1.本發(fā)明屬于桑葉多糖的技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及桑葉多糖在制備減肥藥物或減肥保健品中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

2.在幾乎所有年齡段和社會(huì)經(jīng)濟(jì)群體中肥胖率都在急劇上升，肥胖已逐漸成為全球性的健康問(wèn)題。根據(jù)最新統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，到2025年，全球男性肥胖癥的患病率將達(dá)到18％，女性將達(dá)到21％以上。大量的流行病學(xué)和臨床研究表明，血脂過(guò)多積累被認(rèn)為是代謝綜合征的因果因素，與血脂異常、葡萄糖耐受不良、胰島素抵抗和高血壓相關(guān)，它們也是心血管疾病、2型糖尿病和癌癥等的危險(xiǎn)因素。因此，預(yù)防或減少肥胖以獲得與健康相關(guān)的更好的生活質(zhì)量非常重要。
3.胰脂肪酶是脂質(zhì)吸收過(guò)程中的關(guān)鍵脂肪酶。在脂肪酶中，胰脂肪酶可水解50％
?
70％的總膳食脂肪，因此，通過(guò)抑制胰脂肪酶的表達(dá)/活性來(lái)抑制飲食脂肪的消化和吸收是預(yù)防和治療肥胖的有效方法。目前，奧利司他(orlistat)是唯一獲得fda批準(zhǔn)的非作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的肥胖癥治療藥，然而奧利司他具有某些令人不愉快的胃腸道副作用，限制了其患者的依從性，因此迫切需要探尋安全、有效的預(yù)防和治療肥胖的策略。
4.桑葉，在古代亞洲和現(xiàn)代世界中具有豐富的資源，是藥食同源的天然產(chǎn)品之一。桑葉通常用于治療糖尿病，高血壓和動(dòng)脈粥樣硬化，中藥本草籍著中還記錄了其抗衰老，預(yù)防肝腎損害和改善視力等的作用。這主要是由于其具有黃酮、生物堿、多糖、多酚等多種生物活性成分。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)桑葉治療糖尿病方面有較全面的研究，但尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)從桑葉中提取截留30
?
80kda桑葉多糖抑制胰脂肪酶，從而防治肥胖的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

5.本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種桑葉多糖在制備減肥藥物或減肥保健品中的應(yīng)用。
6.本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：
7.桑葉多糖在制備減肥藥物或減肥保健品中的應(yīng)用，所述桑葉多糖用下述方法制成：
8.1)將凍干桑葉粉碎；
9.2)按照料液比1:5～10的比例，加入體積濃度為60％～90％的乙醇水溶液，浸泡24～30h，抽濾；
10.3)重復(fù)步驟2)2～3次；固體干燥得到脫脂桑葉粉末；
11.4)按照料液比1:5～10的比例，將所述脫脂桑葉粉末分散于蒸餾水中，70℃～100℃冷凝回流2～3h，抽濾得到桑葉水提液；
12.5)將桑葉水提液濃縮至10％～15％，加入3～5倍體積的無(wú)水乙醇，攪拌均勻，于4℃靜置18～24h，離心，棄上清，凍干得到桑葉粗多糖；
13.6)將桑葉粗多糖通過(guò)sevage法脫蛋白3～5次，凍干；
14.7)將步驟6)獲得的凍干粉溶于水，超濾，得到截留30～80kda的桑葉多糖。
15.本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：
16.實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明提取獲得截留30
?
80kda的桑葉多糖具有強(qiáng)胰脂肪酶抑制活性。
17.實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明制備的桑葉多糖可抑制體內(nèi)胰腺相關(guān)消化酶表達(dá)水平，從而減少高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠的脂質(zhì)吸收，具有良好的減肥功效。
附圖說(shuō)明
18.圖1為不同分子量桑葉多糖(濃度為1～10mg/ml)對(duì)胰脂肪酶抑制率。
19.圖2為30～80kda桑葉多糖對(duì)胰脂肪酶(pl)、胰脂肪酶相關(guān)蛋白2(plrp2)和胰腺磷脂酶a2(pla2)的mrna和蛋白表達(dá)水平影響。
20.圖3為30
?
