《環(huán)狀芽孢桿菌及其在共生發(fā)酵技術(shù)制低聚半乳糖中的應(yīng)用.pdf》由會員分享，可在線閱讀，更多相關(guān)《環(huán)狀芽孢桿菌及其在共生發(fā)酵技術(shù)制低聚半乳糖中的應(yīng)用.pdf（8頁珍藏版）》請在專利查詢網(wǎng)上搜索。

1、(19)中華人民共和國國家知識產(chǎn)權(quán)局 (12)發(fā)明專利 (10)授權(quán)公告號 (45)授權(quán)公告日 (21)申請?zhí)?201410118268.5 (22)申請日 2014.03.27 (83)生物保藏信息 CGMCC No.8864 2014.02.27 (73)專利權(quán)人 保齡寶生物股份有限公司 地址 251200 山東省德州市禹城市高新開 發(fā)區(qū)東外環(huán)路1號 (72)發(fā)明人 劉宗利王乃強欒慶民張莉 熊小蘭周文福杜倩 (74)專利代理機構(gòu) 濟南舜源專利事務(wù)所有限公 司 37205 代理人 曲志波 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) C12P 19/14(2006.01) C。

2、12P 19/04(2006.01) C12P 19/12(2006.01) C12R 1/09(2006.01) (56)對比文件 CN 1737132 A,2006.02.22, TW M481928 U,2014.07.11, CN 1737132 A,2006.02.22, 潘彬也等.釀酒酵母純化低聚半乳糖. 中國 乳品工業(yè) .2011, Aaron Gosling等.Recent advances refining galactooligosaccharide production from lactose. Food Chemistry .2009,307-318. 審查員 徐俊 。

3、(54)發(fā)明名稱 環(huán)狀芽孢桿菌及其在共生發(fā)酵技術(shù)制低聚 半乳糖中的應(yīng)用 (57)摘要 一種環(huán)狀芽孢桿菌及其在共生發(fā)酵技術(shù)制 低聚半乳糖中的 應(yīng) 用。 環(huán)狀芽孢桿菌菌株 （Bacilluscirculans） BLB-32已于2014年2月27 日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通 微生物中心， 保藏號CGMCCNo.8864。 采用本發(fā)明 的環(huán)狀芽孢桿菌菌株產(chǎn)酶活力高達150u/ml以 上， 采用共生發(fā)酵技術(shù)轉(zhuǎn)化生產(chǎn)低聚半乳糖， 可 以實現(xiàn)一個罐反應(yīng)達到大于57%純度的純度， 替 代傳統(tǒng)的酶反應(yīng)和發(fā)酵反應(yīng)兩步實施的技術(shù)， 得 到的低聚半乳糖反應(yīng)液經(jīng)過色譜分離即可得到 大于90%的高純度的不。

4、同低聚半乳糖含量的系列 產(chǎn)品。 該技術(shù)可以節(jié)省掉菌體破碎機和離心機以 及配套設(shè)施投資， 節(jié)省占地空間， 減少大量的能 源消耗。 同時制備的酶充分利用， 減少了損失， 酶 利用率提升10%以上， 提高了原料的利用率。 權(quán)利要求書1頁 說明書6頁 CN 103911322 B 2016.08.17 CN 103911322 B 1.一種環(huán)狀芽孢桿菌BLB-32(BacilluscirculansBLB-32） ,已于2014年2月27日保存 于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心， 保藏號CGMCCNo.8864。 2.一種環(huán)狀芽孢桿菌在共生發(fā)酵技術(shù)制低聚半乳糖中的應(yīng)用， 其特征是它包括如下。

