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姜黃素與人參果提取物對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響與成骨不全模型的作用

來源：泰然健康網(wǎng) 時(shí)間：2024年12月07日 13:37

姜黃素與人參果提取物對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響與成骨不全模型的作用

【摘要】： 骨骼是一種代謝十分活躍的組織,一直處于骨形成和骨吸收的動(dòng)態(tài)平衡中。成骨細(xì)胞主導(dǎo)的骨形成和破骨細(xì)胞主導(dǎo)的骨吸收共同維持骨穩(wěn)態(tài),任何一方的失調(diào)均可導(dǎo)致骨骼疾病的發(fā)生,如骨質(zhì)疏松、腎性骨病、內(nèi)分泌骨病、成骨不全(Osteogenesis Imperfecta,OI)等。骨骼疾病可以引起骨痛、骨折、骨骼畸形等,嚴(yán)重影響患者的健康狀況和日常生活。調(diào)節(jié)骨穩(wěn)態(tài)的藥物主要有骨吸收抑制劑和骨形成促進(jìn)劑,其中骨吸收抑制劑居多。重組人甲狀旁腺激素是目前唯一上市的骨形成促進(jìn)劑,但因有致癌風(fēng)險(xiǎn),限制了其在臨床上的應(yīng)用。近年來,來源于中藥和水果等的天然提取物因具有來源廣、療效確切、不良反應(yīng)輕等優(yōu)勢(shì),在骨骼疾病中的應(yīng)用日益增多。因此,本研究選擇中藥制劑姜黃素和人參果(Solanum muricatum Ait,SM)提取物作為觀察對(duì)象,探討兩者對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)成骨分化的影響以及SM提取物在OI模型中的作用及可能機(jī)制。第一部分目的探討姜黃素與SM分別對(duì)脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞(Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells,a MSCs)與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrowmesenchymal stem cells,BMSCs)成骨分化的影響,并探討其機(jī)制是否與無翅基因相關(guān)整合位點(diǎn)(Wingless gene-related integration site,Wnt)/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)信號(hào)通路相關(guān)。方法1姜黃素對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)的a MSCs成骨分化及Wnt/β-catenin信號(hào)通路的影響采集人脂肪組織,分離a MSCs并用成骨分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化。采用流式細(xì)胞儀測(cè)定a MSCs的表面標(biāo)志物。用過氧化氫和姜黃素分別處理細(xì)胞,測(cè)定細(xì)胞活力、谷胱甘肽(Glutathione,GSH)水平、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)活性、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量、堿性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,ALP)活性、鈣含量,并進(jìn)行茜素紅硫酸鹽(Alizarin Red Sulfate,ARS)染色。采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)測(cè)定骨橋蛋白(Osteopontin,OPN)、1型膠原蛋白(Collagen1,Col 1)、骨保護(hù)素(Osteoprotegerin,OPG)和細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)m RNA表達(dá)。用Wnt抑制劑(Dickkopf1,DKK1)干預(yù)a MSCs后,測(cè)定細(xì)胞中β-catenin、Cyclin D1、糖原合酶激酶-3β(Glycogen Synthase Kinase-3β,GSK-3β)、p-GSK-3β和C-myc的蛋白表達(dá)。2 SM對(duì)BMSCs的分化及Wnt/β-catenin信號(hào)通路的影響采用植物化學(xué)方法制備SM提取物,并對(duì)SM提取物進(jìn)行鑒定。