摘 要 為探究不同處理方法對茶葉提取液香氣成分的影響,分別采用超聲波和β-葡萄糖苷酶、纖維素酶、果膠酶輔助提取,結(jié)合GC-MS技術(shù)和感官評價對茶葉提取液進(jìn)行香氣特征和組分分析,利用氣味活度值(odor activity value,OAV) 結(jié)合主成分分析探討提取液中關(guān)鍵香氣物質(zhì)。GC-MS結(jié)果顯示,不同處理方法的茶葉提取液香氣成分組成和含量有一定差異,共鑒定出87種化合物,共有香氣物質(zhì)58種,其中醇類物質(zhì)最豐富,含量最高。OAV結(jié)果表明,β-紫羅蘭酮、香葉醇、芳樟醇是主要的關(guān)鍵香氣物質(zhì),以花香為主體香,反,反-2,4-癸二烯醛還賦予纖維素酶提取液濃郁的脂香。主成分分析發(fā)現(xiàn),因關(guān)鍵香氣物質(zhì)不同使得4種提取液香氣差異較大。感官評價表明,β-葡萄糖苷酶提取液的香氣濃郁且持久性好,協(xié)調(diào)度高,層次感豐富。香氣物質(zhì)組成和含量的不同造成香氣差異較大,以β-葡萄糖苷酶提取液的整體香氣最佳。

茶葉作為我國天然的特有飲品,營養(yǎng)價值豐富,深受各國消費(fèi)者喜愛,廣泛應(yīng)用于食品、藥品、保健品、個人護(hù)理品等領(lǐng)域[1]。香氣是決定茶葉品質(zhì)的重要因素,也是一種重要的活性成分,不僅具有較強(qiáng)的抗菌活性及廣譜抑菌作用[2-3],還有體外抗氧化、抗突變等作用[4-5]。此外,將茶葉香氣物質(zhì)用于卷煙加香,能起到提質(zhì)增香的效果[6-7]。水蒸氣蒸餾法是茶葉香氣較傳統(tǒng)的提取方法,設(shè)備簡單、操作簡便,但過高的提取溫度可能會造成香氣物質(zhì)的破壞,提取時間過長也可能導(dǎo)致香氣中摻雜有不愉悅的蒸煮味[8-9]。隨著工業(yè)技術(shù)的發(fā)展,超聲波技術(shù)和酶工程技術(shù)也開始被借鑒并應(yīng)用于茶葉香氣的輔助提取。超聲波具有空穴效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)及熱作用,能夠破壞植物的細(xì)胞壁,迅速釋放植物中的有效成分,大大縮短提取時間。夏濤等[10]在功率250 W、溫度60 ℃、時間40 min條件下浸提茶湯,結(jié)果表明超聲波浸提茶湯中香氣精油總量和香氣組分均高于常規(guī)浸提茶湯,香氣指數(shù)達(dá)到常規(guī)浸提法的1.8倍,且提高了茶葉中鍵合態(tài)糖苷類香氣前體的浸出量。酶能使植物材料降解形成疏散結(jié)構(gòu),且有研究表明茶葉中的香氣前體主要是糖苷類物種,包括單糖苷和二糖苷,因此茶葉提取過程中加酶可以增加茶湯香氣和風(fēng)味[11]。提取方法不同,茶中香氣成分檢出的種類與數(shù)量也會有所不同。而針對超聲波和生物酶輔助提取茶葉香氣的成分差異比較研究還未見報(bào)道,因此本文以茶葉為原料,分別采用超聲波和酶解輔助提取,通過感官評價比較不同茶葉提取液的香氣品質(zhì),采用GC-MS、氣味活度值(odor activity value,OAV)和主成分分析法對提取的茶香化學(xué)成分和特征進(jìn)行對比分析,為深入研究茶葉香氣物質(zhì)的提取和利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

