本發(fā)明涉及產(chǎn)左旋肉堿的重組菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用，屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：左旋肉堿(l-carnitine)，又稱(chēng)l-肉堿或音譯卡尼丁，是一種促使脂肪轉(zhuǎn)化為能量的類(lèi)氨基酸，紅色肉類(lèi)是左旋肉堿的主要來(lái)源，對(duì)人體無(wú)毒副作用，極易吸潮。左旋肉堿的主要生理功能是促進(jìn)脂肪轉(zhuǎn)化成能量，服用左旋肉堿能夠在減少身體脂肪、降低體重的同時(shí)，不減少水分和肌肉，在2003年被國(guó)際肥胖健康組織認(rèn)定為最安全無(wú)副作用的減肥營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充品。左旋肉堿的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和醫(yī)用價(jià)值以及良好的市場(chǎng)前景，吸引了世界各國(guó)科學(xué)家對(duì)其進(jìn)行廣泛和深入的研究。目前世界上只有瑞士、意大利、日本等為左旋肉堿的主要生產(chǎn)國(guó)。我國(guó)大部分左旋肉堿需求還是依靠進(jìn)口，價(jià)格昂貴，亟待研發(fā)新進(jìn)展，以填補(bǔ)國(guó)內(nèi)空白。因此，不斷開(kāi)發(fā)低成本、高合成率、易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的左旋肉堿合成新路線，顯得尤為重要。左旋肉堿的制備方法很多，其制備可通過(guò)從動(dòng)物肉浸膏中提取、生物合成和化學(xué)合成等方法。提取法產(chǎn)量低，純化步驟多，成本高且難以形成規(guī)?；a(chǎn)?；瘜W(xué)合成法主要采取2種途徑：(1)先制取出外消旋肉堿，利用拆分劑析出左旋體；(2)以不同的化學(xué)物質(zhì)為原料進(jìn)行合成。生物合成法制備左旋肉堿主要有兩種方法，一是微生物發(fā)酵法，二是利用酶法轉(zhuǎn)化。全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化是一種高效、綠色的生物轉(zhuǎn)化過(guò)程，已成功運(yùn)用在多種產(chǎn)品的工業(yè)生產(chǎn)上，全細(xì)胞催化通過(guò)細(xì)胞壁的保護(hù)使酶更加穩(wěn)定，彌補(bǔ)了體外酶法轉(zhuǎn)化酶活不穩(wěn)定的缺點(diǎn)。因此利用全細(xì)胞催化方法生產(chǎn)左旋肉堿值得深入研究。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供左旋肉堿產(chǎn)量高的重組菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明首先提供了一種產(chǎn)左旋肉堿的重組菌的構(gòu)建方法。本發(fā)明提供的產(chǎn)左旋肉堿的重組菌的構(gòu)建方法為如下1)或2)：1)包括如下步驟：將γ-丁基甜菜堿羥化酶基因和肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因?qū)胧荏w菌得到產(chǎn)左旋肉堿的重組菌；2)包括如下步驟：將γ-丁基甜菜堿羥化酶基因?qū)胧荏w菌得到產(chǎn)左旋肉堿的重組菌；所述受體菌為突變型大腸桿菌或野生型大腸桿菌；所述突變型大腸桿菌為下述a1至a7中的任一種：a1、所述突變型大腸桿菌為對(duì)所述野生型大腸桿菌進(jìn)行下述a1、a3和a5的改造后得到的所述野生型大腸桿菌的突變體，將其記作大腸桿菌突變體s7；a2、所述突變型大腸桿菌為對(duì)所述野生型大腸桿菌進(jìn)行下述a1和a5的改造后得到的所述野生型大腸桿菌的突變體，將其記作大腸桿菌突變體s6；a3、所述突變型大腸桿菌為對(duì)所述野生型大腸桿菌進(jìn)行下述a1、a2和a3的改造后得到的所述野生型大腸桿菌的突變體，將其記作大腸桿菌突變體s5；a4、所述突變型大腸桿菌為對(duì)所述野生型大腸桿菌進(jìn)行下述a1和a4的改造后得到的所述野生型大腸桿菌的突變體，將其記作大腸桿菌突變體s4；a5、所述突變型大腸桿菌為對(duì)所述野生型大腸桿菌進(jìn)行下述a1和a3的改造后得到的所述野生型大腸桿菌的突變體，將其記作大腸桿菌突變體s3；a6、所述突變型大腸桿菌為對(duì)所述野生型大腸桿菌進(jìn)行下述a1和a2的改造后得到的所述野生型大腸桿菌的突變體，將其記作大腸桿菌突變體s2；a7、所述突變型大腸桿菌為對(duì)所述野生型大腸桿菌進(jìn)行下述a1的改造后得到的所述野生型大腸桿菌的突變體，將其記作大腸桿菌突變體s1；a1、將所述野生型大腸桿菌基因組中的α-酮戊二酸脫氫酶基因(suca)敲除；a2、將所述野生型大腸桿菌基因組中的異檸檬酸裂合酶基因(acea)敲除；a3、用乙酰輔酶a合成酶基因(acs)替換所述野生型大腸桿菌基因組中的丙酮酸氧化酶基因(poxb)；a4、將所述野生型大腸桿菌基因組中的巴豆甜菜堿還原酶基因(caia)、甜菜堿/肉堿輔酶a轉(zhuǎn)移酶基因(caib)、輔酶a連接酶基因(caic)、巴豆甜菜堿coa水合酶基因(caid)、肉堿消旋酶及肉堿脫水酶活性誘導(dǎo)基因(caie)構(gòu)成的caiabcde基因簇敲除；a5、將所述野生型大腸桿菌基因組中的肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(cait)、巴豆甜菜堿還原酶基因(caia)、甜菜堿/肉堿輔酶a轉(zhuǎn)移酶基因(caib)、輔酶a連接酶基因(caic)、巴豆甜菜堿coa水合酶基因(caid)、肉堿消旋酶及肉堿脫水酶活性誘導(dǎo)基因(caie)構(gòu)成的caitabcde基因簇敲除，且將所述caitabcde基因簇上游的操縱子fixabcx基因簇敲除。上述方法中的敲除和替換均可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員利用本領(lǐng)域熟知的手段實(shí)現(xiàn)，也可以是通過(guò)花費(fèi)創(chuàng)造性勞動(dòng)實(shí)現(xiàn)。在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，所述敲除和所述替換均通過(guò)同源重組實(shí)現(xiàn)。進(jìn)一步的，被導(dǎo)入所述受體菌的所述γ-丁基甜菜堿羥化酶基因編碼的蛋白質(zhì)為b1)或b2)所示的蛋白質(zhì)：b1)由seqidno.1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；b2)由seqidno.1所示的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代和/或缺失/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基得到的具有γ基丁基甜菜堿羥化酶活性的由b1)衍生的蛋白質(zhì)；被導(dǎo)入所述受體菌的所述肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因編碼的蛋白質(zhì)為b3)或b4)所示的蛋白質(zhì)：b3)由seqidno.3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；b4)由seqidno.3所示的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代和/或缺失/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基得到的具有肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的由b3)衍生的蛋白質(zhì)；所述α-酮戊二酸脫氫酶基因編碼的蛋白質(zhì)為c1)或c2)所示的蛋白質(zhì)：c1)由genbank號(hào)為aac73820.1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；c2)由genbank號(hào)為aac73820.1所示的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代和/或缺失/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基得到的具有α-酮戊二酸脫氫酶活性的由c1)衍生的蛋白質(zhì)；所述異檸檬酸裂合酶基因編碼的蛋白質(zhì)為d1)或d2)所示的蛋白質(zhì)：d1)由genbank號(hào)為aac76985.1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；d2)由genbank號(hào)為aac76985.1所示的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代和/或缺失/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基得到的具有異檸檬酸裂合酶活性的由d1)衍生的蛋白質(zhì)；所述乙酰輔酶a合成酶基因編碼的蛋白質(zhì)為e1)或e2)所示的蛋白質(zhì)：e1)由genbank號(hào)為aac77039.1