5、步 驟： （1） 菌種擴大培養(yǎng) 將保藏號為CGMCCNo.8864的環(huán)狀芽孢桿菌BLB-32斜面接種在搖瓶種子培養(yǎng)基中， 3037， 100-250rpm的振蕩速度下培養(yǎng)10-24h， 獲得擴大的菌種培養(yǎng)液； 種子培養(yǎng)基： 葡 萄糖5-20g/L， 酵母膏5-20g/L， 蛋白胨5-20g/L， 硫酸鎂0.3g/L， pH7.0， 種子培養(yǎng)基進行121 和15分鐘的滅菌； （2） 放大培養(yǎng)產(chǎn)酶 制酶培養(yǎng)基： 乳糖5-20g/L， 酵母膏5-20g/L， 蛋白胨5-20g/L， 硫酸鎂0.3g/L， 磷酸氫二 鈉0.010.2g/L， 磷酸二氫鈉0.010.2g/L， pH7.0， 制酶培養(yǎng)基進。

6、行121和15分鐘的滅 菌； 將步驟 （1） 得到的擴大的菌種培養(yǎng)液倒入盛有制酶培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中接種培養(yǎng)， 30 37， 攪拌速度100-300rpm， 通入空氣培養(yǎng)30-72h， 得到放大培養(yǎng)的環(huán)狀芽孢桿菌BLB-32培 養(yǎng)液及其釋放的 -半乳糖苷酶用于生產(chǎn)低聚半乳糖； （3） 共生發(fā)酵乳糖轉(zhuǎn)化制備低聚半乳糖 將放大培養(yǎng)的環(huán)狀芽孢桿菌BLB-32培養(yǎng)液及其釋放的 -半乳糖苷酶按接種量50- 500ml/L移種于乳糖溶液中， 乳糖溶液pH值47， 反應(yīng)溫度3050， 菌種邊生長邊產(chǎn)酶發(fā) 酵； 或者加入活性酵母共生發(fā)酵， 活性酵母加入量1-10g/L； 在厭氧條件下轉(zhuǎn)化60120h， 經(jīng)過組分檢。

7、測低聚半乳糖達到57以上時放罐， 然后進 行活性炭脫色處理， 脫色溫度6090， 脫色3090分鐘， 然后經(jīng)過離子交換精制、 濃縮， 得 到低聚半乳糖組分大于57%的低聚半乳糖濃縮液。 3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的環(huán)狀芽孢桿菌在共生發(fā)酵技術(shù)制低聚半乳糖中的應(yīng)用， 其特 征是乳糖溶液質(zhì)量濃度為250g/L500g/L。 4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的環(huán)狀芽孢桿菌在共生發(fā)酵技術(shù)制低聚半乳糖中的應(yīng)用， 其特 征是將低聚半乳糖組分大于57%的低聚半乳糖濃縮液通過色譜分離得到低聚半乳糖組分大 于90%的低聚半乳糖液體。 5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的環(huán)狀芽孢桿菌在共生發(fā)酵技術(shù)制低聚半乳糖中的應(yīng)用， 其特 征是將低聚半乳。

8、糖濃縮液經(jīng)過真空干燥， 得到含量大于57%的低聚半乳糖粉末產(chǎn)品。 權(quán)利要求書 1/1 頁 2 CN 103911322 B 2 環(huán)狀芽孢桿菌及其在共生發(fā)酵技術(shù)制低聚半乳糖中的應(yīng)用 技術(shù)領(lǐng)域 0001 本發(fā)明涉及低聚半乳糖制備技術(shù)領(lǐng)域， 特別涉及一種環(huán)狀芽孢桿菌菌株， 還涉及 所述環(huán)狀芽孢桿菌菌株在共生發(fā)酵技術(shù)制備低聚半乳糖中的應(yīng)用。 背景技術(shù) 0002 低聚半乳糖 （galacto-oligosaccharides， 簡稱GOS） ， 是一種具有天然屬性的功能 性低聚糖， 是由半乳糖基和葡萄糖基構(gòu)成的聚合度為28的低聚糖。 本技術(shù)是以乳糖為 原料， 利用環(huán)狀芽孢桿菌產(chǎn)生的 -半乳糖苷酶催化水解。