茶葉由四川瀘州市茶葉公司提供;β-葡萄糖苷酶,河南百盛生物科技有限公司;纖維素酶,南寧龐博生物有限公司;果膠酶,河南萬邦實(shí)業(yè)有限公司。

YB-2500A粉碎機(jī),永康市速鋒工貿(mào)有限公司;AL204電子天平,上海梅特勒-托利多儀器有限公司;SB25-12DTDN超聲波清洗機(jī),寧波新芝生物科技股份有限公司;GCMS-QP2020氣質(zhì)聯(lián)用色譜儀,日本島津公司;SAAB-57330 USPME手動進(jìn)樣裝置,上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司;1 cm-50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭,美國Supelco公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 茶葉香氣物質(zhì)的提取

超聲波提取：茶葉粉碎過60目篩備用,稱取10.0 g茶葉粉末,置于250 mL錐形瓶中,以蒸餾水為溶劑,使其料液比為1∶8,于超聲溫度60 ℃、超聲功率360 W下超聲2 h進(jìn)行輔助浸提。

酶輔助提?。翰枞~粉碎過60目篩,分別稱取10.0 g茶葉粉末,置于250 mL錐形瓶中,以蒸餾水為溶劑,使其料液比為1∶8,分別用不同酶進(jìn)行酶解輔助浸提,酶添加量為1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)),酶解時間3 h。纖維素酶：酶解溫度55 ℃,酶解pH值4.5;β-葡萄糖苷酶：酶解溫度70 ℃,酶解pH值5.5;果膠酶：酶解溫度60 ℃,酶解pH值4.5。

1.2.2 提取液樣品GC-MS預(yù)處理

對不同方法提取得到的茶葉提取液樣品進(jìn)行預(yù)處理,吸取5 mL樣品于15 mL頂空瓶中,加入100 μL癸酸乙酯內(nèi)標(biāo)物(質(zhì)量濃度150 μg/L)和1 g NaCl,混合充分后,置于80 ℃恒溫加熱磁力攪拌器中平衡45 min,再將萃取頭插入頂空瓶吸附40 min,吸附完成后,快速取出萃取頭并立即插入GC進(jìn)樣口,熱解析3 min進(jìn)樣進(jìn)行GC-MS分析。

1.2.3 GC-MS條件

GC條件：HP-INNOWAX石英毛細(xì)管柱(60 m×0.25 mm,0.25 μm);進(jìn)樣口溫度250 ℃;載氣He,純度≥99.999%;流速為1.00 mL/min;不分流進(jìn)樣。升溫程序：初始柱溫50 ℃,保持5 min;以3 ℃/min的速度升至210 ℃,保持10 min;再以3 ℃/min的速度升至230 ℃,保持10 min。

MS條件：離子源EI,離子源溫度230 ℃,接口溫度250 ℃;掃描方式：Scan,掃描范圍：10～400 amu;溶劑延遲時間2 min;進(jìn)樣量2 μL。譜庫檢索：NIST14 s.lib譜庫。

1.2.4 香氣成分的OAV分析

采用OAV分析各香氣成分對提取液總體風(fēng)味的貢獻(xiàn)[12]。各香氣成分的OAV按公式(1)計(jì)算：

(1)

式中：Ci,茶葉提取液組分i的含量,μg/L;Ti,組分i在水中的香氣閾值,μg/L。

1.2.5 提取液香氣感官評價

由具有省級評茶資格的審評人員匿名審評提取液香氣。參考文獻(xiàn)[13-14]評價方式,從濃郁度、協(xié)調(diào)度、層次感、持久性4個方面進(jìn)行評價,評分從0～6(0：很差;1：差;2：較差;3：一般;4：好;5：很好;6：非常好)。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理分析