80kda桑葉多糖對(duì)脂質(zhì)代謝的影響。
具體實(shí)施方式
21.下面結(jié)合具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不限于此。
22.實(shí)施例1
23.桑葉多糖的制備，包括如下步驟：
24.1)將凍干桑葉粉碎；
25.2)按照料液比1:8的比例，加入體積濃度為75％的乙醇水溶液，浸泡28h，抽濾；
26.3)重復(fù)步驟2)2次；固體干燥得到脫脂桑葉粉末；
27.4)按照料液比1:8的比例，將脫脂桑葉粉末分散于蒸餾水中，90℃冷凝回流2.5h，抽濾得到桑葉水提液；
28.5)將桑葉水提液濃縮至13％，加入4倍體積的無(wú)水乙醇，攪拌均勻，于4℃靜置20h，離心，棄上清，凍干得到桑葉粗多糖；
29.6)將桑葉粗多糖通過(guò)sevage法脫蛋白4次，凍干；
30.7)將步驟6)獲得的凍干粉溶于水，超濾，截留不同分子量多糖，使成<30kda，30～80kda和>80kda三個(gè)不同分子量的桑葉多糖。
31.實(shí)施例2
32.桑葉多糖的制備，包括如下步驟：
33.1)將凍干桑葉粉碎；
34.2)按照料液比1:5的比例，加入體積濃度為90％的乙醇水溶液，浸泡24h，抽濾；
35.3)重復(fù)步驟2)2次；固體干燥得到脫脂桑葉粉末；
36.4)按照料液比1:5的比例，將所述脫脂桑葉粉末分散于蒸餾水中，70℃冷凝回流3h，抽濾得到桑葉水提液；
37.5)將桑葉水提液濃縮至10％，加入3倍體積的無(wú)水乙醇，攪拌均勻，于4℃靜置18h，離心，棄上清，凍干得到桑葉粗多糖；
38.6)將桑葉粗多糖通過(guò)sevage法脫蛋白3次，凍干；
39.7)將步驟6)獲得的凍干粉溶于水，超濾，得到截留30～80kda的桑葉多糖。
40.實(shí)施例3
41.桑葉多糖的制備，包括如下步驟：
42.1)將凍干桑葉粉碎；
43.2)按照料液比1:10的比例，加入體積濃度為60％的乙醇水溶液，浸泡30h，抽濾；
44.3)重復(fù)步驟2)3次；固體干燥得到脫脂桑葉粉末；
45.4)按照料液比1:10的比例，將所述脫脂桑葉粉末分散于蒸餾水中，100℃冷凝回流2h，抽濾得到桑葉水提液；
46.5)將桑葉水提液濃縮至15％，加入5倍體積的無(wú)水乙醇，攪拌均勻，于4℃靜置24h，離心，棄上清，凍干得到桑葉粗多糖；
47.6)將桑葉粗多糖通過(guò)sevage法脫蛋白5次，凍干；
48.7)將步驟6)獲得的凍干粉溶于水，超濾，得到截留30～80kda的桑葉多糖。
49.體外試驗(yàn)：
50.將實(shí)施例1獲得的三個(gè)不同分子量的桑葉多糖配成不同濃度的水溶液，見(jiàn)圖1，各取5ml，加入0.75mg/ml的胰脂肪酶水溶液1ml和花生油1ml；以不加桑葉多糖水溶液的反應(yīng)體系為空白。在37℃反應(yīng)1h，然后在沸水中放置10min終止反應(yīng)。以質(zhì)量濃度0.5％酚酞為指示劑(酚酞指示劑的溶劑為體積濃度95％的乙醇水溶液)，用0.05m naoh水溶液滴定至紅色為滴定終點(diǎn)。以胰脂肪酶抑制率(％)作為桑葉多糖活性的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。測(cè)試結(jié)果如圖1所示。實(shí)驗(yàn)證明，實(shí)施例2、實(shí)施例3制備的桑葉多糖對(duì)胰脂肪酶的抑制率與實(shí)施例1相似。
51.體內(nèi)試驗(yàn)方法如下：
52.以60只雄性c57小鼠為研究對(duì)象(4周齡，18～20g)，每10只為一組，分別為：
53.空白對(duì)照組(簡(jiǎn)稱nd組)
54.模型組(簡(jiǎn)稱hfd組)
55.陽(yáng)性藥奧利司他組(orlistat)
56.實(shí)施例1制備的截留30～80kda的桑葉多糖的低劑量組(200mg/kg/day，簡(jiǎn)稱mlp
?