9、半乳糖苷鍵， 生成半乳糖和葡萄糖， 并通過轉(zhuǎn)半乳糖苷的作用， 生成含有半乳低聚二糖到半乳低聚八糖的低聚半乳糖產(chǎn)品， 并 利用共生發(fā)酵技術(shù)和色譜分離技術(shù)生產(chǎn)高純度低聚半乳糖。 0003 低聚半乳糖具有下列優(yōu)良的生理學(xué)特性： 在大腸內(nèi)能被對人體有保健作用的一 類菌， 包括雙歧桿菌， 有選擇性地利用， 每日攝取10g低聚半乳糖后， 體內(nèi)雙歧桿菌即可成為 優(yōu)勢菌群； 它不被人體消化道酶水解， 因而是一種低熱量糖； 能緩解乳糖不耐癥， 促進 礦物質(zhì)吸收； 適用于糖尿病患者服用； 防齲齒； 抑制腸內(nèi)腐敗菌和其它有害菌的生 長， 促進腸胃功能。 低聚半乳糖產(chǎn)品廣泛應(yīng)用于嬰幼兒食品、 乳制品、 飲料、 焙烤食。

10、品、 糖果 等。 0004 目前， 國內(nèi)外工業(yè)化生產(chǎn)的方法主要是通過選出高活性菌種放大培養(yǎng)， 然后破碎 菌體、 菌體和酶分離制備液體酶制劑， 或?qū)⒁后w酶制劑依托載體物質(zhì)通過干燥方式制成粉 體， 進行低聚半乳糖的生產(chǎn)， 相關(guān)的制備工藝存在工藝路線較長， 可利用的酶存在損失， 酶 的綜合利用率低， 能耗高。 原工業(yè)化生產(chǎn)低聚半乳糖50噸轉(zhuǎn)化罐， 需要配備菌體破碎機和離 心機以及配套設(shè)施， 每小時耗電量240度以上， 能源消耗大， 而且生產(chǎn)量越大， 能源消耗越 大。 發(fā)明內(nèi)容 0005 為了解決以上低聚半乳糖生產(chǎn)中工藝路線較長， 可利用的酶存在損失， 酶的綜合 利用率低， 能耗高的問題， 本發(fā)明提供。

11、了一種可以縮短生產(chǎn)工藝路線、 減少設(shè)備投入、 提高 酶利用效率的環(huán)狀芽孢桿菌菌株。 0006 本發(fā)明還提供了所述環(huán)狀芽孢桿菌菌株共生發(fā)酵技術(shù)制備低聚半乳糖。 0007 一種環(huán)狀芽孢桿菌菌株， 所述環(huán)狀芽孢桿菌BLB-32 （BacilluscirculansBLB- 32） 已于2014年2月27日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心， 保藏號 CGMCCNo.8864。 0008 本發(fā)明是通過以下措施實現(xiàn)的： 一種環(huán)狀芽孢桿菌在共生發(fā)酵技術(shù)制低聚半乳糖 中的應(yīng)用， 其特征是它包括如下步驟： 0009 （1） 菌種擴大培養(yǎng) 0010 將環(huán)狀芽孢桿菌BLB-32 （CGMCCNo.8。

12、864） 斜面接種在搖瓶種子培養(yǎng)基中， 3037 ， 100-250rpm的振蕩速度下培養(yǎng)10-24h， 獲得擴大的菌種培養(yǎng)液； 種子培養(yǎng)基： 葡萄糖5- 說明書 1/6 頁 3 CN 103911322 B 3 20g/L， 酵母膏5-20g/L， 蛋白胨5-20g/L， 硫酸鎂0.3g/L， pH7.0， 種子培養(yǎng)基進行121和15 分鐘的滅菌； 0011 （2） 放大培養(yǎng)產(chǎn)酶 0012 制酶培養(yǎng)基： 乳糖5-20g/L， 酵母膏5-20g/L， 蛋白胨5-20g/L， 硫酸鎂0.3g/L， 磷酸 氫二鈉0.010.2g/L， 磷酸二氫鈉0.010.2g/L， pH7.0， 制酶培養(yǎng)基進行。

