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基于體外腸道微生物消化預(yù)測不同工藝大葉茶的健康作用

來源：泰然健康網(wǎng) 時間：2024年12月07日 00:52

1(中茶科技(北京)有限公司,北京,102209)2(中糧營養(yǎng)健康研究院有限公司,北京,102209)3(河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院,河南鄭州,450001)4(浙江工商大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,浙江杭州,310018)5(營養(yǎng)健康與食品安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京,102209)6(云南中茶茶業(yè)有限公司,云南昆明,650200)7(云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所,云南昆明,650214)8(中國茶葉股份有限公司,北京,100020)9(南京財經(jīng)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇南京,210023)

摘要大葉茶是我國重要的茶樹品種,茶葉成分組成的差異影響腸道微生態(tài)、糖脂代謝等。該研究比較了經(jīng)不同工藝制備而成的大葉種白茶、普洱生茶、普洱熟茶及酸茶對不同人群腸道微生態(tài)的影響。利用正常及腸桿菌型便秘人群的糞便樣本構(gòu)建體外腸道微生物消化模型,與茶湯共培養(yǎng)1 d后,測定發(fā)酵液的微生物組成及短鏈脂肪酸含量,并進(jìn)行PICRUSt2代謝通路預(yù)測。在2種模型中,大葉茶均降低厚壁菌門/擬桿菌門比值,促進(jìn)瘤胃球菌、毛螺菌、真細(xì)菌、丁酸球菌等產(chǎn)丁酸菌、嗜黏蛋白阿克曼菌豐度增加,抑制鏈球菌、葡萄球菌等致病菌,提高短鏈脂肪酸含量。在普通模型中,消化、能量及脂質(zhì)代謝、外源化合物生物降解、腸道炎癥保護(hù)等代謝途徑被顯著干預(yù),而在便秘模型中,僅心血管健康和循環(huán)系統(tǒng)相關(guān)的2條代謝途徑被普洱熟茶顯著干預(yù)。與其他大葉茶相比,普洱熟茶組較為顯著地提高了腸道菌群多樣性,酸茶最為顯著地增加了便秘模型的短鏈脂肪酸含量。

腸道菌群是寄居在人體腸道內(nèi)的大量微生物構(gòu)成的群落,在正常情況下可以和宿主及外部環(huán)境建立起動態(tài)的生態(tài)平衡。腸道菌群有助于消化食物成分、合成必需維生素、支持腸道功能,并通過小分子的代謝物(如短鏈脂肪酸、膽汁酸、氨基酸等)與宿主進(jìn)行密切的相互作用,影響人體健康狀態(tài)[1-2]。因此,維持腸道菌群的平衡對保持人體健康具有重要意義。腸道菌群紊亂會破壞腸道屏障功能,導(dǎo)致炎癥、免疫功能下降,從而增加糖脂代謝異常、腸炎、便秘等疾病風(fēng)險。食物中的營養(yǎng)功能成分與腸道菌群相互作用,可以改善其豐度及組成比例,從而干預(yù)腸道微生態(tài)[3]。因此,通過健康飲食干預(yù)調(diào)節(jié)腸道菌群,被認(rèn)為是促進(jìn)糖脂代謝健康及腸道健康的重要舉措[4]。

茶是我國歷史悠久的日常飲品,含有人體必需的礦物質(zhì)和各種維生素,并具有提神醒腦、消食解膩的健康作用[5]。研究表明,茶的功能成分與腸道菌群的相互作用對人體健康有益[6-7]。通常大葉種茶的內(nèi)含物質(zhì)較小葉種茶更為豐富。以大葉茶為原料,經(jīng)過不同加工工藝可以制備綠茶、白茶、普洱生茶、普洱熟茶、酸茶等茶葉。其中,白茶在自然萎凋過程中經(jīng)內(nèi)源性多酚氧化酶輕度發(fā)酵;普洱生茶利用曬青毛茶壓餅,在存儲過程中自然轉(zhuǎn)化,以含有20%的兒茶素、0.1%茶黃素,2.5%的茶褐素為特征;普洱熟茶經(jīng)人工渥堆發(fā)酵而成,在黑曲霉等環(huán)境微生物作用下較為充分地轉(zhuǎn)化,以形成約10%茶褐素、1.5%茶多糖等大分子物質(zhì),兒茶素含量低于0.5%為特征[8]。酸茶主要由乳酸菌厭氧發(fā)酵制成,羧酸、芳香酸、有機(jī)酸、茶多酚含量在發(fā)酵過程中顯著增加[9]。由于加工工藝的差別,導(dǎo)致不同茶所含的茶多酚、茶褐素、有機(jī)酸等物質(zhì)存在含量差異,可能影響其功能特點(diǎn)。