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；e2)由genbank號(hào)為aac77039.1所示的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代和/或缺失/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基得到的具有乙酰輔酶a合成酶活性的由e1)衍生的蛋白質(zhì)；所述丙酮酸氧化酶基因編碼的蛋白質(zhì)為g1)或g2)所示的蛋白質(zhì)：g1)由genbank號(hào)為aac73958.1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；g2)由genbank號(hào)為aac73958.1所示的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代和/或缺失/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基得到的具有丙酮酸氧化酶活性的由g1)衍生的蛋白質(zhì)；所述巴豆甜菜堿還原酶基因編碼的蛋白質(zhì)為h1)或h2)所示的蛋白質(zhì)：h1)由genbank號(hào)為aac73150.1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；h2)由genbank號(hào)為aac73150.1所示的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代和/或缺失/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基得到的具有巴豆甜菜堿還原酶活性的由h1)衍生的蛋白質(zhì)；所述甜菜堿/肉堿輔酶a轉(zhuǎn)移酶基因編碼的蛋白質(zhì)為i1)或i2)所示的蛋白質(zhì)：i1)由genbank號(hào)為aac73149.1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；i2)由genbank號(hào)為aac73149.1所示的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代和/或缺失/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基得到的具有甜菜堿/肉堿輔酶a轉(zhuǎn)移酶活性的由i1)衍生的蛋白質(zhì)；所述輔酶a連接酶基因編碼的蛋白質(zhì)為j1)或j2)所示的蛋白質(zhì)：j1)由genbank號(hào)為aac73148.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；j2)由genbank號(hào)為aac73148.2所示的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代和/或缺失/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基得到的具有輔酶a連接酶活性的由j1)衍生的蛋白質(zhì)；所述巴豆甜菜堿coa水合酶基因編碼的蛋白質(zhì)為k1)或k2)所示的蛋白質(zhì)：k1)由genbank號(hào)為aac73147.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；k2)由genbank號(hào)為aac73147.2所示的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代和/或缺失/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基得到的具有巴豆甜菜堿coa水合酶活性的由k1)衍生的蛋白質(zhì)；所述肉堿消旋酶及肉堿脫水酶活性誘導(dǎo)基因編碼的蛋白質(zhì)為l1)或l2)所示的蛋白質(zhì)：l1)由genbank號(hào)為aac73146.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；l2)由genbank號(hào)為aac73146.2所示的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代和/或缺失/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基得到的具有肉堿消旋酶及肉堿脫水酶活性誘導(dǎo)活性的由l1)衍生的蛋白質(zhì)；所述fixabcx基因簇中的fixa基因編碼的蛋白質(zhì)為m1)或m2)所示的蛋白質(zhì)：m1)由genbank號(hào)為aac73146.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；m2)由genbank號(hào)為aac73146.2所示的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代和/或缺失/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基得到的具有fixa蛋白活性的由m1)衍生的蛋白質(zhì)；所述fixabcx基因簇中的fixb基因編碼的蛋白質(zhì)為n1)或n2)所示的蛋白質(zhì)：n1)由genbank號(hào)為aac73153.1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；n2)由genbank號(hào)為aac73153.1所示的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代和/或缺失/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基得到的具有fixb蛋白活性的由n1)衍生的蛋白質(zhì)；所述fixabcx基因簇中的fixc基因編碼的蛋白質(zhì)為p1)或p2)所示的蛋白質(zhì)：p1)由genbank號(hào)為aac73154.1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；p2)由genbank號(hào)為aac73154.1所示的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代和/或缺失/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基得到的具有fixc蛋白活性的由p1)衍生的蛋白質(zhì)；所述fixabcx基因簇中的fixx基因編碼的蛋白質(zhì)為q1)或q2)所示的蛋白質(zhì)：q1)由genbank號(hào)為acc73155.1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；q2)由genbank號(hào)為acc73155.1所示的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代和/或缺失/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基得到的具有fixx蛋白活性的由q1)衍生的蛋白質(zhì)。更進(jìn)一步的，被導(dǎo)入所述受體菌的所述γ-丁基甜菜堿羥化酶基因?yàn)閎11)-b13)中的任一種dna分子：b11)seqidno2的cnda分子或基因組dna；b12)在嚴(yán)格條件下與b11)限定的dna分子雜交且編碼所述γ-丁基甜菜堿羥化酶的cdna分子或基因組dna；b13)與b11)或b12)限定的dna分子具有90％以上的同一性且編碼所述γ-丁基甜菜堿羥化酶的cdna分子或基因組dna；被導(dǎo)入所述受體菌的所述肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因?yàn)閎31)-b33)中的任一種dna分子：b31)seqidno.4的cnda分子或基因組dna；b32)在嚴(yán)格條件下與b31)限定的dna分子雜交且編碼所述肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的cdna分子或基因組dna；b33)與b31)或b32)限定的dna分子具有90％以上的同一性且編碼所述肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的cdna分子或基因組dna；所述α-酮戊二酸脫氫酶基因?yàn)閏11)-c13)中的任一種dna分子：c11)大腸桿菌k12基因組序列第758706-761507位所示的cnda分子或基因組dna；c12)在嚴(yán)格條件下與c11)限定的dna分子雜交且編碼所述α-酮戊二酸脫氫酶的cdna分子或基因組dna；c13)與c11)或c12)限定的dna分子具有90％以上的同一性且編碼所述α-酮戊二酸脫氫酶的cdna分子或基因組dna；所述異檸檬酸裂合酶基因?yàn)閐11)-d13)中的任一種dna分子：d11)大腸桿菌k12基因組序列第4217109-4218413位所示的cnda分子或基因組dna；d12)在嚴(yán)格條件下與d11)限定的dna分子雜交且編碼所述異檸檬酸裂合酶的cdna分子或基因組dna；d13)與d11)或d12)限定的dna分子具有90％以上的同一性且編碼所述異檸檬酸裂合酶的cdna分子或基因組dna；所述乙酰輔酶a合成酶基因?yàn)閑11