13、121和15分鐘的 滅菌； 0013 將步驟 （1） 得到的擴大的菌種培養(yǎng)液倒入盛有制酶培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中接種培養(yǎng)， 3037， 攪拌速度100-300rpm， 通入空氣培養(yǎng)30-72h， 得到放大培養(yǎng)的環(huán)狀芽孢桿菌BLB- 32培養(yǎng)液及其釋放的 -半乳糖苷酶用于生產(chǎn)低聚半乳糖； 0014 （3） 共生發(fā)酵乳糖轉(zhuǎn)化制備低聚半乳糖 0015 將放大培養(yǎng)的環(huán)狀芽孢桿菌BLB-32培養(yǎng)液及其釋放的 -半乳糖苷酶按接種量50- 500ml/L移種于乳糖溶液中， 乳糖溶液pH值47， 反應(yīng)溫度3050， 菌種邊生長邊產(chǎn)酶發(fā) 酵； 或者加入活性酵母共生發(fā)酵， 活性酵母加入量1-10g/L； 0016 在厭氧。

14、條件下轉(zhuǎn)化60120h， 經(jīng)過組分檢測低聚半乳糖達到57以上時放罐， 然 后進行活性炭脫色處理， 脫色溫度6090， 脫色3090分鐘， 然后經(jīng)過離子交換精制、 濃 縮， 得到低聚半乳糖組分大于57%的低聚半乳糖濃縮液。 0017 本方案的具體特點還有， 乳糖溶液質(zhì)量濃度為250g500g/L。 0018 將低聚半乳糖濃縮液經(jīng)過真空干燥， 得到含量大于57%的低聚半乳糖粉末產(chǎn)品。 0019 低聚半乳糖組分大于57%的低聚半乳糖濃縮液通過色譜分離得到含量大于90%的 低聚半乳糖液體， 組分含量大于90%的低聚半乳糖液體經(jīng)過真空干燥得到含量大于90%的低 聚半乳糖粉體， 實現(xiàn)低聚半乳糖不同組分含量。

15、的系列化產(chǎn)品制備。 0020 本發(fā)明的有益效果： 采用本發(fā)明的環(huán)狀芽孢桿菌菌株及共生發(fā)酵轉(zhuǎn)化技術(shù)生產(chǎn)低 聚半乳糖， 該技術(shù)可以節(jié)省掉菌體破碎機和離心機以及配套設(shè)施投資， 同時制備的酶充分 利用， 減少了損失， 酶利用率提升10%以上， 提高了原料的利用率。 菌種產(chǎn)酶大于20u/ml為活 力標準,低聚半乳糖產(chǎn)率測定采用AOAC法定方法2001.02食品中GOS的檢測方法測定 低聚半乳糖含量， 低聚半乳糖含量以57%為基準 （國家新資源食品2008年第20號標準） 。 0021 保藏信息： 本發(fā)明所用菌株為環(huán)狀芽孢桿菌BLB-32， 拉丁文學(xué)名Bacillus circulansBLB-32， 該。

16、菌株已于2014年2月27日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普 通微生物中心 （CGMCC） ， 地址： 北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所， 保藏編號CGMCCNo.8864。 0022 本發(fā)明環(huán)狀芽孢桿菌菌株篩選方法 0023 1） 細胞菌懸液的制備 0024 將菌體加入篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)， 然后將培養(yǎng)好的菌懸液置于80水浴中加熱10 20分鐘， 隨后將加熱處理過的菌懸液適當稀釋接種于芽孢桿菌分離培養(yǎng)基， 置于37培養(yǎng) 1024小時， 進一步作分離純化。 準備6支裝有9mL無菌水的試管， 編號16， 用移液槍移取 1000 L懸濁液置于1號試管， 再移取1000 L1號試。