采用QP2010Ultra GC-MS 自帶數(shù)據(jù)庫(NIST 2014)及Wiley8.0檢索數(shù)據(jù)庫檢索,以質(zhì)譜匹配度≥90%作為鑒定依據(jù),通過計(jì)算保留指數(shù)(retention index,RI)與文獻(xiàn)報(bào)道對比進(jìn)行定性分析;不同提取方法得到的香氣成分采用內(nèi)標(biāo)法定量分析。采用Excel進(jìn)行香氣成分測定結(jié)果數(shù)據(jù)處理和OAV值計(jì)算,采用Graph Pad Prism 8和Origin Pro 2022繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同方法茶葉提取液的香氣物質(zhì)種類和含量

應(yīng)用超聲波和酶輔助提取茶葉香氣物質(zhì),并用GC-MS對提取液的香氣成分進(jìn)行分析鑒定。如圖1所示,4種提取方法所得茶液共鑒定出87種香氣物質(zhì),超聲波、纖維素酶輔助提取液均檢測出70種香氣成分,β-葡萄糖苷酶和果膠酶輔助提取分別檢測出73和74種香氣成分,但含量有所差異。

圖1 不同方法茶葉提取液香氣組分及含量熱圖
Fig.1 Heat map of aroma components and content of tea extracts by different methods

將鑒定出的香氣物質(zhì)進(jìn)行分類分析,由圖2-a可知,超聲波和酶輔助提取的香氣物質(zhì)種類基本相同,均以醇類數(shù)目最多,其次是酯類、酸類和醛類,但數(shù)量有所差異;不同酶處理的香氣物質(zhì)種類也不相同,組成有所差異。通過繪制韋恩圖(圖2-b)可見4種提取液之間的香氣物質(zhì)種類存在一定區(qū)別。4種提取液共有香氣物質(zhì)58種。超聲波提取液、β-葡萄糖苷酶提取液、纖維素酶提取液、果膠酶提取液分別有1種、4種、1種、5種香氣物質(zhì)。

a-香氣物質(zhì)數(shù)量;b-韋恩圖

圖2 不同方法提取液的香氣物質(zhì)數(shù)量和韋恩圖
Fig.2 Quantity and Venn plot of aroma substances and various compounds extracted by different methods

超聲波提取液和β-葡萄糖苷酶提取液共有2種香氣物質(zhì);超聲波提取液和纖維素酶提取液共有2種香氣物質(zhì);超聲波提取液和果膠酶提取液共有4種香氣物質(zhì);β-葡萄糖苷酶提取液和纖維素酶提取液共有1種香氣物質(zhì);纖維素酶提取液和果膠酶提取液共有1種香氣物質(zhì)。超聲波提取液、β-葡萄糖苷酶提取液、纖維素酶提取液共有月桂醇、苯甲酸葉醇酯2種香氣物質(zhì);超聲波提取液、β-葡萄糖苷酶提取液、果膠酶提取液共有順-α,α-5-三甲基-5-乙烯基四氫化呋喃-2-甲醇1種香氣物質(zhì);β-葡萄糖苷酶提取液、纖維素酶提取液、果膠酶提取液共有5種香氣物質(zhì)。

進(jìn)一步對4種方法得到的茶葉提取液香氣物質(zhì)的相對含量進(jìn)行分析,由圖3可知,不同提取液中香氣物質(zhì)各類化合物的含量也存在一定差異。醇類化合物在4種方法中含量占比均最高,占主導(dǎo)地位,與曹曉念等[15]的研究一致,其次,酸類、酯類、酚類化合物在幾種提取方法的香氣物質(zhì)中的總含量也較高。

圖3 不同方法提取液香氣物質(zhì)中各類化合物的含量
Fig.3 Content of various compounds of tea aroma substances extracted by different methods