200)
57.實(shí)施例1制備的截留30～80kda的桑葉多糖的中劑量組(400mg/kg/day，簡(jiǎn)稱mlp
?
400)
58.實(shí)施例1制備的截留30～80kda的桑葉多糖的高劑量組(800mg/kg/day，簡(jiǎn)稱mlp
?
800)
59.空白對(duì)照組用含10％脂質(zhì)的普通飼料(斯貝福)喂養(yǎng)；
60.模型組和各給藥組均用含60％脂質(zhì)的高脂飼料(華阜康，h10060)喂養(yǎng)。
61.將實(shí)施例1制備的截留30
?
80kda的桑葉多糖溶于生理鹽水配制樣品溶液，分別按200、400和800mg/kg/day的劑量灌胃給藥；
62.空白對(duì)照組給予相同體積的生理鹽水；
63.陽(yáng)性對(duì)照組，奧利司他加入相同體積的生理鹽水，按25mg/kg/day的劑量灌胃給藥。
64.8周后，收集小鼠的胰腺組織，通過(guò)檢測(cè)胰脂肪酶(pl)、胰脂肪酶相關(guān)蛋白2(plrp2)和胰腺磷脂酶a2(pla2)的mrna和蛋白表達(dá)水平，研究探索桑葉多糖對(duì)胰脂肪酶的影響，測(cè)試結(jié)果如圖2所示。收集新鮮肝臟和糞便樣品，檢測(cè)肝臟樣品總膽固醇(tc)、甘油三
酯(tg)、低密度脂蛋白膽固醇(ldl
?
c)和高密度脂蛋白膽固醇(hdl
?
c)的含量，檢測(cè)糞便樣品tc、tg的含量，進(jìn)而評(píng)估桑葉多糖對(duì)脂質(zhì)吸收的影響，測(cè)試結(jié)果如圖3所示。
65.由圖1可以看出，在10mg/ml的濃度下，分子量為30
?
80kda的桑葉多糖對(duì)胰脂肪酶活性的抑制率可高達(dá)72.50％。
66.由圖2可以看出，與普通飼料組相比，高脂飼料喂養(yǎng)顯著上調(diào)了包括pl，plrp2和pla2在內(nèi)的關(guān)鍵基因的mrna表達(dá)水平(圖2a
?
c)，以及pl和plrp2的蛋白質(zhì)表達(dá)水平(圖2d
?
g)。用桑葉多糖處理可降低pl，plrp2和pla2的表達(dá)水平。β
?
actin作為內(nèi)參。
67.注：與nd組比較，*p＜0.05；與hfd組，
#
p＜0.05。
68.由圖3可以看出，高脂飼料喂養(yǎng)的小鼠，肝臟中tc、tg、ldl
?
c的含量明顯上升，hdl
?
c水平明顯下降。給予桑葉多糖后，尤其是高劑量治療，小鼠肝臟中tc、tg、ldl
?
c的含量出現(xiàn)顯著下降趨勢(shì)，hdl
?
c水平上調(diào)(圖3a
?
d)。同時(shí)，高脂飼料喂養(yǎng)的小鼠，桑葉多糖治療組小鼠糞便中tc、tg含量明顯升高(圖3e
?
f)，表明桑葉多糖干擾了飲食脂質(zhì)的吸收，促進(jìn)了脂質(zhì)的排出。
69.注：與nd組比較，*p＜0.05；與hfd組，
#
p＜0.05，
##
p＜0.01。
70.綜上，本發(fā)明制備的桑葉多糖具有較強(qiáng)的胰脂肪酶抑制活性，并可降低高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠的胰消化酶表達(dá)水平，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，抑制脂質(zhì)吸收。為桑葉多糖的應(yīng)用提供了新的方向，也為開(kāi)發(fā)防治肥胖癥的藥物方案/飲食療法提供了新的來(lái)源。

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