17、管懸濁液置于2號試管， 依次做六個試管 梯度稀釋。 0025 2） 平板制作 0026 將分離培養(yǎng)基熔化后冷至45左右倒平板， 凝固后待用。 說明書 2/6 頁 4 CN 103911322 B 4 0027 3） 菌種篩選 0028 用移液槍分別取4、 5、 6號試管溶液各200 L （每個試管取24份） 置于合適的培養(yǎng) 基平板， 用涂抹棒均勻涂抹， 3037培養(yǎng)23天， 培養(yǎng)至平板長出成熟菌落。 0029 4） 菌種斜面培養(yǎng) 0030 挑取單菌落接種于斜面培養(yǎng)基， 3037培養(yǎng)23天， 獲得生長成熟的斜面菌種。 0031 5） 菌種擴大培養(yǎng) 0032 將生長成熟的斜面菌種接種在25ml/5。

18、00mL搖瓶種子培養(yǎng)基中接種， 3037， 100-250r/min培養(yǎng)10-24小時， 獲得擴大的菌種培養(yǎng)液。 0033 6） 放大培養(yǎng)產(chǎn)酶 0034 將菌種擴大培養(yǎng)的菌種培養(yǎng)液接種在15升發(fā)酵罐接種培養(yǎng)， 3037， 培養(yǎng)2-3 天， 進行產(chǎn)酶測定， 已獲得高效產(chǎn)酶菌株， 根據(jù)培養(yǎng)酶活力大小選出優(yōu)良斜面出發(fā)菌株環(huán)狀 芽孢桿菌 （編號為BLB-32） 于生產(chǎn)低聚半乳糖。 0035 0036 0037 經(jīng)過放大產(chǎn)酶， 發(fā)現(xiàn)菌種產(chǎn)酶活力可以達到155單位以上， 具備很高的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用 能力。 具體實施方式 0038 為了更好的理解本發(fā)明， 下面結(jié)合具體實施例來進一步說明。 0039 環(huán)狀芽孢桿菌菌。

19、株 （Bacilluscirculans） BLB-32經(jīng)一級培養(yǎng)后， 接入二級培養(yǎng) 物中培養(yǎng)， 得到放大培養(yǎng)的產(chǎn)酶菌種液體。 0040 實施例1： 說明書 3/6 頁 5 CN 103911322 B 5 0041 一種環(huán)狀芽孢桿菌在共生發(fā)酵技術(shù)制低聚半乳糖中的應(yīng)用， 它包括如下步驟： 0042 （1） 菌種擴大培養(yǎng) 0043 將環(huán)狀芽孢桿菌BLB-32 （CGMCCNo.8864） 斜面接種在搖瓶種子培養(yǎng)基中， 30， 250rpm的振蕩速度下培養(yǎng)10h， 獲得擴大的菌種培養(yǎng)液； 種子培養(yǎng)基： 葡萄糖5g/L， 酵母膏 5g/L， 蛋白胨5g/L， 硫酸鎂0.3g/L， pH7.0， 種子。

20、培養(yǎng)基進行121和15分鐘的滅菌； ； 0044 （2） 放大培養(yǎng)產(chǎn)酶 0045 制酶培養(yǎng)基： 乳糖5g/L， 酵母膏5g/L， 蛋白胨5g/L， 硫酸鎂0.3g/L， 磷酸氫二鈉 0.01g/L， 磷酸二氫鈉0.01g/L， pH7.0， 制酶培養(yǎng)基進行121和15分鐘的滅菌； 0046 將步驟 （2） 得到的擴大的菌種培養(yǎng)液倒入盛有制酶培養(yǎng)基的15升發(fā)酵罐中接種培 養(yǎng)， 30， 攪拌速度100rpm， 通入空氣培養(yǎng)72h， 得到放大培養(yǎng)的環(huán)狀芽孢桿菌BLB-32及其釋 放的 -半乳糖苷酶用于生產(chǎn)低聚半乳糖； 經(jīng)產(chǎn)酶測定， 獲得酶活力160u/ml的環(huán)狀芽孢桿 菌BLB-32培養(yǎng)液。 004。