用成骨分化培養(yǎng)基和SM提取物處理BMSCs,通過測(cè)定細(xì)胞活力和乳酸脫氫酶(Lactate Dehydrogenase,LDH)釋放量評(píng)價(jià)SM提取物的細(xì)胞毒性。將BMSCs在成骨分化培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)12 d和20 d,然后分別行ALP和ARS染色。采用RT-PCR法和Western Blot法測(cè)定細(xì)胞中骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(Bone Morphogenetic Protein 4,BMP4)、成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子(Runt-related Transcription Factor 2,Runx2)、β-catenin、Cyclin D1 m RNA和蛋白表達(dá)。結(jié)果1姜黃素對(duì)a MSCs成骨分化的影響1.1獲得的a MSCs表面的CD29、CD44、CD105陽(yáng)性,CD34、CD45陰性。1.2與對(duì)照組比較,在0~2 mmol/L范圍內(nèi),過氧化氫劑量依賴性誘導(dǎo)a MSCs活力降低;50和100μmol/L的姜黃素引起a MSCs活力明顯降低。0~20μmol/L的姜黃素以劑量依賴性方式阻止過氧化氫誘導(dǎo)的a MSCs活力降低,而50和100μmol/L的姜黃素與過氧化氫協(xié)同降低a MSCs活力。1.3與對(duì)照組比較,0.2~2 mmol/L過氧化氫和50、100μmol/L姜黃素明顯降低a MSCs中的ALP活性和鈣含量,5~20μmol/L姜黃素明顯升高a MSCs中的ALP活性和鈣含量(P<0.05)。與過氧化氫組比較,過氧化氫+20μmol/L姜黃素組的ALP活性和鈣含量明顯增加(P<0.05)。1.4與對(duì)照組比較,0.2 mmol/L過氧化氫明顯誘導(dǎo)a MSCs中OPN、Col 1m RNA表達(dá)降低,誘導(dǎo)a MSCs中核因子κB受體活化因子配體(Receptor Activator of Nuclear Factor-κB Ligand,RANKL)m RNA表達(dá)升高(P<0.05);20μmol/L姜黃素明顯誘導(dǎo)a MSCs中OPN、Col 1 m RNA表達(dá)升高(P<0.05)。與過氧化氫組比較,過氧化氫+20μmol/L姜黃素組的OPN、Col 1 m RNA表達(dá)明顯降低,RANKL m RNA表達(dá)明顯升高(P<0.05)。1.5與對(duì)照組比較,0.2 mmol/L過氧化氫明顯誘導(dǎo)a MSCs中GSH水平和SOD活性降低,MDA含量增加(P<0.05);20μmol/L姜黃素明顯誘導(dǎo)a MSCs中GSH水平和SOD活性升高,MDA含量減少(P<0.05)。與過氧化氫組比較,過氧化氫+20μmol/L姜黃素組的GSH水平和SOD活性明顯升高,MDA含量明顯減少(P<0.05)。1.6與對(duì)照組比較,0.2 mmol/L過氧化氫明顯誘導(dǎo)a MSCs中β-catenin、C-myc和Cyclin D1蛋白表達(dá)明顯下調(diào),p-GSK-3β和GSK-3β蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05);20μmol/L姜黃素誘導(dǎo)a MSCs中β-catenin的蛋白表達(dá)明顯上調(diào),p-GSK-3β和GSK-3β的蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)。與過氧化氫組比較,過氧化氫+20μmol/L姜黃素組的β-catenin、C-myc和Cyclin D1蛋白表達(dá)明顯上調(diào),p-GSK-3β和GSK-3β蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)。1.7與對(duì)照組比較,Wnt3a和Wnt3a+姜黃素誘導(dǎo)a MSCs中β-catenin、C-myc和Cyclin D1蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05),p-GSK-3β和GSK-3β蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05),但兩組干預(yù)方式的作用無明顯區(qū)別(P>0.05);DKK1和DKK1+姜黃素組的β-catenin、C-myc和Cyclin D1蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05),p-GSK-3β的蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)。