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姜黃素與人參果提取物對間充質干細胞成骨分化的影響與成骨不全模型的作用

來源：泰然健康網時間：2024年12月07日 13:37

姜黃素與人參果提取物對間充質干細胞成骨分化的影響與成骨不全模型的作用

【摘要】： 骨骼是一種代謝十分活躍的組織,一直處于骨形成和骨吸收的動態(tài)平衡中。成骨細胞主導的骨形成和破骨細胞主導的骨吸收共同維持骨穩(wěn)態(tài),任何一方的失調均可導致骨骼疾病的發(fā)生,如骨質疏松、腎性骨病、內分泌骨病、成骨不全(Osteogenesis Imperfecta,OI)等。骨骼疾病可以引起骨痛、骨折、骨骼畸形等,嚴重影響患者的健康狀況和日常生活。調節(jié)骨穩(wěn)態(tài)的藥物主要有骨吸收抑制劑和骨形成促進劑,其中骨吸收抑制劑居多。重組人甲狀旁腺激素是目前唯一上市的骨形成促進劑,但因有致癌風險,限制了其在臨床上的應用。近年來,來源于中藥和水果等的天然提取物因具有來源廣、療效確切、不良反應輕等優(yōu)勢,在骨骼疾病中的應用日益增多。因此,本研究選擇中藥制劑姜黃素和人參果(Solanum muricatum Ait,SM)提取物作為觀察對象,探討兩者對間充質干細胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)成骨分化的影響以及SM提取物在OI模型中的作用及可能機制。第一部分目的探討姜黃素與SM分別對脂肪來源間充質干細胞(Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells,a MSCs)與骨髓間充質干細胞(bone marrowmesenchymal stem cells,BMSCs)成骨分化的影響,并探討其機制是否與無翅基因相關整合位點(Wingless gene-related integration site,Wnt)/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)信號通路相關。方法1姜黃素對過氧化氫誘導的a MSCs成骨分化及Wnt/β-catenin信號通路的影響采集人脂肪組織,分離a MSCs并用成骨分化培養(yǎng)基誘導分化。采用流式細胞儀測定a MSCs的表面標志物。用過氧化氫和姜黃素分別處理細胞,測定細胞活力、谷胱甘肽(Glutathione,GSH)水平、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)活性、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量、堿性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,ALP)活性、鈣含量,并進行茜素紅硫酸鹽(Alizarin Red Sulfate,ARS)染色。采用反轉錄聚合酶鏈反應(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)測定骨橋蛋白(Osteopontin,OPN)、1型膠原蛋白(Collagen1,Col 1)、骨保護素(Osteoprotegerin,OPG)和細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)m RNA表達。用Wnt抑制劑(Dickkopf1,DKK1)干預a MSCs后,測定細胞中β-catenin、Cyclin D1、糖原合酶激酶-3β(Glycogen Synthase Kinase-3β,GSK-3β)、p-GSK-3β和C-myc的蛋白表達。2 SM對BMSCs的分化及Wnt/β-catenin信號通路的影響采用植物化學方法制備SM提取物,并對SM提取物進行鑒定。用成骨分化培養(yǎng)基和SM提取物處理BMSCs,通過測定細胞活力和乳酸脫氫酶(Lactate Dehydrogenase,LDH)釋放量評價SM提取物的細胞毒性。將BMSCs在成骨分化培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)12 d和20 d,然后分別行ALP和ARS染色。采用RT-PCR法和Western Blot法測定細胞中骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(Bone Morphogenetic Protein 4,BMP4)、成骨特異性轉錄因子(Runt-related Transcription Factor 2,Runx2)、β-catenin、Cyclin D1 m RNA和蛋白表達。結果1姜黃素對a MSCs成骨分化的影響1.1獲得的a MSCs表面的CD29、CD44、CD105陽性,CD34、CD45陰性。1.2與對照組比較,在0~2 mmol/L范圍內,過氧化氫劑量依賴性誘導a MSCs活力降低;50和100μmol/L的姜黃素引起a MSCs活力明顯降低。0~20μmol/L的姜黃素以劑量依賴性方式阻止過氧化氫誘導的a MSCs活力降低,而50和100μmol/L的姜黃素與過氧化氫協(xié)同降低a MSCs活力。1.3與對照組比較,0.2~2 mmol/L過氧化氫和50、100μmol/L姜黃素明顯降低a MSCs中的ALP活性和鈣含量,5~20μmol/L姜黃素明顯升高a MSCs中的ALP活性和鈣含量(P<0.05)。與過氧化氫組比較,過氧化氫+20μmol/L姜黃素組的ALP活性和鈣含量明顯增加(P<0.05)。