21、7 （3） 共生發(fā)酵乳糖轉(zhuǎn)化制備低聚半乳糖 0048 將4000g乳糖加入15升發(fā)酵罐中， 加水4000克， 加熱溶解后， 調(diào)解料液pH值7.0， 然 后接入放大培養(yǎng)獲得的酶活力160u/ml的環(huán)狀芽孢桿菌BLB-32培養(yǎng)液， 放大培養(yǎng)的環(huán)狀芽 孢桿菌BLB-32培養(yǎng)液接入量500ml/L， 酶液和菌體一起作用， 邊轉(zhuǎn)化邊產(chǎn)酶， 溫度控制在50 ， 反應(yīng)時間100小時， 經(jīng)過檢測組分低聚半乳糖達到59.5， 膜過濾去除菌體， 清液加入 5g/L活性炭進行脫色處理， 脫色溫度60， 脫色處理時間60分鐘， 后經(jīng)離子交換、 濃縮得到 低聚半乳糖組分含量大于59.5%的低聚半乳糖濃縮液。 低聚半乳糖。

22、濃縮液經(jīng)過真空干燥得 到低聚半乳糖粉體。 0049 低聚半乳糖濃縮液經(jīng)過色譜分離、 濃縮得到組分含量為91%的低聚半乳糖液體。 0050 組分含量91%的低聚半乳糖液體經(jīng)過真空干燥得到含量91%的低聚半乳糖粉體。 0051 實施例2： 0052 一種環(huán)狀芽孢桿菌在共生發(fā)酵技術(shù)制低聚半乳糖中的應(yīng)用， 它包括如下步驟： 0053 （1） 菌種擴大培養(yǎng) 0054 將環(huán)狀芽孢桿菌BLB-32 （CGMCCNo.8864） 斜面接種在搖瓶種子培養(yǎng)基中， 35， 100rpm的振蕩速度下培養(yǎng)24h， 獲得擴大的菌種培養(yǎng)液； 種子培養(yǎng)基： 葡萄糖20g/L， 酵母膏 20g/L， 蛋白胨20g/L， 硫酸鎂。

23、0.3g/L， pH7.0， 種子培養(yǎng)基進行121和15分鐘的滅菌； ； 0055 （2） 放大培養(yǎng)產(chǎn)酶 0056 制酶培養(yǎng)基： 乳糖20g/L， 酵母膏20g/L， 蛋白胨20g/L， 硫酸鎂0.3g/L， 磷酸氫二鈉 0.21g/L， 磷酸二氫鈉0.2g/L， pH7.0， 制酶培養(yǎng)基進行121和15分鐘的滅菌； 0057 將步驟 （2） 得到的擴大的菌種培養(yǎng)液倒入盛有制酶培養(yǎng)基的15升發(fā)酵罐中接種培 養(yǎng)， 35， 攪拌速度300rpm， 通入空氣培養(yǎng)30h， 得到放大培養(yǎng)的環(huán)狀芽孢桿菌BLB-32及其釋 放的 -半乳糖苷酶用于生產(chǎn)低聚半乳糖； 經(jīng)產(chǎn)酶測定， 獲得酶活力170u/ml的環(huán)狀。