2.2 不同方法茶葉提取液的各類香氣物質(zhì)分析

2.2.1 醇類成分分析

由圖2和圖3可知,醇類物質(zhì)是4種提取液中最豐富的香氣物質(zhì),共檢測到24種醇類物質(zhì),超聲波提取液、β-葡萄糖苷酶提取液、纖維素酶提取液、果膠酶提取液分別檢出21、20、19、22種。其中果膠酶提取液的醇類物質(zhì)含量最高,達(dá)到542.65 μg/L,β-葡萄糖苷酶提取液的醇類含量為412.52 μg/L,纖維素酶提取液的醇類含量最低,為334.71 μg/L。醇類物質(zhì)主要包括反式-芳樟醇氧化物(呋喃型)、芳樟醇、香葉醇、苯甲醇、苯乙醇等,在4種提取液中的含量均存在一定差異。研究表明芳樟醇及其氧化物、香葉醇、苯甲醇、苯乙醇、水楊酸甲酯等物質(zhì)是紅茶的特征性香氣物質(zhì)[16],在4種方法的提取液中均檢出,且含量均較豐富。其中香葉醇的含量在4種提取液中均為最高,占總醇含量的45%左右。不同提取方法的香葉醇含量總體趨勢為果膠酶>β-葡萄糖苷酶>纖維素酶>超聲波。

2.2.2 酸類成分分析

酸類物質(zhì)主要以香葉酸為主,總含量為127.00～253.91 μg/L。其他為辛酸、庚酸、壬酸等,多為長鏈酸,且含量較低,對風(fēng)味貢獻(xiàn)較小。4種提取液中果膠酶提取液的酸類物質(zhì)數(shù)量和含量均最大,且僅果膠酶提取液檢測出棕櫚酸。

2.2.3 酯類成分分析

酯類物質(zhì)在4種提取液中均較豐富,含量相對較高,為64.96～2 115.62 μg/L。超聲波提取液酯類物質(zhì)數(shù)量最多,但果膠酶提取液的含量最高。酯類物質(zhì)主要包括水楊酸甲酯、亞油酸乙酯、棕櫚酸乙酯、棕櫚酸甲酯等,但除水楊酸甲酯外,酯類主要為長鏈酯,閾值高且含量低,對提取液風(fēng)味貢獻(xiàn)較小[16]。

2.2.4 醛類成分分析

由圖2和圖3可知,4種提取液中的醛類物質(zhì)較少,含量較低,為19.66～38.06 μg/L,但醛類物質(zhì)因其較低的閾值而對風(fēng)味具有較大的貢獻(xiàn)[17]。主要包括壬醛、苯甲醛、苯乙醛、香橙醛、可卡醛等。此外,反,反-2,4-癸二烯醛僅在纖維素酶提取液檢測出,該物質(zhì)的香氣閾值較低,對提取液香氣具有一定貢獻(xiàn)作用。

2.2.5 酮類成分分析

酮類物質(zhì)在4種提取液中種類較少,主要包括大馬士酮、苯乙酮、香葉基丙酮、β-紫羅蘭酮、植酮等。這些酮類物質(zhì)含量較低,但多數(shù)酮類物質(zhì)的香氣閾值較低,對提取液風(fēng)味也有一定貢獻(xiàn)作用。其中香葉基丙酮在超聲波提取液中未檢出,2-戊基癸酮僅在纖維素酶提取液和果膠酶提取液中檢出。

2.2.6 其他成分分析

烴類物質(zhì)主要為月桂烯、右旋檸檬烯、β-羅勒烯、羅勒烯異構(gòu)體混合物等,含量較低。雜環(huán)類物質(zhì)主要為茶吡咯、2,3-二氫苯并呋喃,含量低。酚類僅檢測出2,4-二叔丁基苯酚,含量各不相同。其他類為甲氧基苯肟,含量為20.48～48.63 μg/L。