體外微生物消化模型能夠在模擬生理?xiàng)l件下培養(yǎng)來自人體糞便樣品的腸道微生物群,進(jìn)而模擬人體腸道菌群的生長和代謝,適用于研究人體腸道微生態(tài)和微生物消化[10]。體外發(fā)酵有助于深入了解腸道微生物群并進(jìn)一步闡明腸道微生物群在健康和疾病中的作用。本實(shí)驗(yàn)通過體外發(fā)酵模擬系統(tǒng),探究以大葉茶為原料分別制備的白茶、普洱生茶、普洱熟茶、酸茶對腸道菌群及其代謝物(主要是短鏈脂肪酸)的影響,并預(yù)測代謝通路及潛在健康作用。為大葉茶的保健作用提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

以云南大葉茶為原料,經(jīng)不同加工工藝制備為白茶、普洱生茶、普洱熟茶、酸茶,均來自云南中茶茶業(yè)有限公司,分別編號為WT、RPT、RIPT、ST。

細(xì)菌基因組 DNA提取試劑盒(DP302-02-50),天根生化科技(北京)有限公司;鹽酸、NaOH、NaCl、KCl、瓊脂粉,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;PBS,吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司;高純N2(≥99.999%),杭州今工特種氣體有限公司;乙醚、Na2HPO4、NaH2PO4、乙酸、丙酸、丁酸、異戊酸、正戊酸,上海麥克林生化科技有限公司; H3PO4溶液,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;乙腈,美國TEDIA天地試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TGL-16臺式高速冷凍離心機(jī),湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司;CP413電子精密天平,上海奧豪斯儀器有限公司;Waters 2695/2489液相色譜儀,美國沃特斯公司;CHA-S恒溫振蕩培養(yǎng)箱,常州國華電器有限公司;SW-CJ-1FD無菌操作臺,蘇州市金凈凈化設(shè)備科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 糞便收集與預(yù)處理

收集無炎癥性腸炎、腸易激綜合征等腸道疾病,且半年內(nèi)沒有使用過抗生素的3人(20～45歲)糞便作為正常腸道微生物來源;收集每周排便次數(shù)少于3次,大便干燥排出困難,或便質(zhì)不硬但排便不暢,常伴有腹脹、腹痛,且半年內(nèi)沒有使用過抗生素的3人(20～45歲)糞便作為便秘腸道微生物來源。參與捐獻(xiàn)人員志愿提供糞便,作為此項(xiàng)研究的腸道微生物樣本,且已簽署知情同意書。捐獻(xiàn)者使用一次性無菌采樣器收集好糞便后,立即轉(zhuǎn)入?yún)捬醪僮飨?。混?位捐獻(xiàn)者糞便,以消除個體差異。稱取10 g糞便于無菌容器中,加入80 mL無菌PBS(pH值為6.8)緩沖液,充分?jǐn)嚢钁腋『?用3層無菌紗布過濾掉固體顆粒,立即置于厭氧環(huán)境中備用。

1.3.2 接種擴(kuò)培

配制腸道體外批式模擬發(fā)酵培養(yǎng)基[11],滅菌后分別分裝30 mL到30個總體積50 mL的批式發(fā)酵試管中,分別編號1～30。1～15接種10%的正常人群糞便預(yù)處理菌液,16～30接種10%的便秘人群糞便預(yù)處理菌液。通入N2 5 min,37 ℃,低速(75 r/min)振蕩培養(yǎng)。其中正常人群組編號為N,便秘人群組編號為E。

1.3.3 加樣前取樣

24 h后,取試管編號1、10、30的發(fā)酵液3 mL。

1.3.4 添加茶湯

稱量白茶、普洱生茶、普洱熟茶、酸茶8 g,浸泡于200 mL沸水中,靜置冷卻,在試管1、2、3、16、17、18中分別加入10 mL無菌水,即為對照組NC和EC。試管4、5、6中分別加入10 mL白茶茶湯,為N-WT組;試管7、8、9中分別加入10 mL普洱生茶茶湯,為N-RPT組;試管10、11、12 中分別加入10 mL普洱熟茶茶湯,為N-RIPT組;試管13、14、15中分別加入10 mL酸茶茶湯,為N-ST組;試管19、20、21中分別加入10 mL白茶茶湯,為E-WT組;試管22、23、24中分別加入10 mL普洱生茶茶湯,為E-RPT組;試管25、26、27中分別加入10 mL普洱熟茶茶湯,為E-RIPT組;試管28、29、30中分別加入10 mL酸茶茶湯,為E-ST組;分別通入N2后37 ℃,低速(75 r/min)振蕩培養(yǎng)1 d、24 h后取樣3 mL。