24、芽孢桿 菌BLB-32培養(yǎng)液。 0058 （3） 共生發(fā)酵乳糖轉(zhuǎn)化制備低聚半乳糖 0059 取5000克乳糖加入15升發(fā)酵罐中， 加水6000克， 加熱溶解后， 調(diào)解料液pH值6.0， 然 后接入放大培養(yǎng)獲得的酶活力170u/ml的環(huán)狀芽孢桿菌BLB-32培養(yǎng)液， 放大培養(yǎng)的環(huán)狀芽 孢桿菌BLB-32培養(yǎng)液接入量200ml/L， 酶液和菌體一起作用， 邊轉(zhuǎn)化邊產(chǎn)酶， 溫度控制在50 說明書 4/6 頁 6 CN 103911322 B 6 ， 反應(yīng)時間96小時， 經(jīng)過組分檢測低聚半乳糖達到62.3， 立即用微濾膜去除菌體， 清液 加入10g/L活性炭進行脫色處理， 脫色溫度60， 脫色處理時間。

25、30分鐘。 后經(jīng)精制、 濃縮得到 62.3%的低聚半乳糖濃縮液。 0060 低聚半乳糖濃縮液經(jīng)過干燥得到含量62%的低聚半乳糖粉體。 0061 低聚半乳糖濃縮液經(jīng)過色譜分離、 濃縮得到組分含量95%的低聚半乳糖液體。 0062 組分含量95%低聚半乳糖液體經(jīng)過干燥得到組分含量95%的低聚半乳糖粉體。 0063 實施例3： 0064 一種環(huán)狀芽孢桿菌在共生發(fā)酵技術(shù)制低聚半乳糖中的應(yīng)用， 它包括如下步驟： 0065 （1） 菌種擴大培養(yǎng) 0066 將環(huán)狀芽孢桿菌BLB-32 （CGMCCNo.8864） 斜面接種在搖瓶種子培養(yǎng)基中， 37， 100rpm的振蕩速度下培養(yǎng)24h， 獲得擴大的菌種培養(yǎng)。

26、液； 種子培養(yǎng)基： 葡萄糖10g/L， 酵母膏 10g/L， 蛋白胨10g/L， 硫酸鎂0.3g/L， pH7.0， 種子培養(yǎng)基進行121和15分鐘的滅菌； ； 0067 （2） 放大培養(yǎng)產(chǎn)酶 0068 制酶培養(yǎng)基： 乳糖10g/L， 酵母膏10g/L， 蛋白胨10g/L， 硫酸鎂0.3g/L， 磷酸氫二鈉 0.2g/L， 磷酸二氫鈉0.2g/L， pH7.0， 制酶培養(yǎng)基進行121和15分鐘的滅菌； 0069 將步驟 （2） 得到的擴大的菌種培養(yǎng)液倒入盛有制酶培養(yǎng)基的15升發(fā)酵罐中接種培 養(yǎng)， 37， 攪拌速度200rpm， 通入空氣培養(yǎng)40h， 得到放大培養(yǎng)的環(huán)狀芽孢桿菌BLB-32及其釋。

27、 放的 -半乳糖苷酶用于生產(chǎn)低聚半乳糖； 經(jīng)產(chǎn)酶測定， 獲得酶活力165u/ml的環(huán)狀芽孢桿 菌培養(yǎng)液。 0070 （3） 共生發(fā)酵乳糖轉(zhuǎn)化制備低聚半乳糖 0071 取6000克乳糖加入15升發(fā)酵罐中， 加水6000克， 加熱溶解后， 調(diào)解料液pH值5.0， 然 后接入擴大培養(yǎng)獲得的酶活力165u/ml的環(huán)狀芽孢桿菌培養(yǎng)液， 酶活力165u/ml的環(huán)狀芽 孢桿菌培養(yǎng)液接入量100ml/L， 酶液和菌體一起作用， 溫度控制在60， 反應(yīng)時間100小時， 經(jīng)過組分檢測低聚半乳糖達到64.5， 立即用微濾膜去除菌體， 清液加入5g/L活性炭進行 脫色處理， 脫色溫度60， 脫色處理時間90分鐘。 后。

