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非抑制離子色譜法測(cè)定左旋肉堿

來(lái)源：泰然健康網(wǎng) 時(shí)間：2024年12月16日 22:10

【非抑制離子色譜法測(cè)定左旋肉堿】

左旋肉堿(L-carnitine, β-羥基γ-三甲銨丁酸)又稱肉毒堿或維生素BT，其化學(xué)式為C7H15O3N，分子量為162.2，是一種促使脂肪轉(zhuǎn)化為能量的類(lèi)氨基酸。L-肉堿的主要功能是參與動(dòng)物體內(nèi)的脂肪代謝，它作為載體將長(zhǎng)鏈脂肪酸從腺粒體膜外輸送到膜內(nèi)，促進(jìn)脂肪酸的β-氧化，從而促進(jìn)脂肪的代謝，因此左旋肉堿具有多種重要的生理功能。

左旋肉堿已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、保健和食品等領(lǐng)域，被瑞士、法國(guó)、美國(guó)和世界衛(wèi)生組織規(guī)定為法定的多用途營(yíng)養(yǎng)劑。我國(guó)食品添加劑衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB2760-1996規(guī)定了左旋肉堿酒石酸鹽為食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑，可應(yīng)用于咀嚼片、飲液、膠囊、乳粉及乳飲料等。市場(chǎng)上已出現(xiàn)了許多以左旋肉堿為主要功能的減肥產(chǎn)品。

左旋肉堿極性較強(qiáng)，缺少發(fā)色基團(tuán)，定量分析困難。國(guó)內(nèi)外對(duì)左旋肉堿的測(cè)定主要有酶法、電泳法、電化學(xué)法，高效液相色譜法等。高效液相色譜法中有的需要衍生、有的靈敏度較低。其它方法準(zhǔn)確性較差，設(shè)備較貴等原因較少使用。

離子色譜法可測(cè)定在水溶液中能電離的物質(zhì)。在酸性溶液中，左旋肉堿表現(xiàn)為陽(yáng)離子特性，帶正電荷，可用陽(yáng)離子交換色譜柱分離。但左旋肉堿的兩性特征使其無(wú)法采用抑制型電導(dǎo)檢測(cè)。為此，我們通過(guò)實(shí)驗(yàn)，摸索出左旋肉堿的非抑制型離子色譜測(cè)定的新方法。該方法前處理簡(jiǎn)便、檢測(cè)快速，用于實(shí)際樣品的檢測(cè)，結(jié)果令人滿意。

實(shí)驗(yàn)條件

儀器條件

儀器：ICS系列離子色譜系統(tǒng)帶柱溫箱;分析柱：IonPac CS17 + IonPac CG17，4 mm;流動(dòng)相組成：MSA：0~22 min，5 mM;流速：1 ml/min;柱溫：30℃;檢測(cè)方式：抑制型電導(dǎo)檢測(cè);進(jìn)樣量:25 μl。

樣品前處理

膠囊：拆開(kāi)膠囊外皮，稱取其中的粉末樣品約0.1g，至100 ml容量瓶中，用超純水定容到100 ml后，室溫超聲提取30 min，靜置30 min，取上層清液，4000 r/min離心20 min后，將溶液通過(guò)0.22μm尼龍濾膜和On Guard II RP柱，棄去6 ml初始流出液后采集2 ml樣品用于離子色譜測(cè)定。

咀嚼片：將咀嚼片粉碎，混勻，稱取其中的粉末樣品約0.1 g至100ml容量瓶中，用超純水定容到100 ml后，室溫超聲提取30 min，靜置30 min，取上層清液，4000 r/min離心20 min后，將溶液通過(guò)0.22μm尼龍濾膜和On Guard II RP柱，棄去6 ml初始流出液后采集2 ml樣品用于離子色譜測(cè)定。On Guard II RP柱(2.5 cc)，預(yù)先使用10 ml甲醇和15 ml水活化。

結(jié)果與討論

前處理?xiàng)l件的選擇

減肥產(chǎn)品中，通常加入左旋肉堿穩(wěn)定形式的左旋肉堿酒石酸鹽。左旋肉堿酒石酸鹽易溶于水，但不易溶于有機(jī)溶劑。離子色譜的淋洗液是水溶液，因此選用水作提取劑。對(duì)用水作溶劑提取極性化合物，超聲提取是有效的提取方法。我們考察了用超聲提取時(shí)，提取溫度與提取時(shí)間對(duì)回收率的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果列于表1和表2。

從表1數(shù)據(jù)可見(jiàn)，增加提取時(shí)間，測(cè)得結(jié)果逐漸增大，當(dāng)提取時(shí)間大于20min后，提取效率增大不明顯了?？紤]到某些基體復(fù)雜的減肥產(chǎn)品，可將提取時(shí)間適當(dāng)延長(zhǎng)，因此提取時(shí)間選擇為30 min。表2中，30 ℃時(shí)測(cè)得左旋肉堿含量已經(jīng)是50 ℃時(shí)的99.9%，這說(shuō)明30 ℃左旋肉堿的提取已經(jīng)充分。因此選擇在30℃、30 min下超聲提取即可。

