一、引 言

每年年底，《Nature Methods》都會(huì)對(duì)過去一年中推動(dòng)生命科學(xué)發(fā)展的技術(shù)方法做出回顧與總結(jié)，由此評(píng)選出當(dāng)年最受矚目、影響力最大的技術(shù)。

2017年，類器官（organoids）榮膺Nature Methods年度生命科學(xué)技術(shù)。在廣大科研工作者的不懈努力之下，近年來，類器官研究取得了豐碩的研究成果。

所謂的“類器官”是由干細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞在三維培養(yǎng)條件下自我組裝而成的一種三維的微器官，它能夠高度模擬原位組織的生理結(jié)構(gòu)和功能，經(jīng)長期傳代保持穩(wěn)定的遺傳信息。

類器官可以稱得上是神奇的“多面手”，其高度仿真的特性，讓研究人員可以利用該模型，深入觀察器官的發(fā)育進(jìn)程，檢驗(yàn)藥物的功能以及發(fā)展實(shí)驗(yàn)室層面的再生治療方法。 

本文作者：Dr. Grace Yuan

二、類器官培養(yǎng)進(jìn)展

2019年美國賓夕法尼亞大學(xué)的科研人員在Cell上發(fā)表了題為“A Patient-Derived Glioblastoma Organoid Model and Biobank Recapitulates Inter- and Intra-tumoral Heterogeneity”的文章，文章中報(bào)道了病人源性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤類器官（glioblastoma organoid，GBO）模型和生物庫的建立。

該研究表明GBO保留了膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的主要特征，可以迅速用于為患者制定治療策略?？蒲腥藛T建立的生物庫為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤基礎(chǔ)和轉(zhuǎn)化研究提供了豐富的資源。

通過明場圖像展示保留親代腫瘤組織學(xué)特征的病人源性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤類器官的形成過程

在這篇文章中，科研工作者不僅通過顯微鏡觀察記錄了類器官的生長過程和形態(tài)變化，還通過激光掃描共聚焦顯微鏡觀察了一些蛋白標(biāo)志物在類器官中的表達(dá)模式，證明了類器官細(xì)胞形態(tài)與特征上明顯的異質(zhì)性，其細(xì)胞組成與親代腫瘤高度相似。

共聚焦圖像展示了病人源性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤類器官中的微血管以及缺氧梯度?？?中細(xì)胞因缺氧無增殖細(xì)胞產(chǎn)生，而框2中綠色細(xì)胞為增殖細(xì)胞。

2020年1月24日，Science期刊發(fā)表了一篇題為“Chromatin accessibility dynamics in a model of human forebrain development”的論文。在這篇論文中，科研人員描述了人類前腦類器官的培育及用途。作為球狀結(jié)構(gòu)，人類前腦類器官可以自組裝成前腦的不同部分。更令人興奮的是，研究人員還找到了一種可以極大地延長人類前腦類器官的壽命（長達(dá)300天）的方法，這足以觀察到前腦類器官發(fā)展成更復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。

2022年發(fā)表在Science上的“Amplification of human interneuron progenitors promotes brain tumors and neurological defects”，揭示了人類特定的發(fā)育過程是導(dǎo)致皮質(zhì)發(fā)育畸形(MCDs)的原因，這會(huì)導(dǎo)致兒童發(fā)育遲緩和癲癇。研究中，科研人員建立了結(jié)節(jié)硬化癥(tuberous sclerosis complex, TSC)的人腦類器官模型，并鑒定了一種特定的神經(jīng)干細(xì)胞類型，即尾部晚期中間神經(jīng)元祖細(xì)胞 (caudal late interneuron progenitor，CLIP)。在TSC中，CLIP細(xì)胞過度增殖，產(chǎn)生過多的中間神經(jīng)元、腦腫瘤和皮層畸形。

雖然類器官作為研究模型，在發(fā)育、疾病和藥物研究，以及再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域具有廣闊的發(fā)展前景，但因其培養(yǎng)條件及結(jié)構(gòu)等都要比貼壁細(xì)胞復(fù)雜，因此在類器官的培養(yǎng)、觀察以及數(shù)據(jù)量化分析方面，都具有很多難點(diǎn)。今天就給大家簡單梳理一下，顯微成像設(shè)備如何助力類器官的培養(yǎng)、觀察和數(shù)據(jù)分析。