2.3 不同方法茶葉提取液的香氣成分OAV分析

在茶葉眾多的香氣成分中,僅有一部分起主導(dǎo)作用,它們之間相互作用構(gòu)成了茶的香氣特征[18]。此外,不同化合物的香氣閾值不同,因此香氣成分含量不能說明茶葉的特征香氣。王奕等[19]采用OAV評價香氣化合物對茶葉主體香氣成分的貢獻(xiàn),認(rèn)為OAV>1的香味化合物對茶葉香氣有貢獻(xiàn)作用,OAV>10的香氣化合物則可能對茶葉香氣有顯著影響。因此,為進(jìn)一步確定不同方法提取液的關(guān)鍵香氣成分,通過查閱書籍及相關(guān)文獻(xiàn)中已報(bào)道的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的香味閾值,計(jì)算各成分的OAV,利用OAV評價單個香氣成分對茶葉提取液整體香氣的貢獻(xiàn)度。

由表1可知,所有茶葉提取液中OAV>1的香氣成分有9種,其中β-紫羅蘭酮、芳樟醇、香葉醇是4種提取液共有的主要關(guān)鍵香氣成分(OAV>10),可賦予紫羅蘭香、鈴蘭香和玫瑰花香等花香,β-紫羅蘭酮的OAV為574.28～915.71,是OAV最高的香氣物質(zhì),對提取液香氣貢獻(xiàn)最大。反,反-2,4-癸二烯醛具有脂香味、炸土豆味,是纖維素酶提取液獨(dú)有的關(guān)鍵香氣成分,使得纖維素酶提取液的香氣特征與其他3種以花香為主的提取液香氣特征具有一定差異。己酸乙酯、雪松醇、苯乙醛是4種提取液共有的對香氣貢獻(xiàn)較大的香氣成分,可賦予果香、酒香、沉香、木香等香氣,果膠酶提取液中OAV>1的香氣物質(zhì)還有水楊酸甲酯和月桂烯,賦予果膠酶提取液更豐富的香氣類型。

表1 不同方法提取液的香氣物質(zhì)OAV及氣味描述
Table 1 OAV and aroma description of the aromatic substances extracted by different methods

序號化合物名稱閾值[17,20-22]/(μg/L)OAV超聲波β-葡萄糖苷酶纖維素酶果膠酶氣味描述[19,23-24]1β-紫羅蘭酮0.007574.28805.71662.86915.71紫羅蘭香2芳樟醇1.521.9327.4524.7739.73鈴蘭香3香葉醇7.519.8324.9920.3231.65甜香、玫瑰花香4反,反-2,4-癸二烯醛0.07——21.43—脂香味、炸土豆味5己酸乙酯0.53.441.222.184.72果香、酒香6雪松醇0.52.643.823.163.22木香、沉香7苯乙醛42.382.231.332.56青香、玫瑰、花香、巧克力8水楊酸甲酯400.750.990.801.45冬青油香9月桂烯130.640.760.671.10木香、脂香

注：“—”未檢出該物質(zhì)而未做計(jì)算;僅列出OAV>1的香氣化合物。

2.4 不同方法茶葉提取液的香氣成分主成分分析

對表1中對提取液整體風(fēng)味輪廓有重要影響的香氣物質(zhì)(OAV>1)進(jìn)行主成分分析,結(jié)果如圖4所示。PC1中載荷正向最高的物質(zhì)為香葉醇,載荷負(fù)向最高的物質(zhì)為反,反-2,4-癸二烯醛;PC2中載荷正向最高的物質(zhì)為雪松醇,載荷負(fù)向最高的物質(zhì)為己酸乙酯。說明香葉醇、反,反-2,4-癸二烯醛、雪松醇和己酸乙酯是不同方法提取液中含量變化最明顯的揮發(fā)性物質(zhì),可以根據(jù)這些物質(zhì)區(qū)分不同方法提取液。主成分分析是可直觀地反映樣本成分構(gòu)成的近似度的統(tǒng)計(jì)方法,樣本間的相似度越高則距離越近[18]。4種處理方法的提取液在得分圖上距離較遠(yuǎn),說明香氣差異較大。其中,表征β-葡萄糖苷酶提取液的關(guān)鍵性香氣物質(zhì)是β-紫羅蘭酮、芳樟醇和香葉醇,具有貢獻(xiàn)作用的是雪松醇、月桂烯和水楊酸甲酯;表征纖維素酶提取液的關(guān)鍵性香氣物質(zhì)是反,反-2,4-癸二烯醛;表征果膠酶提取液具有貢獻(xiàn)作用的是苯乙醛和己酸乙酯。

