與懸浮細(xì)胞稀釋液體積比為1:1加入無水乙醇，25°C下震蕩處理lOmin。在5000rpm、4°C下離心5min后，沉淀用PBS緩沖液洗滌兩次，棄去上清液，取沉淀即可得到透性化細(xì)胞β -半乳糖苷酶，并用PBS緩沖液稀釋至250g/L。透性化細(xì)胞β -半乳糖苷酶制備低聚半乳糖取100mL200g/L乳糖溶液，按透性化細(xì)胞加入量為(1250mg/g乳糖)加入100mL250g/L的透性化細(xì)胞溶液，在37° C、200rpm的水浴搖床中反應(yīng)2h，取100 μ L酶解液稀釋20倍，在12000rpm下離心2min，上清液過0. 45 μ m水膜后進(jìn)高效液相色譜檢測(cè)，計(jì)算低聚半乳糖的收率；反應(yīng)后的混合物離心(5000rpm, 5min,4°C )，棄去上清液，分離出透性化細(xì)胞β _半乳糖苷酶，在透性化細(xì)胞中再加入IOOmL 200g/L乳糖溶液，按上述條件反應(yīng)，經(jīng)色譜檢測(cè)分析、計(jì)算低聚半乳糖的收率；重復(fù)上述操作，直至無低聚半乳糖生成，可得到透性化細(xì)胞半乳糖苷酶的重復(fù)利用次數(shù)為3次。本發(fā)明公開了一種利用透性化細(xì)胞β -半乳糖苷酶制備低聚半乳糖的方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過借鑒本發(fā)明內(nèi)容，適當(dāng)改變工藝參數(shù)，結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)等環(huán)節(jié)實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明通過較佳實(shí)施例子進(jìn)行了描述，相關(guān)技術(shù)人員明顯能在不脫離本發(fā)明核心思想、范圍和內(nèi)容下對(duì)本文有關(guān)的 流程進(jìn)行適當(dāng)改動(dòng)或組合，來實(shí)現(xiàn)本發(fā)明技術(shù)，另外，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本技術(shù)領(lǐng)域人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明核心精神、范圍和內(nèi)容中。
權(quán)利要求
1.一種利用透性化細(xì)胞3 -半乳糖苷酶制備低聚半乳糖的方法，其特征在于，向乳糖溶液中加入透性化細(xì)胞P -半乳糖苷酶，乳糖溶液濃度為10(T500g/L，透性化細(xì)胞P -半乳糖苷酶加入量為20(Tl500mg/g乳糖，30^500C，反應(yīng)2 15h后，經(jīng)離心分離得到的上清液即為低聚半乳糖溶液。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是透性化細(xì)胞￠-半乳糖苷酶的制備方法為乳酸克魯維酵母經(jīng)細(xì) 胞滲透處理技術(shù)獲得，所用乳酸克魯維酵母，購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，菌種名稱乳酸克魯維酵母，CICC編號(hào)1773。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征是細(xì)胞滲透處理技術(shù)為向每克乳酸克魯維酵母細(xì)胞中加入5(T200mL的PBS緩沖液制得懸浮細(xì)胞；再向其中加入無水乙醇，無水乙醇與懸浮細(xì)胞的體積比為2: 5 1:1，于25°C下振蕩f 15min，離心后棄去上清液，所得沉淀經(jīng)PBS緩沖液洗滌兩次后即得透性化細(xì)胞3-半乳糖苷酶。
4.如權(quán)利要求3所述方法，其特征是乳酸克魯維酵母的發(fā)酵條件為溫度28 3(TC，搖床轉(zhuǎn)速10(T250rpm，接種量為體積比5 10%，在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)8h 30h。
5.如權(quán)利要求4所述方法，其特征是乳酸克魯維酵母發(fā)酵所用液體培養(yǎng)基為酵母膏·3. 0g，麥芽浸膏3. 0g，蛋白胨5. 0g，乳糖20. 0g，蒸餾水1. 0L,pH 7. 0，121°C高壓滅菌20min。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用透性化細(xì)胞β-半乳糖苷酶制備低聚半乳糖的方法，向乳糖溶液中加入透性化細(xì)胞β-半乳糖苷酶，乳糖溶液濃度為100~500g/L，透性化細(xì)胞β-半乳糖苷酶加入量為200~1500mg/g乳糖，30~45℃，反應(yīng)2~15h后，離心分離，得到的上清液即為低聚半乳糖溶液。利用透性化細(xì)胞β-半乳糖苷酶制備低聚半乳糖，避免了胞內(nèi)酶的提取純化過程，簡(jiǎn)化了工藝操作，降低了生產(chǎn)成本。采用無水乙醇處理乳酸克魯維酵母制備透性化細(xì)胞，未引入氯仿等具有毒性的化學(xué)試劑，無食品安全問題，可廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)。并可多次重復(fù)利用，可顯著降低低聚半乳糖的生產(chǎn)成本。
文檔編號(hào)C12N9/38GK102994589SQ20121051480
公開日2013年3月27日 申請(qǐng)日期2012年12月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月4日
發(fā)明者齊崴, 王夢(mèng)凡, 何志敏, 張帥帥, 邢肖肖, 蘇榮欣 申請(qǐng)人:天津大學(xué)

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