)-e13)中的任一種dna分子：e11)大腸桿菌k12基因組序列第4285413-4287371位所示的cnda分子或基因組dna；e12)在嚴(yán)格條件下與e11)限定的dna分子雜交且編碼所述乙酰輔酶a合成酶的cdna分子或基因組dna；e13)與e11)或e12)限定的dna分子具有90％以上的同一性且編碼所述乙酰輔酶a合成酶的cdna分子或基因組dna；所述丙酮酸氧化酶基因?yàn)間11)-g13)中的任一種dna分子：g11)大腸桿菌k12基因組序列第909331-911049位所示的cnda分子或基因組dna；g12)在嚴(yán)格條件下與g11)限定的dna分子雜交且編碼所述丙酮酸氧化酶的cdna分子或基因組dna；g13)與g11)或g12)限定的dna分子具有90％以上的同一性且編碼所述丙酮酸氧化酶的cdna分子或基因組dna；所述巴豆甜菜堿還原酶基因?yàn)閔11)-h13)中的任一種dna分子：h11)大腸桿菌k12基因組序列第39244-40386位所示的cnda分子或基因組dna；h12)在嚴(yán)格條件下與h11)限定的dna分子雜交且編碼所述巴豆甜菜堿還原酶的cdna分子或基因組dna；h13)與h11)或h12)限定的dna分子具有90％以上的同一性且編碼所述巴豆甜菜堿還原酶的cdna分子或基因組dna；所述甜菜堿/肉堿輔酶a轉(zhuǎn)移酶基因?yàn)閕11)-i13)中的任一種dna分子：i11)大腸桿菌k12基因組序列第37898-39115位所示的cnda分子或基因組dna；i12)在嚴(yán)格條件下與i11)限定的dna分子雜交且編碼所述甜菜堿/肉堿輔酶a轉(zhuǎn)移酶的cdna分子或基因組dna；i13)與i11)或i12)限定的dna分子具有90％以上的同一性且編碼所述甜菜堿/肉堿輔酶a轉(zhuǎn)移酶的cdna分子或基因組dna；所述輔酶a連接酶基因?yàn)閖11)-j13)中的任一種dna分子：j11)大腸桿菌k12基因組序列第36271-37824位所示的cnda分子或基因組dna；j12)在嚴(yán)格條件下與j11)限定的dna分子雜交且編碼所述輔酶a連接酶的cdna分子或基因組dna；j13)與j11)或j12)限定的dna分子具有90％以上的同一性且編碼所述輔酶a連接酶的cdna分子或基因組dna；所述巴豆甜菜堿coa水合酶基因?yàn)閗11)-k13)中的任一種dna分子：k11)大腸桿菌k12基因組序列第35377-36162位所示的cnda分子或基因組dna；k12)在嚴(yán)格條件下與k11)限定的dna分子雜交且編碼所述巴豆甜菜堿coa水合酶的cdna分子或基因組dna；k13)與k11)或k12)限定的dna分子具有90％以上的同一性且編碼所述巴豆甜菜堿coa水合酶的cdna分子或基因組dna；所述肉堿消旋酶及肉堿脫水酶活性誘導(dǎo)基因?yàn)閘11)-l13)中的任一種dna分子：l11)大腸桿菌k12基因組序列第34781-35371位所示的cnda分子或基因組dna；l12)在嚴(yán)格條件下與l11)限定的dna分子雜交且編碼肉堿消旋酶及肉堿脫水酶活性誘導(dǎo)蛋白的cdna分子或基因組dna；l13)與l11)或l12)限定的dna分子具有90％以上的同一性且編碼肉堿消旋酶及肉堿脫水酶活性誘導(dǎo)蛋白的cdna分子或基因組dna；所述fixabcx基因簇基因?yàn)閙11)-m13)中的任一種dna分子：m11)大腸桿菌k12基因組序列第42403-45750位所示的cnda分子或基因組dna；m12)在嚴(yán)格條件下與m11)限定的dna分子雜交且編碼fixabcx基因簇的cdna分子或基因組dna；m13)與m11)或m12)限定的dna分子具有90％以上的同一性且編碼fixabcx基因簇的cdna分子或基因組dna。上述嚴(yán)格條件是在2×ssc，0.1％sds的溶液中，在68℃下雜交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×ssc，0.1％sds的溶液中，在68℃下雜交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×sspe(或0.1×ssc)、0.1％sds的溶液中，65℃條件下雜交并洗膜。上述“同一性”指與天然核酸序列的序列相似性。包括與本發(fā)明的編碼上述蛋白質(zhì)的核苷酸序列具有90％或更高，或95％或更高，或96％或更高，或97％或更高，或98％或更高，或99％或更高同一性的核苷酸序列?！巴恍浴笨梢杂萌庋刍蛴?jì)算機(jī)軟件進(jìn)行評(píng)價(jià)。使用計(jì)算機(jī)軟件，兩個(gè)或多個(gè)序列之間的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用來(lái)評(píng)價(jià)相關(guān)序列之間的同一性。上述方法中，所述1)中，所述γ-丁基甜菜堿羥化酶基因和所述肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因是通過(guò)含有γ-丁基甜菜堿羥化酶基因和肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)盒的重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述受體菌中。所述γ-丁基甜菜堿羥化酶基因和肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)盒是指能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)γ-丁基甜菜堿羥化酶基因和肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的dna，該dna不但可包括啟動(dòng)γ-丁基甜菜堿羥化酶基因和肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，還可包括終止γ-丁基甜菜堿羥化酶基因和肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因轉(zhuǎn)錄的終止子。進(jìn)一步的，所述表達(dá)盒還可包括增強(qiáng)子序列。更進(jìn)一步的，啟動(dòng)所述γ-丁基甜菜堿羥化酶基因和肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子為pbad啟動(dòng)子。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述γ-丁基甜菜堿羥化酶基因和所述肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因是通過(guò)重組載體pyb1a-bbox-cait導(dǎo)入所述受體菌中。所述重組載體pyb1a-bbox-cait為將pyb1a載體的bglii和psti酶切位點(diǎn)間的片段替換為seqidno.2所示的γ-丁基甜菜堿羥化酶基因，且將psti和ecori位點(diǎn)間的片段替換為seqidno.4所示的肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白cait基因，且保持pyb1a載體的其他序列不變后得到的載體。所述2)中，所述γ-丁基甜菜堿羥化酶基因是通過(guò)含有γ-丁基甜菜堿羥化酶基因的表達(dá)盒的重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述受體菌中。所述γ-丁基甜菜堿羥化酶基因的表達(dá)盒是指能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)γ-丁基甜菜堿羥化酶基因的dna，該dna不但可包括啟動(dòng)γ-丁基甜菜堿羥化酶基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，還可包括終止γ-丁基甜菜堿羥化酶基因轉(zhuǎn)錄的終止子。進(jìn)一步的，所述表達(dá)盒還可包括增強(qiáng)子序列。更進(jìn)一步的，啟動(dòng)所述γ-丁基甜菜堿羥化酶基因和肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子為pbad啟動(dòng)子。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，所述γ-丁基甜菜堿羥化酶基因是通過(guò)重組載體pyb1a-bbox導(dǎo)入所述受體菌中；所述重組載體pyb1a-bbox為將pyb1a載體的bglii和psti酶切位點(diǎn)間的片段替換為seqidno.2所示的γ-丁基甜菜堿羥化酶基因，且保持pyb1a載體的其他序列不變后得到的載體。所述1)和所述2)中，所述pbad啟動(dòng)子的核苷酸序列同專(zhuān)利cn104805047中的核苷酸序列。上述方法中，所述野生型大腸桿菌為大腸桿菌k12。所述大腸桿菌突變體s1是將大腸桿菌k12的α-酮戊二酸脫氫酶基因(suca)替換為兩端帶有frt位點(diǎn)的卡那霉素抗性基因從而將大腸桿菌k12的α-酮戊二酸脫氫酶基因(suca)敲除(缺失)的大腸桿菌k12突變體。所述大腸桿菌突變體s2是將大腸桿菌突變體s1的異檸檬酸裂合酶基因(acea)替換為兩端帶有frt位點(diǎn)的卡那霉素抗性基因從而將大腸桿菌突變體s1的異檸檬酸裂合酶基因(acea)敲除(缺失)的大腸桿菌k12突變體。所述大腸桿菌突變體s3是將大腸桿菌突變體s1的丙酮酸氧化酶基因(poxb)替換為乙酰輔酶a合成酶基因(acs)和卡那霉素抗性基因得到的大腸桿菌k12突變體。