1.3.5 微生物組成測定

移取1.0 mL發(fā)酵液至離心管中,采用DNA提取試劑盒完成發(fā)酵液樣品中的DNA提取,在-20 ℃冰箱保存待測。由杭州聯(lián)川生物公司進(jìn)行16S rDNA測序。

1.3.6 有機(jī)酸測定

移取1 mL發(fā)酵液至離心管中,離心(10 000 r/min,4 ℃)10 min,取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管,加入100 μL濃鹽酸和5 mL乙醚,充分振蕩使其混合均勻。常溫靜置萃取20 min后離心(3 500 r/min,4 ℃)10 min,小心收集上清液移至新的離心管。向新離心管中加入500 μL 1 mol/L NaOH溶液,充分振蕩使其混合均勻,常溫靜置萃取20 min,離心(3 500 r/min,4 ℃)10 min,小心收集下層液體轉(zhuǎn)移至新的離心管。向新離心管中加入100 μL濃鹽酸充分振蕩并混合均勻,取上清液,用0.22 μm的濾膜過濾后,利用高效液相色譜進(jìn)行分析。色譜條件:水相:0.025%的磷酸水溶液(A),有機(jī)相:乙腈(B);進(jìn)樣量20 μL;檢測波長210 nm;柱溫30 ℃;流速1 mL/min;色譜柱:ZORBAX SB-Aq(4.6 mm×250 mm,5 μm)[12]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用Office和SPSS統(tǒng)計(jì)軟件分析試驗(yàn)數(shù)據(jù),采用單因素方差分析Tukey test方法對數(shù)據(jù)進(jìn)行組間差異比較,P<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。應(yīng)用Origin 8.5和Graphpad prism 9繪圖軟件作圖。利用PICRUSt2開展腸道代謝通路預(yù)測后,用STAMP軟件進(jìn)行組間差異分析和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 腸道微生物多樣性分析

2.1.1 α多樣性分析

α多樣性分析包含物種豐富度(指數(shù)越大,物種越豐富,多樣性越大)和均勻度(指數(shù)越大,微生物分布越均勻,多樣性越大)。豐富度反映物種數(shù)的多少,均勻度反映各個物種個體數(shù)量的分配情況。在物種豐富度一樣的情況下,均勻度越高,腸道菌群結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定。結(jié)果表明,在接種便秘人群糞便菌液的試管中,白茶、普洱生茶、普洱熟茶、酸茶的干預(yù)對物種的豐富度、均勻度均沒有顯著影響。如圖1所示,在接種正常人群糞便菌液的試管中,白茶組顯著增加了物種的豐富度,以Chao1指數(shù)判定的物種豐富度,與對照組的218.9±35.0相比,白茶升高至349.0±10.1。如圖2所示,普洱熟茶顯著地增加了物種的均勻度,以Shannon指數(shù)判定的均勻度,與對照組的3.8±0.1相比,普洱熟茶組升高至5.5±0.6。因此,普洱熟茶組的腸道微生態(tài)均勻度最高,表現(xiàn)出較好的腸道結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

圖1 不同加工工藝大葉茶的α多樣性分析豐富度表征值
Fig.1 α diversity analysis of different processing techniques for Camellia sinensis var.assamica richness characterization values
注:*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001(下同)。

圖2 不同加工工藝大葉茶的α多樣性分析均勻度表征值
Fig.2 α diversity analysis of different processing techniques for Camellia sinensis var.assamica and characterization of uniformity

2.1.2 主成分分析(principal component analysis, PCA)

PCA樣本距離越近,代表腸道菌群越相似,反之差異越大。如圖3所示,在正常模型組和便秘模型組中,4種大葉茶均與對照組偏離,說明白茶、普洱生茶、普洱熟茶、酸茶干預(yù)后對正常人群和便秘人群腸道菌群組成均產(chǎn)生了影響。其中,普洱熟茶組偏離最遠(yuǎn),說明普洱熟茶對腸道菌群組成影響最大。

圖3 不同加工工藝大葉茶的腸道菌群PCA圖
Fig.3 Principal component analysis of gut microbiota in Camellia sinensis var.assamica under different processing techniques

2.1.3 腸道菌群門層面變化分析

如圖4所示,加樣培養(yǎng)1 d后,正常模型組中,與對照組的各菌門相對豐度相比,白茶組、普洱生茶組、普洱熟茶組、酸茶組的厚壁菌門(Firmicutes)減少,普洱生茶、普洱熟茶組擬桿菌門(Bacteroidetes)顯著增加(3.707±1.045)%、(6.840±1.045)%;便秘人群組中,與對照組的各菌門相對豐度相比,白茶組、普洱生茶組、普洱熟茶組、酸茶組的Firmicutes減少,普洱生茶組的放線菌門(Actinobacteria)增加,普洱熟茶組的擬桿菌門顯著增加(0.710±0.146)%。