三、顯微成像助力類器官相關(guān)研究

1. 類器官的培養(yǎng)質(zhì)控

類器官制備的典型方法是分離胚胎或多能干細(xì)胞，然后將這些細(xì)胞培養(yǎng)在基質(zhì)膠Matrigel類的支持介質(zhì)上，使其能夠三維生長。介導(dǎo)類器官形成的信號(hào)通路與體內(nèi)器官發(fā)育與穩(wěn)態(tài)維持的信號(hào)通路是相同的，因此，細(xì)胞因子、生長因子和小分子也要添加到培養(yǎng)基中，以激活或者抑制參與類器官形成的特定信號(hào)通路。制備不同的類器官需使用不同的添加物組合，即使對(duì)于小腸和結(jié)腸等結(jié)構(gòu)非常相近的組織，添加物的組合也不盡相同。

有研究表明，未分化狀態(tài)培養(yǎng)過程中 iPS 細(xì)胞系的初始增殖狀態(tài)對(duì)隨后的分化誘導(dǎo)效率有著極大的影響。因此，在為類器官分化階段開發(fā)更優(yōu)方案之外，優(yōu)化單個(gè) iPS 細(xì)胞系的未分化狀態(tài)培養(yǎng)階段的方案，對(duì)于可重復(fù)地生成多份類器官樣本來說至關(guān)重要。

奧林巴斯公司研發(fā)的CM20細(xì)胞培養(yǎng)監(jiān)測系統(tǒng)可將監(jiān)控頭和細(xì)胞或類器官培養(yǎng)物共同置于培養(yǎng)箱中，系統(tǒng)定期對(duì)培養(yǎng)標(biāo)本進(jìn)行掃描，數(shù)據(jù)將通過計(jì)算機(jī)工作站進(jìn)行無線通信。使用CM20 細(xì)胞培養(yǎng)監(jiān)測系統(tǒng)，對(duì)樣品進(jìn)行時(shí)間序列培養(yǎng)數(shù)據(jù)采集、存儲(chǔ)和分析，科研工作者能夠了解 iPS 細(xì)胞在培養(yǎng)期間的狀態(tài)，并確定提高分化效率的關(guān)鍵因素，從而進(jìn)一步改進(jìn)試驗(yàn)方案。

細(xì)胞培養(yǎng)監(jiān)控系統(tǒng)CM20

由于類器官的培養(yǎng)時(shí)間長，所需培養(yǎng)基以及維持其生長的添加物價(jià)格較貴，因此科研工作者需要特別關(guān)注類器官的培養(yǎng)過程及其生長狀況，并且盡量避免培養(yǎng)中的類器官被污染。使用CM20系統(tǒng)后，科研人員無需進(jìn)入潔凈室從培養(yǎng)箱中取出標(biāo)本鏡檢，即可對(duì)培養(yǎng)標(biāo)本的生長狀況進(jìn)行遠(yuǎn)程監(jiān)控，極大地提升了實(shí)驗(yàn)效率，降低了污染的風(fēng)險(xiǎn)。

CM20系統(tǒng)除了幫助科研人員遠(yuǎn)程監(jiān)控持續(xù)培養(yǎng)中的標(biāo)本的生長狀況，還可以提供定量數(shù)據(jù)，例如對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)并確定融合度分析，從而幫助廣大科研工作者優(yōu)化培養(yǎng)條件，實(shí)現(xiàn)對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行精確的質(zhì)量控制并評(píng)估實(shí)驗(yàn)流程節(jié)點(diǎn)。

CM20拍攝到的類器官在培養(yǎng)箱中的發(fā)育過程

2. 類器官的顯微成像

由于類器官屬于三維細(xì)胞培養(yǎng)物，具有一定的體積，因此在進(jìn)行成像時(shí)，為了獲取完整的類器官形態(tài)特征及內(nèi)部細(xì)胞結(jié)構(gòu)，能夠采集多層Z軸圖像信息進(jìn)行3D成像的顯微成像設(shè)備是首選。