所述大腸桿菌突變體s4是將s1△kan(刪除了卡那霉素抗性基因的大腸桿菌突變體s1)的巴豆甜菜堿還原酶基因(caia)、甜菜堿/肉堿輔酶a轉(zhuǎn)移酶基因(caib)、輔酶a連接酶基因(caic)、巴豆甜菜堿coa水合酶基因(caid)、肉堿消旋酶及肉堿脫水酶活性誘導(dǎo)基因(caie)構(gòu)成的基因簇整段替換為卡那霉素抗性基因得到的大腸桿菌k12突變體。所述大腸桿菌突變體s5是將大腸桿菌突變體s2的丙酮酸氧化酶基因(poxb)替換為乙酰輔酶a合成酶基因(acs)和卡那霉素抗性基因得到的大腸桿菌k12突變體。所述大腸桿菌突變體s6是將s1△kan的肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(cait)、巴豆甜菜堿還原酶基因(caia)、甜菜堿/肉堿輔酶a轉(zhuǎn)移酶基因(caib)、輔酶a連接酶基因(caic)、巴豆甜菜堿coa水合酶基因(caid)、肉堿消旋酶及肉堿脫水酶活性誘導(dǎo)基因(caie)以及上游的操縱子基因簇(fixabcx)整段替換為卡那霉素抗性基因得到的大腸桿菌k12突變體。所述大腸桿菌突變體s7是將大腸桿菌突變體s6的丙酮酸氧化酶基因(poxb)替換為乙酰輔酶a合成酶基因(acs)和卡那霉素抗性基因得到的大腸桿菌k12突變體。為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明又提供了上述方法制備的產(chǎn)左旋肉堿的重組菌。在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，產(chǎn)左旋肉堿的重組菌具體為將pyb1a-bbox-cait導(dǎo)入所述大腸桿菌突變體s1得到的重組菌s1/pyb1a-bbox-cait，pyb1a-bbox-cait導(dǎo)入所述大腸桿菌突變體s2得到的重組菌s2/pyb1a-bbox-cait，pyb1a-bbox-cait導(dǎo)入所述大腸桿菌突變體s3得到的重組菌s3/pyb1a-bbox-cait，pyb1a-bbox-cait導(dǎo)入所述大腸桿菌突變體s4得到的重組菌s4/pyb1a-bbox-cait，pyb1a-bbox-cait導(dǎo)入所述大腸桿菌突變體s5得到的重組菌s5/pyb1a-bbox-cait，pyb1a-bbox-cait導(dǎo)入所述大腸桿菌突變體s6得到的重組菌s6/pyb1a-bbox-cait，pyb1a-bbox-cait導(dǎo)入所述大腸桿菌突變體s7得到的重組菌s7/pyb1a-bbox-cait，pyb1a-bbox-cait導(dǎo)入所述大腸桿菌突變體s7得到的重組菌s7/pyb1a-bbox-cait，pyb1a-bbox導(dǎo)入野生型大腸桿菌k12得到的重組菌k12/pyb1a-bbox，pyb1a-bbox導(dǎo)入所述大腸桿菌突變體s1得到的重組菌s1/pyb1a-bbox，pyb1a-bbox-cait導(dǎo)入野生型大腸桿菌k12得到的重組菌k12/pyb1a-bbox-cait。上述方法制備的產(chǎn)左旋肉堿的重組菌在制備左旋肉堿中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明最后提供了一種制備左旋肉堿的方法。本發(fā)明提供的制備左旋肉堿的方法包括將上述產(chǎn)左旋肉堿的重組菌經(jīng)阿拉伯糖誘導(dǎo)培養(yǎng)得到誘導(dǎo)后重組菌，用所述誘導(dǎo)后重組菌催化γ-丁基甜菜堿得到左旋肉堿。上述制備左旋肉堿的方法中，所述阿拉伯糖誘導(dǎo)培養(yǎng)在阿拉伯糖濃度為0.2g/100ml的培養(yǎng)基中進(jìn)行，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的溫度可為20-37℃，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間可為10-30小時(shí)。進(jìn)一步的，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的溫度可為30-37℃(如30℃)，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間可為12-20小時(shí)(如16小時(shí))。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明所制備的左旋肉堿的重組菌的左旋肉堿的產(chǎn)量為30mm-50mm，具體如下：s1/pyb1a-bbox-cait的左旋肉堿產(chǎn)量為30.62mm，s2/pyb1a-bbox-cait的左旋肉堿產(chǎn)量為34.21mm，s3/pyb1a-bbox-cait的左旋肉堿產(chǎn)量為39.99mm，s4/pyb1a-bbox-cait的左旋肉堿產(chǎn)量為37.37mm，s5/pyb1a-bbox-cait的左旋肉堿產(chǎn)量為31.06mm，s6/pyb1a-bbox-cait的左旋肉堿產(chǎn)量為39.55mm，s7/pyb1a-bbox-cait的左旋肉堿產(chǎn)量為50.67mm。本發(fā)明在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了左旋肉堿的生產(chǎn)，并通過(guò)代謝工程改造，解決左旋肉堿合成中輔因子的供給與循環(huán)，從而提高了左旋肉堿的產(chǎn)量。附圖說(shuō)明圖1為pyb1a的物理圖譜。圖2為s4和s6的pcr驗(yàn)證。圖2a為s4的pcr驗(yàn)證。圖2b為s6的pcr驗(yàn)證。m：marker。圖3為工程菌中γ-丁基甜菜堿羥化酶蛋白表達(dá)和肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)的電泳檢測(cè)結(jié)果。m：蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：k12/pyb1a-bbox的破碎上清液；2：s1/pyb1a-bbox的破碎上清液；3：k12/pyb1a-bbox-cait的破碎上清液；4：s1/pyb1a-bbox-cait的破碎上清液；5：s2/pyb1a-bbox-cait的破碎上清液；6：s3/pyb1a-bbox-cait的破碎上清液；7：s4/pyb1a-bbox-cait的破碎上清液；8：s5/pyb1a-bbox-cait的破碎上清液；9：s6/pyb1a-bbox-cait的破碎上清液；10：s7/pyb1a-bbox-cait的破碎上清液。圖4為左旋肉堿標(biāo)準(zhǔn)品的hplc圖譜。圖5為s7/pyb1a-bbox-cait全細(xì)胞催化轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的hplc圖譜。具體實(shí)施方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買(mǎi)得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。下述實(shí)施例中大腸桿菌k12記載于文獻(xiàn)“babat,arat,hasegawam,takaiy,okumuray,babam,datsenkoka,tomitam,wannerbl,morih:constructionofescherichiacolik-12in-frame,single-geneknockoutmutants:thekeiocollection.molsystbiol2006,2:2006.0008.”中，是一株非病原菌，遺傳背景清楚，世代時(shí)間短，容易培養(yǎng)且培養(yǎng)基原料低廉。大腸桿菌k12的全基因組序列的genbankaccession為u00096.3(gi：545778205，updatedate是aug01，2014，version是3)。公眾可從中國(guó)科學(xué)院微生物研究所獲得，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實(shí)驗(yàn)所用，不可作為其它用途使用。下述實(shí)施例中的pyb1a載體的核苷酸序列如seqidno.5所示，載體圖譜如圖1所示，包括如下片段：(1)arac-arabad-mcs片段(含阿拉伯糖誘導(dǎo)啟動(dòng)子、多克隆位點(diǎn))；(2)p15a復(fù)制起始位點(diǎn)片段；(3)氨芐霉素抗性基因ampr片段。下述實(shí)施例中的大腸桿菌突變體的基因型如表1所示。其中，大腸桿菌突變體s1、s2、s3和s5均記載于專(zhuān)利cn104805047及文獻(xiàn)“baixuelin,keqiangfan,jianzhao,junjieji,linjunwu,keqianyang*,yongtao*.reconstitutionoftcacyclewithdaocstoengineere.coliintoanefficientwholecellcatalystofpenicilling.procnatlacadsciusa112(32):9855-9(2015).”中，公眾可從中國(guó)科學(xué)院微生物研究所獲得，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實(shí)驗(yàn)所用，不可作為其它用途使用。