28、經(jīng)精制、 濃縮得到64.5%的低聚半乳糖濃 縮液。 0072 低聚半乳糖濃縮液經(jīng)過干燥得到含量64%的低聚半乳糖粉體。 0073 低聚半乳糖濃縮液經(jīng)過色譜分離、 濃縮得到組分含量99的低聚半乳糖液體。 0074 組分含量99的低聚半乳糖液體經(jīng)過干燥得到含量99%的低聚半乳糖粉體。 0075 實施例4： 0076 一種環(huán)狀芽孢桿菌在共生發(fā)酵技術(shù)制低聚半乳糖中的應(yīng)用， 它包括如下步驟： 0077 （1） 菌種擴大培養(yǎng) 0078 將環(huán)狀芽孢桿菌BLB-32 （CGMCCNo.8864） 斜面接種在搖瓶種子培養(yǎng)基中， 35， 100rpm的振蕩速度下培養(yǎng)24h， 獲得擴大的菌種培養(yǎng)液； 種子培養(yǎng)基： 。

29、葡萄糖20g/L， 酵母膏 20g/L， 蛋白胨20g/L， 硫酸鎂0.3g/L， pH7.0， 種子培養(yǎng)基進行121和15分鐘的滅菌； ； 0079 （2） 放大培養(yǎng)產(chǎn)酶 0080 制酶培養(yǎng)基： 乳糖10g/L， 酵母膏20g/L， 蛋白胨20g/L， 硫酸鎂0.3g/L， 磷酸氫二鈉 0.01g/L， 磷酸二氫鈉0.01g/L， pH7.0， 制酶培養(yǎng)基進行121和15分鐘的滅菌； 0081 將步驟 （2） 得到的擴大的菌種培養(yǎng)液倒入盛有制酶培養(yǎng)基的15升發(fā)酵罐中接種培 說明書 5/6 頁 7 CN 103911322 B 7 養(yǎng)， 35， 攪拌速度200rpm， 通入空氣培養(yǎng)40h， 得。

30、到放大培養(yǎng)的環(huán)狀芽孢桿菌BLB-32及其釋 放的 -半乳糖苷酶用于生產(chǎn)低聚半乳糖； 經(jīng)產(chǎn)酶測定， 獲得酶活力170u/ml的環(huán)狀芽孢桿 菌培養(yǎng)液。 0082 （3） 共生發(fā)酵乳糖轉(zhuǎn)化制備低聚半乳糖 0083 取6000克乳糖加入15升發(fā)酵罐中， 加水5000克， 加熱溶解后， 調(diào)解料液pH值5.0， 然 后接入擴大培養(yǎng)獲得的酶活力168u/ml的環(huán)狀芽孢桿菌培養(yǎng)液， 酶活力168u/ml的環(huán)狀芽 孢桿菌培養(yǎng)液接入量100ml/L， 酶液和菌體一起作用， 邊轉(zhuǎn)化邊產(chǎn)酶， 溫度控制在30， 反應(yīng) 時間80小時， 然后加入10g/L的面包酵母進行共生發(fā)酵， 經(jīng)過組分檢測低聚半乳糖達到 73.6， 立即用微濾膜去除菌體， 清液加入10g/L活性炭進行脫色處理， 脫色溫度90， 脫色 處理時間60分鐘。 后經(jīng)精制、 濃縮得到73.6%的低聚半乳糖濃縮液。 0084 低聚半乳糖濃縮液經(jīng)過干燥得到含量73%的低聚半乳糖粉體。 0085 低聚半乳糖濃縮液經(jīng)過色譜分離、 濃縮得到組分含量99的低聚半乳糖液體。 0086 組分含量99的低聚半乳糖液體經(jīng)過干燥得到含量99%的低聚半乳糖粉體。 說明書 6/6 頁 8 CN 103911322 B 8 。

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