1）激光掃描共聚焦因其光路設(shè)計(jì)中增加了用于阻擋非焦平面信息的針孔，可以提高Z軸的分辨率，適合對(duì)類器官標(biāo)本進(jìn)行Z序列圖像的采集。

奧林巴斯激光掃描共聚焦FV3000具有靈敏度高、成像精度高、光譜分辨率高等特點(diǎn)，系統(tǒng)采用專利的體相位全息透射衍射光柵進(jìn)行分光，可在所有通道上進(jìn)行高效、準(zhǔn)確的全真光譜檢測獲得高分辨率、高對(duì)比度的樣品圖像，從而構(gòu)建精確的3D圖像，特別適合進(jìn)行類器官的深層觀察。該系統(tǒng)還提供了成熟的近紅外成像解決方案，近紅外成像由于具有穿透深、光毒性小、組織自發(fā)光干擾小等優(yōu)點(diǎn)，可與可見光范圍內(nèi)的各種熒光染料搭配，進(jìn)行無串?dāng)_的類器官多色熒光成像。

激光掃描共聚焦顯微鏡FV3000  

FV3000對(duì)3D培養(yǎng)的細(xì)胞球連續(xù)觀察21天。SYTOX? Orange標(biāo)記細(xì)胞核，Alexa Fluor 488 標(biāo)記了細(xì)胞骨架。

2）對(duì)于體積較大的類器官標(biāo)本，不僅需要采集Z序列圖像，往往還需要進(jìn)行拼圖，這對(duì)成像系統(tǒng)的圖像采集速度有較高的要求。

奧林巴斯超分辨轉(zhuǎn)盤共聚焦SpinSR具有成像速度快、靈敏度高、光毒性低、可升級(jí)分辨率高達(dá)110nm的超分辨模塊等特點(diǎn)，可以對(duì)類器官標(biāo)本進(jìn)行快速的Z序列成像及拼圖。SpinSR系統(tǒng)可搭配奧林巴斯率先研發(fā)的一系列硅油物鏡，對(duì)類器官進(jìn)行高分辨率高信噪比深層成像。

超分辨轉(zhuǎn)盤共聚焦系統(tǒng)SpinSR

適合進(jìn)行深層成像的硅油物鏡

硅油物鏡以其特殊的折射率為1.40的硅油做為介質(zhì)，即滿足采集高分辨率圖像的要求（分辨率高于浸水介質(zhì)物鏡），又滿足類器官等厚標(biāo)本的高散射標(biāo)本觀察。

3）對(duì)于體積較大的類器官標(biāo)本，為了采集到完整的標(biāo)本圖像，對(duì)成像深度有更高的需求。雙光子或者光片顯微鏡是最適合進(jìn)行深層成像的顯微成像系統(tǒng)。

奧林巴斯FVMPE-RS多光子顯微鏡采用了先進(jìn)的光學(xué)設(shè)計(jì)，可提高深度成像靈敏度和分辨率。400 nm至1600 nm的超寬光譜透過率可在不影響短波長檢測的情況下實(shí)現(xiàn)更高效近紅外激發(fā)；大靶面高效率的檢測光路可以匯集更多的發(fā)射信號(hào)，尤其是大角度的散射光子 ，采集到類器官標(biāo)本更深層的信息；TruResolution物鏡可通過自動(dòng)球差補(bǔ)償提高深層成像亮度和分辨率，從而獲得三維圖像在各個(gè)層面上的更多細(xì)節(jié)信息。

雙光子顯微鏡 FVMPE-RS

奧林巴斯在售的光片顯微鏡系統(tǒng) Alpha3 具備實(shí)時(shí)光學(xué)聚焦擴(kuò)展功能的雙照明系統(tǒng)，可在整個(gè)視場上實(shí)現(xiàn)均勻照明，有助于獲取標(biāo)本的全部信息，并使得采集到的類器官Z序列數(shù)據(jù)，經(jīng)3D重構(gòu)后完全沒有拼接的痕跡；