表1、大腸桿菌突變體的基因型菌株性狀s1△suca::kans2△suca△acea::kans3△suca△poxb::acs-kans4△suca△caiabcde::kans5△suca△poxb::acs△acea::kans6△suca△caitabcde△fixabcx::kans7△suca△poxb::acs△caitabcde△fixabcx::kan下述實(shí)施例中涉及的蛋白及基因序列如下：α-酮戊二酸脫氫酶基因(suca)序列如ecogene：eg10979所示(由2802個(gè)核苷酸組成)，α-酮戊二酸脫氫酶基因編碼的α-酮戊二酸脫氫酶的氨基酸序列的genbank：aac73820.1(由933個(gè)氨基酸組成)；異檸檬酸裂合酶基因(acea)序列如ecogene：eg10022(由1305個(gè)核苷酸組成)，異檸檬酸裂合酶基因編碼的異檸檬酸裂合酶的氨基酸序列的genbank：aac76985.1(由434個(gè)氨基酸組成)；乙酰輔酶a合成酶基因(acs)序列如ecogene：eg11448(由1959個(gè)核苷酸組成)，乙酰輔酶a合成酶基因編碼的乙酰輔酶a合成酶的氨基酸序列的genbank：aac77039.1(由652個(gè)氨基酸組成)；丙酮酸氧化酶基因(poxb)序列如ecogene：eg10754(由1719個(gè)核苷酸組成)，丙酮酸氧化酶基因編碼的丙酮酸氧化酶的氨基酸序列的genbank：aac73958.1(由572個(gè)氨基酸組成)；巴豆甜菜堿還原酶基因(caia)序列如ecogene：eg11560所示(由1143個(gè)核苷酸組成)，巴豆甜菜堿還原酶基因編碼的巴豆甜菜堿還原酶的氨基酸序列的genbank：aac73150.1(由380個(gè)氨基酸組成)。甜菜堿/肉堿輔酶a轉(zhuǎn)移酶基因(caib)序列如ecogene：eg11559所示(由1218個(gè)核苷酸組成)，甜菜堿/肉堿輔酶a轉(zhuǎn)移酶基因編碼的甜菜堿/肉堿輔酶a轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列的genbank：aac73149.1(由405個(gè)氨基酸組成)。輔酶a連接酶基因(caic)序列如ecogene：eg11558所示(由1554個(gè)核苷酸組成)，輔酶a連接酶基因編碼的輔酶a連接酶的氨基酸序列的genbank：aac73148.2(由517個(gè)氨基酸組成)。巴豆甜菜堿coa水合酶基因(caid)序列如ecogene：eg11557所示(由786個(gè)核苷酸組成)，巴豆甜菜堿coa水合酶基因編碼的巴豆甜菜堿coa水合酶的氨基酸序列的genbank：aac73147.2(由261個(gè)氨基酸組成)。肉堿消旋酶及肉堿脫水酶活性誘導(dǎo)基因(caie)序列如ecogene：eg12608所示(由591個(gè)核苷酸組成)，肉堿消旋酶及肉堿脫水酶活性誘導(dǎo)基因編碼的肉堿消旋酶及肉堿脫水酶活性誘導(dǎo)蛋白的氨基酸序列的genbank：aac73146.2(由196個(gè)氨基酸組成)。fixabcx基因簇基因序列如大腸桿菌k12基因組序列第42403-45750位所示(由3348個(gè)核苷酸組成)，fixabcx基因簇基因序列編碼的fixabcx基因簇的氨基酸序列的genbank分別為aac73152.2、aac73153.1、aac73154.1和aac73155.1(分別由256，313，428和95個(gè)氨基酸組成)。實(shí)施例1、構(gòu)建表達(dá)γ-丁基甜菜堿羥化酶的重組質(zhì)粒pyb1a-bbox構(gòu)建表達(dá)γ-丁基甜菜堿羥化酶的重組質(zhì)粒pyb1a-bbox。具體步驟如下：1、以合成的γ-丁基甜菜堿羥化酶基因(seqidno.2所示)為模板，采用引物對(duì)psvlb120-bbox-f(bglii)：agcctcgagggtagatctatgggtaacgcaattgctga和psvlb120-bbox-r(ecori)：cagaccgagctcaccgaattcttaacgttgcagcaccagga進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到γ-丁基甜菜堿羥化酶的編碼基因(bbox)。pcr條件如下：95℃，5min；95℃，30sec；55℃，30sec(30循環(huán))；72℃，1min；72℃，5min。通過(guò)1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，片段大小約1190bp，與目的片段相符。2、將步驟1獲得的bbox基因用bglii和ecori酶切，回收bbox基因片段。3、將pyb1a載體用bglii和ecori酶切后，回收載體大片段。4、將步驟2回收的bbox基因片段與步驟3回收的載體大片段用gibson方法(gibsondg,youngl,chuangry,venterjc,hutchisonca,3rd,smithho:enzymaticassemblyofdnamoleculesuptoseveralhundredkilobases.natmethods2009,6:343-345.)進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化t1感受態(tài)細(xì)胞(北京全式金生物，產(chǎn)品目錄號(hào)為cd501)，涂布于含氨芐霉素的lb固體平板上。37℃過(guò)夜，挑取單克隆提取質(zhì)粒，進(jìn)行pcr驗(yàn)證，正確的克隆送測(cè)序。將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒命名為重組載體pyb1a-bbox。重組載體pyb1a-bbox為將pyb1a載體的bglii和psti酶切位點(diǎn)間的片段替換為seqidno.2所示的γ-丁基甜菜堿羥化酶基因，且保持pyb1a載體的其他序列不變后得到的載體。seqidno.2(由1158個(gè)核苷酸組成)所示的γ-丁基甜菜堿羥化酶基因序列編碼seqidno.1(由385個(gè)氨基酸組成)所示的γ-丁基甜菜堿羥化酶。其中，啟動(dòng)γ-丁基甜菜堿羥化酶基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子為pbad啟動(dòng)子。實(shí)施例2、構(gòu)建表達(dá)γ-丁基甜菜堿羥化酶和肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的重組質(zhì)粒pyb1a-bbox-cait構(gòu)建表達(dá)γ-丁基甜菜堿羥化酶和肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的重組質(zhì)粒pyb1a-bbox-cait。具體步驟如下：1、以bw25113基因組為模板，采用引物對(duì)psvlb120-bbox-cait-f(ecori)：ctggtgctgcaacgttaagaattcaaggagatataatgaagaatgaaaagag和psvlb120-bbox-cait-r(psti)：ggctgccgcgcggcaccagctgcagttaatctttccagttctgtt進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白cait的編碼基因(cait)。pcr條件如下：95℃，5min；95℃，30sec；55℃，30sec(30循環(huán))；72℃，1min；72℃，5min。通過(guò)1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，片段大小約1500bp，與目的片段相符。2、將步驟1獲得的cait基因用ecori和psti酶切后，回收cait基因片段。3、將實(shí)施例1獲得的重組載體pyb1a-bbox用ecori和psti酶切后，回收pyb1a-bbox大片段。4、將步驟2回收的cait基因片段與步驟3回收的pyb1a-bbox大片段用gibson方法(gibsondg,youngl,chuangry,venterjc,hutchisonca,3rd,smithho:enzymaticassemblyofdnamoleculesuptoseveralhundredkilobases.natmethods2009,6:343-345.)進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化t1感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含氨芐霉素的lb固體平板上。37℃過(guò)夜，挑取單克隆提取質(zhì)粒，進(jìn)行驗(yàn)證，正確的克隆送測(cè)序。將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒命名為重組載體pyb1a-bbox-cait。重組載體pyb1a-bbox-cait為將pyb1a載體的bglii和psti酶切位點(diǎn)間的片段替換為seqidno.2所示的γ-丁基甜菜堿羥化酶基因，且將psti和ecori位點(diǎn)間的片段替換為seqidno.4所示的肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白cait基因，且保持pyb1a載體的其他序列不變后得到的載體。