圖4 不同方法提取液香氣物質(zhì)的主成分雙圖
Fig.4 Principal component analysis biplot of aromatic substances extracted by different methods

2.5 不同方法提取的茶液香氣感官評價比較

對4種提取液進(jìn)行香氣感官評價,由表2可知,4種提取液的香氣特征不完全相同,但均帶有花果香,與OAV分析結(jié)果相似。從不同評價因子來看,果膠酶提取液的濃郁度得分顯著低于其他3種提取液(P<0.05),但它的協(xié)調(diào)度最佳;層次感以β-葡萄糖苷酶提取液和纖維素酶提取液的香氣最好;而4種提取液的香氣持久性沒有顯著性差異。綜合評分顯示,β-葡萄糖苷酶提取液得分顯著高于其他提取液得分(P<0.05),品質(zhì)最優(yōu),其次是纖維素酶提取液和超聲波提取液,果膠酶提取液的得分最低。茶葉香氣類型豐富,香氣物質(zhì)的種類、種數(shù)、含量的微小變化都會對茶葉的香氣產(chǎn)生重要影響[25]。本研究的GC-MS和OAV分析也證實(shí)4種提取液的香氣成分組成和含量存在一定差異,關(guān)鍵性香氣物質(zhì)和具有貢獻(xiàn)作用的香氣物質(zhì)也不完全相同。

表2 不同方法提取液的香氣感官評價
Table 2 Sensory evaluation of tea liquor extracted by different methods

提取方法濃郁度(0～6分)協(xié)調(diào)度(0～6分)層次感(0～6分)持久(0～6分)總分(0～24分)香氣特征描述超聲波4.6±0.5a4.6±0.5b5.0±0ab5.4±0.5a19.6±0.7bc花香、木質(zhì)香、焦糖香、烘焙香β-葡萄糖苷酶5.2±0.4a5.0±0ab5.4±0.5a5.4±0.5a21.0±0.3a花香、果香、發(fā)酵香、焦甜香、烘焙香纖維素酶5.2±0.7a4.8±0.4ab5.4±0.5a5.0±0.6a20.4±0.4b花香、木質(zhì)香、果香、甜香、脂香果膠酶3.8±0.4b5.2±0.4a4.6±0.5b5.0±0a18.6±1.5c花香、果香、發(fā)酵香

注：同一肩列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

3 結(jié)論

對超聲波和酶解輔助提取茶葉香氣進(jìn)行GC-MS分析表明,4種方法提取的香氣物質(zhì)種類基本相同,主要包括醇類、酸類、酯類、醛類、酮類等9類87個化合物,但香氣物質(zhì)的組成及相對含量存在較大的差異。OAV分析表明不同方法提取液中具有貢獻(xiàn)作用的香氣成分(OAV>1)有己酸乙酯、雪松醇、苯乙醛、水楊酸甲酯、月桂烯等,其中主要的關(guān)鍵香氣成分(OAV>10)為β-紫羅蘭酮、香葉醇、芳樟醇、反,反-2,4-癸二烯醛。主成分分析表明,因各提取液香氣表征物質(zhì)不同,不同方法的茶葉提取液香氣差異較大。香氣感官評價發(fā)現(xiàn)4種提取液的持久性沒有顯著差異,但β-葡萄糖苷酶提取液和纖維素酶提取液的層次感最豐富,果膠酶提取液的協(xié)調(diào)度最佳,但濃郁度最差,綜合得分表明β-葡萄糖苷酶提取液的整體香氣最佳。本研究結(jié)果可為茶葉香氣物質(zhì)的提取和利用提供理論依據(jù)。

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