系統(tǒng)可以搭配多種耐腐蝕樣品適配器，具備從細(xì)胞到整個(gè)透明化組織或生物體成像的靈活性；該光片系統(tǒng)還具備智能3D掃描技術(shù)，能夠以75幅/秒的速度采集圖像；兼容奧林巴斯全系列物鏡，適合對(duì)多種標(biāo)本進(jìn)行從宏觀到微觀的成像。

需要特別注意的是，當(dāng)類器官體積較大時(shí)，則需要對(duì)其進(jìn)行透明化處理，才能利用光片顯微鏡或雙光子顯微鏡采集到完整的類器官圖像。

光片顯微鏡系統(tǒng)Alpha3

3. 類器官圖像的量化分析

利用激光掃描共聚焦、雙光子、光片等高端顯微成像設(shè)備，可以拍攝到類器官標(biāo)本從宏觀到微觀清晰的圖像，幫助科研工作者觀察到3D標(biāo)本內(nèi)部每一個(gè)細(xì)胞乃至亞細(xì)胞的精細(xì)結(jié)構(gòu)。

但是對(duì)于生命科學(xué)研究來說，只是觀察到標(biāo)本的細(xì)節(jié)圖像是不夠的，在以類器官模型檢驗(yàn)藥物功效及毒理分析等實(shí)驗(yàn)中，還需要對(duì)類器官標(biāo)本形態(tài)及內(nèi)部的細(xì)胞進(jìn)行定性和定量分析。例如比較多孔板中不同給藥濃度下多個(gè)類器官標(biāo)本之間的差異，從而獲得更令人信服的統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)。

針對(duì)這些應(yīng)用需求，奧林巴斯開發(fā)了一款專門針對(duì)微組織球與類器官等3D標(biāo)本進(jìn)行細(xì)胞分析的軟件— Novisight。

Novisight軟件界面及對(duì)不同濃度紫杉醇處理后的細(xì)胞球內(nèi)部有絲分裂細(xì)胞的量化分析示例

NoviSight特別適合對(duì)多孔板內(nèi)培養(yǎng)的細(xì)胞球或類器官等標(biāo)本在復(fù)雜的3D范圍內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞識(shí)別、分析和統(tǒng)計(jì)。該軟件特有的True 3D技術(shù)可幫助您真實(shí)還原樣品的空間形態(tài)，而多參量測量模塊可快速識(shí)別類器官及細(xì)胞組分，獲取如體積、表面積、空間距離和熒光強(qiáng)度等數(shù)據(jù)。此外，其交互式的設(shè)計(jì)讓您可以輕松地將細(xì)胞和統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)一一對(duì)應(yīng)，保證了數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析時(shí)的準(zhǔn)確性。

由于類器官在基因水平和形態(tài)特點(diǎn)上能夠很好地模擬人體相應(yīng)的組織，使其在發(fā)育模擬、疾病研究、臨床免疫、腫瘤藥敏、再生醫(yī)學(xué)和精準(zhǔn)醫(yī)療等領(lǐng)域擁有廣闊的發(fā)展前景。但作為新興技術(shù)，類器官標(biāo)本培養(yǎng)、質(zhì)量控制、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性等方面依然有著局限性，因此類器官的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用轉(zhuǎn)化依然任重道遠(yuǎn)。

奧林巴斯作為一家具有百年歷史的顯微鏡制造商, 一直致力于為廣大科研工作者提供全流程的實(shí)驗(yàn)協(xié)助和技術(shù)支持。

我們希望通過為類器官研究提供從樣本制備到3D 數(shù)據(jù)采集與分析的完整解決方案，為”實(shí)現(xiàn)世界人民的健康、安心和幸福生活”略盡綿薄之力。

參考文獻(xiàn)：

[1] Fadi Jacob  A Patient-Derived Glioblastoma Organoid Model and Biobank Recapitulates Inter- and Intra-tumoral Heterogeneity. Cell 180 188-204 (2020)

[2] Alexandro E. Trevino  Chromatin accessibility dynamics in a model of human forebrain development. Science 367 No 6476 (2020)

[3] Oliver L.  Amplification of human interneuron progenitors promotes brain tumors and neurological defects. Science 375, No 6579 (2022)

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網(wǎng)址: 如何用顯微成像解決方案“助力類器官研究” http://m.u1s5d6.cn/newsview681614.html