seqidno.2(由1158個(gè)核苷酸組成)所示的γ-丁基甜菜堿羥化酶基因序列編碼seqidno.1(由385個(gè)氨基酸組成)所示的γ-丁基甜菜堿羥化酶；seqidno.4(由1515個(gè)核苷酸組成)所示的肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白cait基因序列編碼seqidno.3(由504個(gè)氨基酸組成)所示的肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。重組載體pyb1a-bbox-cait表達(dá)γ-丁基甜菜堿羥化酶和肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的融合蛋白。其中，啟動(dòng)γ-丁基甜菜堿羥化酶基因和肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子為pbad啟動(dòng)子。實(shí)施例3、大腸桿菌突變體s1，s2，s3，s4，s5，s6，s7的構(gòu)建本實(shí)施例將大腸桿菌k12進(jìn)行不同的單基因敲除，構(gòu)建s1，s2，s3，s4，s5，s6，s7大腸桿菌突變體。一、大腸桿菌突變體s1，s2，s3，s5的構(gòu)建大腸桿菌突變體s1，s2，s3和s5分別為專(zhuān)利cn104805047中記載的大腸桿菌突變體pg01、pg16、pg03和pg05。具體構(gòu)建方法參見(jiàn)專(zhuān)利cn104805047中的具體步驟。大腸桿菌突變體s1是將大腸桿菌k12的α-酮戊二酸脫氫酶基因(suca)替換為兩端帶有frt位點(diǎn)的卡那霉素抗性基因從而將大腸桿菌k12的α-酮戊二酸脫氫酶基因(suca)敲除(缺失)得到的大腸桿菌k12突變體。s1△kan為刪除了卡那霉素抗性基因的大腸桿菌突變體s1。大腸桿菌突變體s2是將大腸桿菌突變體s1的異檸檬酸裂合酶基因(acea)替換為兩端帶有frt位點(diǎn)的卡那霉素抗性基因從而將大腸桿菌突變體s1的異檸檬酸裂合酶基因(acea)敲除(缺失)得到的大腸桿菌k12突變體。大腸桿菌突變體s3是將大腸桿菌突變體s1的丙酮酸氧化酶基因(poxb)替換為乙酰輔酶a合成酶基因(acs)和卡那霉素抗性基因得到的大腸桿菌k12突變體。所述大腸桿菌突變體s5是將大腸桿菌突變體s2的丙酮酸氧化酶基因(poxb)替換為乙酰輔酶a合成酶基因(acs)和卡那霉素抗性基因得到的大腸桿菌k12突變體。二、大腸桿菌突變體s4的構(gòu)建大腸桿菌突變體s4是將s1△kan(刪除了卡那霉素抗性基因的大腸桿菌突變體s1)的巴豆甜菜堿還原酶基因(caia)、甜菜堿/肉堿輔酶a轉(zhuǎn)移酶基因(caib)、輔酶a連接酶基因(caic)、巴豆甜菜堿coa水合酶基因(caid)、肉堿消旋酶及肉堿脫水酶活性誘導(dǎo)基因(caie)構(gòu)成的基因簇整段替換為卡那霉素抗性基因得到的大腸桿菌k12突變體。具體構(gòu)建方法如下：1、宿主菌的制備將大腸桿菌突變體s1中的卡那霉素抗性基因刪除，得到大腸桿菌突變體s1△kan(簡(jiǎn)稱(chēng)s1△kan)。具體刪除方法如下：首先，利用表達(dá)flp重組酶的質(zhì)粒pcp20(購(gòu)自clontech公司)化學(xué)轉(zhuǎn)化s1，將s1的frt位點(diǎn)之間的卡那霉素抗性基因刪除，敲除s1的卡那霉素抗性，得到大腸桿菌突變體s1△kan(簡(jiǎn)稱(chēng)s3△kan)。s1△kan在涂布卡那霉素抗性的lb平板(卡那霉素濃度為50μg/ml)上不生長(zhǎng)，表明已經(jīng)消除s1的卡那霉素抗性。將pkd46質(zhì)粒(購(gòu)自clontech公司)通過(guò)化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化消除了卡那霉素抗性的大腸桿菌突變體s1△kan(簡(jiǎn)稱(chēng)s1△kan)，得到含有質(zhì)粒pkd46的重組大腸桿菌pkd46/s1△kan。重組大腸桿菌pkd46/s1△kan在阿拉伯糖誘導(dǎo)后，表達(dá)λ噬菌體的重組蛋白，宿主菌就具有了同源重組的能力。2、s4的構(gòu)建以pkd13質(zhì)粒(購(gòu)自clontech公司)為模板，采用上游引物caiaup-red-f：agaactggaaagattaattaacccccaaaatatcaagaggttgaaagatgattccggggatccgtcgacc和下游引物caiedown-red-r：atccagcaaccaggtcgcatccggcaagatcaccgtttaggcgtcacagaagttcctatactttctagag進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到大小為1382bp的caiaup-kan-caiedown打靶片段。將獲得的caiaup-kan-caiedown片段電轉(zhuǎn)入步驟1獲得的重組大腸桿菌pkd46/s1△kan感受態(tài)細(xì)胞中，在含卡那霉素的lb平板上(卡那霉素濃度為50μg/ml)篩選陽(yáng)性克隆。采用caia-up567-f(tatgctatccagatgatcttcc)和caie-d326-r(cacagaaataagctgcgaagttaag)進(jìn)行pcr驗(yàn)證(引物結(jié)合位點(diǎn)分別是大腸桿菌caia基因的上游和caie基因的下游區(qū)域，陽(yáng)性克隆的擴(kuò)增產(chǎn)物大小為2300bp)，pcr鑒定結(jié)果如圖2a所示，正確的克隆送測(cè)序。將測(cè)序正確的克隆命名為大腸桿菌突變體s4，基因型為△suca△caiabcde-kan。測(cè)序結(jié)果表明：s4的基因組上沒(méi)有caiabcde片段。三、大腸桿菌突變體s6的構(gòu)建大腸桿菌突變體s6是將s1△kan(刪除了卡那霉素抗性基因的大腸桿菌突變體s1)的肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(cait)、巴豆甜菜堿還原酶基因(caia)、甜菜堿/肉堿輔酶a轉(zhuǎn)移酶基因(caib)、輔酶a連接酶基因(caic)、巴豆甜菜堿coa水合酶基因(caid)、肉堿消旋酶及肉堿脫水酶活性誘導(dǎo)基因(caie)以及上游的操縱子基因簇(fixabcx)整段替換為卡那霉素抗性基因得到的大腸桿菌k12突變體。具體構(gòu)建方法如下：1、宿主菌的制備將pkd46質(zhì)粒(購(gòu)自clontech公司)通過(guò)化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化消除了卡那霉素抗性的大腸桿菌突變體s1△kan(簡(jiǎn)稱(chēng)s1△kan)，得到含有質(zhì)粒pkd46的重組大腸桿菌pkd46/s1△kan。重組大腸桿菌pkd46/s1△kan在阿拉伯糖誘導(dǎo)后，表達(dá)λ噬菌體的重組蛋白，宿主菌就具有了同源重組的能力。2、s6的構(gòu)建以pkd13質(zhì)粒為模板，采用上游引物fixxdown-red-f(tcagtgcggcgttacgtatcaaaccaacatcagccgtaacggacctccacaattccggggatccgtcgacc)和下游引物caiedown-red-r(atccagcaaccaggtcgcatccggcaagatcaccgtttaggcgtcacagaagttcctatactttctagag)進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增得到大小為1383bp的fixxdown-kan-caiedown打靶片段。將獲得的fixxdown-kan-caiedown打靶片段電轉(zhuǎn)入步驟1獲得的重組大腸桿菌pkd46/s1△kan感受態(tài)細(xì)胞中，利用含卡那霉素的lb平板上(卡那霉素濃度為50μg/ml)，篩選陽(yáng)性克隆。采用fixx-d346-f(gatatcacgccgatggcgatg)和caie-d326-r(cacagaaataagctgcgaagttaag)進(jìn)行pcr驗(yàn)證(引物結(jié)合位點(diǎn)分別是大腸桿菌caie基因的下游和fixx基因的下游區(qū)域，陽(yáng)性克隆的擴(kuò)增產(chǎn)物大小為2100bp)，pcr鑒定結(jié)果如圖2b所示，正確的克隆送測(cè)序。將測(cè)序正確的克隆命名為大腸桿菌突變體s6，基因型為△suca△fixabcx△caitabcde-kan。測(cè)序結(jié)果表明：s6的基因組上沒(méi)有fixabcx-caitabcde片段。四、大腸桿菌突變體s7的構(gòu)建大腸桿菌突變體s7是將大腸桿菌突變體s6的丙酮酸氧化酶基因(poxb)替換為乙酰輔酶a合成酶基因(acs)和卡那霉素抗性基因得到的大腸桿菌k12突變體。具體構(gòu)建方法如下：1、宿主菌的制備按照步驟二的1中的方法將s3的frt位點(diǎn)之間的卡那霉素抗性基因刪除，得到大腸桿菌突變體s3△kan(簡(jiǎn)稱(chēng)s3△kan)。2、s7的構(gòu)建以pkd13質(zhì)粒為模板，采用上游引物fixxdown-red-f(tcagtgcggcgttacgtatcaaaccaacatcagccgtaacggacctccacaattccggggatccgtcgacc)和下游引物caiedown-red-r(atccagcaaccaggtcgcatccggcaagatcaccgtttaggcgtcacagaagttcctatactttctagag)進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增得到大小為1383bp的fixxdown-kan-caiedown打靶片段。