表1. 30℃下，提取時(shí)間對(duì)回收率的影響

表2. 提取溫度對(duì)回收率的影響

色譜柱的選擇

按實(shí)驗(yàn)方法，我們比較了左旋肉堿在IonPac SCS1、IonPac CS12A、IonPac CS17三種不同色譜柱上的出峰及分離情況。SCS1柱為硅膠基質(zhì)的色譜柱，不耐酸堿，雖然可用低濃度(3 mM)的淋洗液等度洗脫，但L-肉堿在該柱拖尾嚴(yán)重，對(duì)稱因子為4.05，靈敏度不高。CS12A柱的離子交換功能基團(tuán)為羧基/磷酸基，柱容量高(2800 ueq)，親水性較CS17柱弱，對(duì)一價(jià)和二價(jià)陽(yáng)離子的保留相對(duì)較強(qiáng)，對(duì)疏水性比較強(qiáng)的L-左旋肉堿離子保留比較強(qiáng)，需用高濃度的淋洗液才能洗脫保留的陽(yáng)離子，這會(huì)導(dǎo)致高的背景電導(dǎo)和高的檢出限。采用15.56 mM的甲基磺酸在CS12A柱上等度淋洗左旋肉堿，背景電導(dǎo)5371 uS，色譜峰的對(duì)稱因子2.25，理論塔板數(shù)1936，可見(jiàn)對(duì)稱性和柱效也不好。CS17柱功能基團(tuán)為羧酸基，柱容量(1450 ueq)較CS12A柱低，可用較低濃度的淋洗液洗脫一價(jià)和二價(jià)陽(yáng)離子，因此降低背景電導(dǎo)，提高檢出限。L-肉堿在此色譜上對(duì)稱性良好，5 mM等度淋洗，對(duì)稱因子為1.17，與可能存在的其它陽(yáng)離子易于分開(kāi)。因此，選擇CS17 + CG17作為分析L-左旋肉堿的色譜柱。

淋洗液濃度的確定

我們選用不同濃度的甲基磺酸，測(cè)定混合標(biāo)樣a中左旋肉堿的色譜分析特征。隨著淋洗液濃度降低，背景電導(dǎo)降低，噪聲降低，理論塔板數(shù)提高，各成分間的分離度增大，對(duì)稱因子降低，峰形改善(如表3所示)。但由于濃度降低，酸度降低，導(dǎo)致峰高降低，靈敏度降低。因?yàn)長(zhǎng)-肉堿是弱堿，溶液的酸度減弱，L-肉堿的解離減弱，電導(dǎo)響應(yīng)也將減弱。同時(shí)，更低濃度的酸使各成分的保留時(shí)間明顯增長(zhǎng)，特別是兩價(jià)離子的保留時(shí)間增加更多，當(dāng)濃度

降低到3 mmol/L時(shí)，Ca2+的保留時(shí)間大于50 min，不利于提高分析效率(如表4所示)。綜合考慮，我們選擇5 mmol/L的甲基磺酸作為分析用淋洗液。

表3. 不同淋洗液濃度對(duì)左旋肉堿分析能力的影響

表4. 不同淋洗液濃度對(duì)各種離子保留時(shí)間的影響

a Li+(0.5 mg/L); Na+(5 mg/L); NH4+(5 mg/L); K+(5 mg/L); L-carnitine(400 mg/L); 6 Choline+Acetylcholine(50 mg/L + 50 mg.L) ; 7 Mg2+(5 mg/L); 8 Ca2+(5 mg/L)

干擾實(shí)驗(yàn)

由于鉀、鈉、鈣、鎂、銨為水中的常見(jiàn)離子，在樣品中普遍存在。而某些含左旋肉堿的保健產(chǎn)品也會(huì)添加膽堿類(lèi)類(lèi)物質(zhì)例如膽堿及乙酰膽堿來(lái)促進(jìn)脂肪運(yùn)輸和神經(jīng)發(fā)育。因此我們考察了常見(jiàn)陽(yáng)離子及膽堿和乙酰膽堿對(duì)左旋肉堿出峰的影響。從圖1可見(jiàn)，常見(jiàn)六種陽(yáng)離子能與左旋肉堿較好分離。50 mg/L的膽堿和乙酰膽堿與400 mg/L的左旋肉堿出峰互相不干擾，分離度達(dá)到2.72.

圖1. L-肉堿及共存離子分離色譜圖。
圖1. L-肉堿及共存離子分離色譜圖。

檢出限與線性范圍

按實(shí)驗(yàn)方法在選定的色譜條件下，對(duì)左旋肉堿進(jìn)行線性和檢出限測(cè)定。檢出限按照S/N=3進(jìn)行測(cè)算，Noise=0.06 μS。數(shù)據(jù)見(jiàn)表5。在選定的濃度范圍內(nèi)，線性相關(guān)系數(shù)r>0.999。左旋肉堿檢出限1 mg/g。

表5. 左旋肉堿檢出限與線性范圍

精密度與回收率

按實(shí)驗(yàn)方法，取減肥產(chǎn)品進(jìn)行不同濃度加標(biāo)試驗(yàn)，連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定左旋肉堿平均回收率和精密度，結(jié)果列于表6，該方法的回收率在87.9%~106%之間，RSD小于6.6%。

表6. 方法的回收率與精密度(n=5)

實(shí)際樣品分析

按實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)市售標(biāo)示含有左旋肉堿的減肥產(chǎn)品進(jìn)行了測(cè)試，結(jié)果見(jiàn)表7及圖2。

表7. 實(shí)際樣品中左旋肉堿含量

(-*: Not Detected)

圖2. 實(shí)際樣品分離譜圖。

小結(jié)

采用非抑制型離子色譜法來(lái)測(cè)定左旋肉堿具有簡(jiǎn)單、快速、干擾少、環(huán)保等特點(diǎn)。相比常見(jiàn)液相色譜方法，無(wú)需衍生化，避免了繁瑣的操作，節(jié)約時(shí)間，重復(fù)性好。該方法可用于減肥產(chǎn)品中左旋肉堿的含量測(cè)定。

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