與DKK1組比較,DKK1+姜黃素組的C-myc和Cyclin D1蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)。1.8與過氧化氫組比較,過氧化氫+Wnt3a和過氧化氫+Wnt3a+姜黃素組的ALP活性和鈣含量明顯增加(P<0.05);與過氧化氫+姜黃素組比較,過氧化氫+姜黃素+DKK1組的ALP活性和鈣含量明顯降低(P<0.05)。2 SM提取物對(duì)BMSCs成骨分化的影響2.1 SM提取物中最主要的成分是總酚酸和總黃酮,含量分別為(1355.0±171.0)mg/100 g和(931.0±108.0)mg/100 g。2.2用50~500μg/m L的SM提取物處理BMSCs 1 d未引起細(xì)胞活力和LDH釋放量明顯變化,但用500μg/m L的SM提取物處理BMSCs 3 d和5 d,細(xì)胞活力明顯降低,LDH釋放量明顯增加(P<0.05)。2.3與對(duì)照組比較,100、250μg/m L SM提取物組的ARS和ALP陽(yáng)性染色率、礦化結(jié)節(jié)數(shù)量、ALP活性、OPN m RNA和Col 1 m RNA表達(dá)明顯增加(P<0.05)。2.4與對(duì)照組比較,100、250μg/m L SM提取物組的Runx2和BMP4 m RNA表達(dá)明顯增加,250μg/m L SM提取物組的β-catenin和Cyclin D1 m RNA表達(dá)增加(P<0.05)。2.5與對(duì)照組比較,SM提取物組的ALP活性、礦化結(jié)節(jié)數(shù)量明顯增加;與SM提取物組比較,SM提取物+DKK1組和SM提取物+noggin組的ALP活性和礦化結(jié)節(jié)數(shù)量明顯減少(P<0.05)。2.6與對(duì)照組比較,SM提取物組的Runx2、BMP4、β-catenin和Cyclin D1m RNA和蛋白表達(dá)明顯增加;與SM提取物組比較,SM提取物+DKK1組的β-catenin和Cyclin D1 m RNA表達(dá)和SM提取物+noggin組的Runx2、BMP4 m RNA表達(dá)明顯減少(P<0.05)。結(jié)論1低劑量姜黃素可通過抗氧化和激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路減輕過氧化氫誘導(dǎo)的a MSCs氧化應(yīng)激狀態(tài),從而促進(jìn)細(xì)胞成骨分化。2 SM提取物可通過激活Wnt和BMP信號(hào)通路促進(jìn)BMSCs成骨分化。第二部分目的探討SM提取物對(duì)OI小鼠骨質(zhì)的影響,并分析SM提取物對(duì)骨膠原蛋白的影響,以進(jìn)一步證實(shí)SM提取物的成骨分化特性。方法建立小鼠OI模型,利用微計(jì)算機(jī)斷層掃描(Micro Computed Tomography,micro CT)分析OI小鼠椎骨和股骨干骺端的骨量和微結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù),應(yīng)用拉曼光譜法檢測(cè)SM提取物處理后骨礦物質(zhì)和基質(zhì)組成的變化,用酶免疫測(cè)定法(Enzyme Immunoassay,EIA)檢測(cè)膠原合成標(biāo)志物Ⅰ型前膠原氨基端前肽(N-Terminal Propeptide of TypeⅠProcollagen,PINP)和膠原降解標(biāo)志物膠原蛋白羧基端肽(Collagen Carboxyl Terminal Peptide,CTX)。結(jié)果SM提取物能夠改善OI小鼠椎體和股骨的骨體積分?jǐn)?shù)(Bone Volume over Total Volume,BV/TV)、骨小梁數(shù)量(Trabecular Number,Tb N)、骨小梁厚度(Trabecular Thickness,Tb Th)、骨連接密度(Connectivity Density,Conn D)等骨小梁微結(jié)構(gòu)參數(shù)。SM提取物能夠改善OI小鼠礦物質(zhì)比蛋白質(zhì)(PO4/CH2)、礦物質(zhì)比膠原(PO4/amide I)、羥脯胺酸含量。SM提取物能夠上調(diào)PINP和下調(diào)CTX表達(dá)。結(jié)論SM提取物可以明顯改善OI小鼠的癥狀,其具有成為骨形成和骨重塑新藥的潛力。

【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019