將fixxdown-kan-caiedown打靶片段電轉(zhuǎn)入重組大腸桿菌pkd46/s3△kan感受態(tài)細(xì)胞中，利用含卡那霉素的lb平板上(卡那霉素濃度為50μg/ml)，篩選陽(yáng)性克隆。將測(cè)序正確的克隆命名為大腸桿菌突變體s7，基因型為△suca△poxb::acs△fixabcx△caitabcde-kan。測(cè)序結(jié)果表明：s7的基因組上沒(méi)有fixabcx-caitabcde片段。實(shí)施例4、基因工程菌的構(gòu)建將實(shí)施例1和實(shí)施例2中構(gòu)建的表達(dá)載體pyb1a-bbox或pyb1a-bbox-cait用化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化大腸桿菌k12及實(shí)施例3中構(gòu)建的大腸桿菌突變體s1，s2、s3、s4、s5、s6或s7，在含氨芐霉素的lb平板(氨芐霉素的濃度為50μg/ml)上篩選陽(yáng)性克隆。其中，將pyb1a-bbox轉(zhuǎn)化大腸桿菌k12得到的陽(yáng)性克隆菌株命名為k12/pyb1a-bbox；pyb1a-bbox轉(zhuǎn)化大腸桿菌突變體s1得到的陽(yáng)性克隆菌株命名為s1/pyb1a-bbox；pyb1a-bbox-cait轉(zhuǎn)化大腸桿菌k12得到的陽(yáng)性克隆菌株命名為k12/pyb1a-bbox-cait；pyb1a-bbox-cait轉(zhuǎn)化大腸桿菌突變體s1得到的陽(yáng)性克隆菌株命名為s1/pyb1a-bbox-cait；pyb1a-bbox-cait轉(zhuǎn)化大腸桿菌突變體s2得到的陽(yáng)性克隆菌株命名為s2/pyb1a-bbox-cait；pyb1a-bbox-cait轉(zhuǎn)化大腸桿菌突變體s3得到的陽(yáng)性克隆菌株命名為s3/pyb1a-bbox-cait；pyb1a-bbox-cait轉(zhuǎn)化大腸桿菌突變體s4得到的陽(yáng)性克隆菌株命名為s4/pyb1a-bbox-cait；pyb1a-bbox-cait轉(zhuǎn)化大腸桿菌突變體s5得到的陽(yáng)性克隆菌株命名為s5/pyb1a-bbox-cait；pyb1a-bbox-cait轉(zhuǎn)化大腸桿菌突變體s6得到的陽(yáng)性克隆菌株命名為s6/pyb1a-bbox-cait；pyb1a-bbox-cait轉(zhuǎn)化大腸桿菌突變體s7得到的陽(yáng)性克隆菌株命名為s7/pyb1a-bbox-cait。實(shí)施例5、工程菌的誘導(dǎo)培養(yǎng)及全細(xì)胞催化生成左旋肉堿一、工程菌的誘導(dǎo)培養(yǎng)以實(shí)施例4中構(gòu)建的10株菌中的任一株菌單獨(dú)為工程菌，均同時(shí)進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)：將工程菌劃線到含有質(zhì)量百分比濃度為1.6％的瓊脂和濃度為100μg/ml的氨芐霉素的lb平板上，37℃培養(yǎng)12小時(shí)，挑取平板上所長(zhǎng)的單克隆，接種到含有濃度為100μg/ml氨芐霉素的液體lb培養(yǎng)基中，37℃過(guò)夜震蕩培養(yǎng)8-10小時(shí)。轉(zhuǎn)速200轉(zhuǎn)/分鐘；將過(guò)夜培養(yǎng)物以體積百分比為2％的接種量接種至裝有150ml2yt培養(yǎng)基(蛋白胨16g/l，酵母膏：10g/l，氯化鈉5g/l，100μg/ml氨芐霉素)的容量為250ml擋板三角瓶中，37℃以200轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速震蕩生長(zhǎng)4小時(shí)后，加入阿拉伯糖(阿拉伯糖的濃度為0.2g/100ml)，30℃以200轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速誘導(dǎo)培養(yǎng)16小時(shí)，得到誘導(dǎo)后的細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，每次每種工程菌3瓶。離心收集到的菌體采用超聲波破碎，得到細(xì)胞破碎液，對(duì)細(xì)胞破碎液進(jìn)行離心分別取上清液進(jìn)行sds-page分析。結(jié)果如圖3所示。本發(fā)明構(gòu)建的如下7種工程菌：s1/pyb1a-bbox-cait、s2/pyb1a-bbox-cait、s3/pyb1a-bbox-cait、s4/pyb1a-bbox-cait、s5/pyb1a-bbox-cait、s6/pyb1a-bbox-cait和s7/pyb1a-bbox-cait均表達(dá)得到大小為43kda的γ-丁基甜菜堿羥化酶和56kda的肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。二、全細(xì)胞催化生成左旋肉堿及其產(chǎn)量檢測(cè)將步驟一獲得的誘導(dǎo)后的細(xì)胞，在8000轉(zhuǎn)/分鐘、4℃條件下離心10min，收集菌體；然后先用預(yù)冷的生理鹽水(0.85％氯化鈉水溶液)洗滌兩次，再用轉(zhuǎn)化底物液重懸，使其最終od600nm值為30。轉(zhuǎn)化底物液配方如下：100mmtris-hcl(調(diào)ph7.5)，50mmγ-丁基甜菜堿鹽酸鹽(調(diào)ph7.5)，1％葡萄糖，1mmfe2+，1mmvc。轉(zhuǎn)化條件為30℃條件下，1ml轉(zhuǎn)化底物液于50ml大試管中進(jìn)行全細(xì)胞催化6h。轉(zhuǎn)化反應(yīng)完成后，取反應(yīng)體系，檢測(cè)其中的左旋肉堿含量，具體步驟如下：(1)取反應(yīng)體系，常溫、12000rpm離心2min，收集上清液。(2)用蒸餾水稀釋上清液10倍，經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾得到上樣液。(3)取上樣液，采用高效液相色譜法hplc檢測(cè)左旋肉堿含量。色譜柱：agilentxdb-c18；流動(dòng)相：a液：10mm辛烷磺酸鈉，0.125％kh2po4，0.125％k2hpo4(磷酸調(diào)ph3.0)；b液：100％乙腈；a液：b液＝92:8(v:v)；流速：0.3ml/min；溫度：25℃；檢測(cè)器：dad；檢測(cè)波長(zhǎng)：210nm；進(jìn)樣量10ul；hplc系統(tǒng)：agilent1260。以左旋肉堿標(biāo)準(zhǔn)品(上海藍(lán)木化工有限公司，selleckchemicalsllcs2388)保留時(shí)間定性和采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法(外標(biāo)法)進(jìn)行定量分析。實(shí)驗(yàn)設(shè)置三次重復(fù)，結(jié)果取平均值。左旋肉堿標(biāo)準(zhǔn)品的hplc圖譜如圖4所示，從圖中可見(jiàn)，左旋肉堿標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間為20.4min。各菌株催化結(jié)果如表2所示，結(jié)果表明上述7株工程菌的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的hplc圖譜中均有保留時(shí)間為20.4min的左旋肉堿的峰。其中，s7/pyb1a-bbox-cait的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的hplc圖譜如圖5所示。結(jié)果表明：k12/pyb1a-bbox-cait的左旋肉堿產(chǎn)量為1.21mm。s1/pyb1a-bbox-cait的左旋肉堿產(chǎn)量為30.62mm，說(shuō)明敲除suca后，有利于提高左旋肉堿的產(chǎn)量；s2/pyb1a-bbox-cait的左旋肉堿產(chǎn)量為34.21mm，s3/pyb1a-bbox-cait的左旋肉堿的產(chǎn)量為39.99mm，s4/pyb1a-bbox-cait的左旋肉堿的產(chǎn)量為37.37mm，三個(gè)雙敲菌株轉(zhuǎn)化均高于單敲suca菌，說(shuō)明敲除suca和acea，敲除suca且將poxb替換為acs以及敲除suca和caiabcde基因簇，均有助于提高左旋肉堿的轉(zhuǎn)化。s5/pyb1a-bbox-cait的左旋肉堿產(chǎn)量為31.06mm，s6/pyb1a-bbox-cait的左旋肉堿產(chǎn)量為39.55mm，說(shuō)明在雙敲菌(suca和acea)基礎(chǔ)上進(jìn)一步敲除基因poxb替換為acs，或進(jìn)一步敲除基因簇fixabcx也有利于左旋肉堿的轉(zhuǎn)化。在s6基礎(chǔ)上進(jìn)一步敲除基因poxb替換為acs得到s7菌株，s7/pyb1a-bbox-cait的左旋肉堿的產(chǎn)量為50.67mm，底物100％被轉(zhuǎn)化，說(shuō)明組合△suca△poxb::acs△caitabcde△fixabcx性狀，對(duì)產(chǎn)左旋肉堿有利，可大大提高全細(xì)胞轉(zhuǎn)化的效率。