1.4與對照組比較,0.2 mmol/L過氧化氫明顯誘導a MSCs中OPN、Col 1m RNA表達降低,誘導a MSCs中核因子κB受體活化因子配體(Receptor Activator of Nuclear Factor-κB Ligand,RANKL)m RNA表達升高(P<0.05);20μmol/L姜黃素明顯誘導a MSCs中OPN、Col 1 m RNA表達升高(P<0.05)。與過氧化氫組比較,過氧化氫+20μmol/L姜黃素組的OPN、Col 1 m RNA表達明顯降低,RANKL m RNA表達明顯升高(P<0.05)。1.5與對照組比較,0.2 mmol/L過氧化氫明顯誘導a MSCs中GSH水平和SOD活性降低,MDA含量增加(P<0.05);20μmol/L姜黃素明顯誘導a MSCs中GSH水平和SOD活性升高,MDA含量減少(P<0.05)。與過氧化氫組比較,過氧化氫+20μmol/L姜黃素組的GSH水平和SOD活性明顯升高,MDA含量明顯減少(P<0.05)。1.6與對照組比較,0.2 mmol/L過氧化氫明顯誘導a MSCs中β-catenin、C-myc和Cyclin D1蛋白表達明顯下調,p-GSK-3β和GSK-3β蛋白表達明顯上調(P<0.05);20μmol/L姜黃素誘導a MSCs中β-catenin的蛋白表達明顯上調,p-GSK-3β和GSK-3β的蛋白表達明顯下調(P<0.05)。與過氧化氫組比較,過氧化氫+20μmol/L姜黃素組的β-catenin、C-myc和Cyclin D1蛋白表達明顯上調,p-GSK-3β和GSK-3β蛋白表達明顯下調(P<0.05)。1.7與對照組比較,Wnt3a和Wnt3a+姜黃素誘導a MSCs中β-catenin、C-myc和Cyclin D1蛋白表達明顯上調(P<0.05),p-GSK-3β和GSK-3β蛋白表達明顯下調(P<0.05),但兩組干預方式的作用無明顯區(qū)別(P>0.05);DKK1和DKK1+姜黃素組的β-catenin、C-myc和Cyclin D1蛋白表達明顯下調(P<0.05),p-GSK-3β的蛋白表達明顯上調(P<0.05)。與DKK1組比較,DKK1+姜黃素組的C-myc和Cyclin D1蛋白表達明顯上調(P<0.05)。1.8與過氧化氫組比較,過氧化氫+Wnt3a和過氧化氫+Wnt3a+姜黃素組的ALP活性和鈣含量明顯增加(P<0.05);與過氧化氫+姜黃素組比較,過氧化氫+姜黃素+DKK1組的ALP活性和鈣含量明顯降低(P<0.05)。2 SM提取物對BMSCs成骨分化的影響2.1 SM提取物中最主要的成分是總酚酸和總黃酮,含量分別為(1355.0±171.0)mg/100 g和(931.0±108.0)mg/100 g。2.2用50~500μg/m L的SM提取物處理BMSCs 1 d未引起細胞活力和LDH釋放量明顯變化,但用500μg/m L的SM提取物處理BMSCs 3 d和5 d,細胞活力明顯降低,LDH釋放量明顯增加(P<0.05)。2.3與對照組比較,100、250μg/m L SM提取物組的ARS和ALP陽性染色率、礦化結節(jié)數(shù)量、ALP活性、OPN m RNA和Col 1 m RNA表達明顯增加(P<0.05)。2.4與對照組比較,100、250μg/m L SM提取物組的Runx2和BMP4 m RNA表達明顯增加,250μg/m L SM提取物組的β-catenin和Cyclin D1 m RNA表達增加(P<0.05)。2.5與對照組比較,SM提取物組的ALP活性、礦化結節(jié)數(shù)量明顯增加;與SM提取物組比較,SM提取物+DKK1組和SM提取物+noggin組的ALP活性和礦化結節(jié)數(shù)量明顯減少(P<0.05)。2.6與對照組比較,SM提取物組的Runx2、BMP4、β-catenin和Cyclin D1m RNA和蛋白表達明顯增加;與SM提取物組比較,SM提取物+DKK1組的β-catenin和Cyclin D1 m RNA表達和SM提取物+noggin組的Runx2、BMP4 m RNA表達明顯減少(P<0.05)。結論1低劑量姜黃素可通過抗氧化和激活Wnt/β-catenin信號通路減輕過氧化氫誘導的a MSCs氧化應激狀態(tài),從而促進細胞成骨分化。2 SM提取物可通過激活Wnt和BMP信號通路促進BMSCs成骨分化。第二部分目的探討SM提取物對OI小鼠骨質的影響,并分析SM提取物對骨膠原蛋白的影響,以進一步證實SM提取物的成骨分化特性。方法建立小鼠OI模型,利用微計算機斷層掃描(Micro Computed Tomography,micro CT)分析OI小鼠椎骨和股骨干骺端的骨量和微結構數(shù)據(jù),應用拉曼光譜法檢測SM提取物處理后骨礦物質和基質組成的變化,用酶免疫測定法(Enzyme Immunoassay,EIA)檢測膠原合成標志物Ⅰ型前膠原氨基端前肽(N-Terminal Propeptide of TypeⅠProcollagen,PINP)和膠原降解標志物膠原蛋白羧基端肽(Collagen Carboxyl Terminal Peptide,CTX)。結果SM提取物能夠改善OI小鼠椎體和股骨的骨體積分數(shù)(Bone Volume over Total Volume,BV/TV)、骨小梁數(shù)量(Trabecular Number,Tb N)、骨小梁厚度(Trabecular Thickness,Tb Th)、骨連接密度(Connectivity Density,Conn D)等骨小梁微結構參數(shù)。SM提取物能夠改善OI小鼠礦物質比蛋白質(PO4/CH2)、礦物質比膠原(PO4/amide I)、羥脯胺酸含量。SM提取物能夠上調PINP和下調CTX表達。結論SM提取物可以明顯改善OI小鼠的癥狀,其具有成為骨形成和骨重塑新藥的潛力。

【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019