表2、各個(gè)工程菌的左旋肉堿含量工程菌左旋肉堿產(chǎn)量(mm)左旋肉堿產(chǎn)量(g/l)k12/pyb1a-bbox0.1±0.020.016±0.003s1/pyb1a-bbox0.3±0.040.048±0.006k12/pyb1a-bbox-cait1.21±1.580.20±0.25s1/pyb1a-bbox-cait30.62±0.674.94±0.11s2/pyb1a-bbox-cait34.21±4.045.52±0.65s3/pyb1a-bbox-cait39.99±2.906.45±0.47s4/pyb1a-bbox-cait37.37±3.206.02±0.52s5/pyb1a-bbox-cait31.06±2.815.01±0.45s6/pyb1a-bbox-cait39.55±5.136.37±0.83s7/pyb1a-bbox-cait50.67±0.588.17±0.09序列表<110>中國(guó)科學(xué)院微生物研究所<120>產(chǎn)左旋肉堿的重組菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用<160>5<170>patentinversion3.5<210>1<211>385<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>1metglyasnalailealaasptyrargthrpheproleuileserpro151015leualaseralaalaserphealaglyglyvalservalthrtrpala202530aspglyargvalserprophehisasnleutrpleuargaspasncys354045procysglyaspcysvaltyrgluvalthrarggluglnvalpheleu505560valalaaspvalprogluaspileglnvalglnalavalthrilegly65707580glyaspglyargleuvalvalglntrpaspaspglyhisalaserala859095tyrhisproglytrpleuargalahisalatyraspalaglnserleu100105110alagluargglualaalaargprohislyshisargtrpmetglngly115120125leuserleuprovaltyrasphisglyalavalmetglnaspaspasp130135140thrleuleuglutrpleuleualavalargaspvalglyleuthrgln145150155160leuhisglyvalprothrgluproglyalaleuileproleualalys165170175argileserpheilearggluserasnpheglyvalleupheaspval180185190argserlysalaaspalaaspserasnalatyrthralapheasnleu195200205proleuhisthraspleuprothrarggluleuglnproglyleugln210215220pheleuhiscysleuvalasnaspalathrglyglyasnserthrphe225230235240valaspglyphealailealaglualaleuargileglualaproala245250255alatyrargleuleucysgluthrprovalglupheargasnlysasp260265270arghisserasptyrargcysthralaprovalilealaleuaspser275280285serglygluvalarggluileargleualaasnpheleuargalapro290295300pheglnmetaspalalysargmetproasptyrtyrleualatyrarg305310315320argpheileglnmetthrarggluproargphecysphethrargarg325330335leuglualaglyglnleutrpcyspheaspasnargargvalleuhis340345350alaargaspalapheaspproalaserglyasparghispheglngly355360365cystyrvalaspargaspgluleuleuserargileleuvalleugln370375380arg385<210>2<211>1158<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2atgggtaacgcaattgctgattatcgcacctttccgctgatctctccgctggcaagtgcg60gcctccttcgcaggcggtgtcagtgtgacgtgggcggatggtcgcgtttccccgtttcat120aacctgtggctgcgtgacaattgcccgtgtggcgattgcgtttacgaagtcacccgtgaa180caggtgttcctggttgcggacgtcccggaagatattcaggtgcaagccgttacgatcggc240ggtgatggtcgcctggtggttcagtgggatgacggtcatgcgtcagcctatcacccgggc300tggctgcgtgcacacgcttacgatgcccaatcgctggcagaacgtgaagcagctcgcccg360cataaacaccgctggatgcagggtctgagcctgccggtgtatgatcatggcgcagttatg420caagatgacgataccctgctggaatggctgctggcggtccgtgatgtgggtctgacccag480ctgcacggtgtgccgacggaaccgggcgccctgattccgctggcaaaacgtatttcattt540atccgcgaatcgaactttggcgttctgttcgatgtccgcagcaaagcggacgccgattct600aacgcctataccgcatttaatctgccgctgcataccgatctgccgacccgtgaactgcaa660ccgggtctgcaattcctgcactgcctggttaacgacgccaccggcggtaatagtacgttt720gtcgatggcttcgcaattgctgaagcactgcgtatcgaagcaccggcggcatatcgtctg780ctgtgcgaaaccccggttgaatttcgtaacaaagaccgccatagcgattaccgctgtacg840gctccggtcattgcgctggatagctctggtgaagtgcgtgaaatccgcctggctaatttt900ctgcgtgcgccgttccagatggacgctaaacgtatgccggattattacctggcatatcgt960cgctttattcagatgacccgtgaaccgcgcttttgcttcacgcgtcgcctggaagccggc1020caactgtggtgtttcgacaatcgtcgcgtgctgcatgctcgcgacgcgtttgatccggcg1080agcggtgatcgtcacttccagggctgttacgttgaccgtgatgaactgctgtctcgcatc1140ctggtgctgcaacgttaa1158<210>3<211>504<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>3metlysasnglulysarglysthrglyilegluprolysvalphephe151015proproleuileilevalglyileleucystrpleuthrvalargasp202530leuaspalaalaasnvalvalileasnalavalphesertyrvalthr354045asnvaltrpglytrpalapheglutrptyrmetvalvalmetleuphe505560glytrpphetrpleuvalpheglyprotyralalyslysargleugly65707580asngluproproglupheserthralasertrpilephemetmetphe859095alasercysthrseralaalavalleuphetrpglyserilegluile100105110tyrtyrtyrileserthrpropropheglyleugluproasnserthr115120125glyalalysgluleuglyleualatyrserleuphehistrpglypro130135140leuprotrpalathrtyrserpheleuservalalaphealatyrphe145150155160phephevalarglysmetgluvalileargproserserthrleuval165170175proleuvalglyglulyshisalalysglyleupheglythrileval180185190aspasnphetyrleuvalalaleuilephealametglythrserleu195200205glyleualathrproleuvalthrglucysmetglntrpleuphegly210215220ileprohisthrleuglnleuaspalaileileilethrcystrpile225230235240ileleuasnalailecysvalalacysglyleuglnlysglyvalarg245250255ilealaseraspvalargsertyrleuserpheleumetleuglytrp260265270valpheilevalserglyalaserpheilemetasntyrphethrasp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