圖4 不同加工工藝大葉茶的腸道菌群各菌門相對豐度柱狀圖
Fig.4 Bar chart of relative abundance of gut microbiota and phylum in Camellia sinensis var.assamica with different processing techniques

2.1.4 腸道菌群屬層面變化分析

在正常模型組中,與對照組相比,白茶組中副擬桿菌(Parabacteroides)和顫螺球菌(Oscillibacter)顯著增加(0.464±0.146)%、(0.055±0.019)%,其中顫螺菌豐度與潰瘍性結(jié)腸炎患者的疾病嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)[13]。普洱生茶組中,雙歧桿菌(Bifidobacterium)顯著減少(-2.413±0.612)%,普雷沃氏菌(Prevotellaceae)和(Anaerostipes)顯著增加(0.023±0.005)%、(0.0324±0.010)%。盡管Bifidobacterium被認(rèn)為是益生菌,但其豐度過高會產(chǎn)生過量乙酸及乳酸,需進(jìn)一步代謝為丙酸、丁酸以維持腸道穩(wěn)態(tài);Anaerostipes可能通過合成丙酸、丁酸等下游短鏈脂肪酸形成多種短鏈脂肪酸的穩(wěn)態(tài)平衡[14]。因此,白茶和普洱生茶可能通過調(diào)節(jié)正常人群腸道發(fā)揮抗炎作用。

在正常模型組中,與對照組相比,普洱熟茶顯著改變了14種菌屬的相對豐度,在4種大葉茶中干預(yù)最為明顯。其顯著抑制了與人類多種化膿性炎癥及超敏反應(yīng)性疾病相關(guān)的致病性鏈球菌(Streptococcus)、產(chǎn)腸毒素的葡萄球菌(Staphylococcus)以及與腸道炎癥相關(guān)的韋榮氏球菌(Veillonella)及梭桿菌(Fusobacterium),而與分泌抗炎因子、改善腸道炎癥相關(guān)的擬桿菌(Bacteroides)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、真桿菌(Blautia)、瘤胃球菌(Ruminococcus)、Oscillibacter、普雷沃氏菌(Prevotella),與腸癌、糖尿病等疾病負(fù)相關(guān)的毛螺菌(Lachnospiraceae),與肥胖負(fù)相關(guān)的Parabacteroides則顯著增加(5.063±0.844)%、(0.377±0.119)%、(0.621±0.154)%、(0.963±0.259)%、(0.956±0.274)%、(1.219±0.146)%、(0.200±0.030)%、(0.340±0.074)%、(0.060±0.019)%。因此,普洱熟茶可能通過促進(jìn)合成短鏈脂肪酸、抑制腸道炎癥,改善代謝健康。

在正常模型組中,與對照組相比,酸茶組的乳桿菌(Lactobacillus)、Bifidobacterium和經(jīng)黏液真桿菌(Blautia)的豐度顯著減少(0.052±0.013)%、(2.416±0.612)%、(0.906±0.310)%。Blautia與標(biāo)志心血管及代謝疾病風(fēng)險的內(nèi)臟脂肪面積負(fù)相關(guān)。Lactobacillus和Bifidobacterium豐度的降低可能與酸茶帶入較高濃度的有機(jī)酸,從而反饋性抑制有關(guān)[15]。

在便秘模型組中,與對照組相比,白茶組及普洱生茶組中產(chǎn)腸毒素的Staphylococcus豐度顯著降低(-0.169±0.053)%、(-0.189±0.053)%。普洱生茶組中,與抑制肥胖和炎癥相關(guān)的優(yōu)桿菌(Eubacterium)豐度顯著增加(0.046 7±0.012 9)%。普洱熟茶組中,與改善腸道炎癥相關(guān)的普拉梭菌(Faecalibacterium)、Bacteroides、Ruminococcus,與減肥相關(guān)的考拉桿菌(Phascolarctobacterium)、罕見小球菌(Subdoligranulum)、Parabacteroides、嗜黏蛋白阿克曼菌(Akkermansia)顯著增加(0.124±0.026 2)%、(0.706±0.130)%、(0.042±0.013)%、(0.103±0.022)%、(0.299±0.090)%、(0.03±0.006)%、(0.089±0.019)%,可引起人類多種化膿性炎癥及超敏反應(yīng)性疾病的Streptococcus、產(chǎn)腸毒素的Staphylococcus、與炎癥有關(guān)的Fusobacterium則顯著減少(-0.142±0.033)%、(-0.215±0.053)%、(-0.046 6±0.014)%。不同加工工藝大葉茶的腸道菌群各菌屬相對豐度變化見圖5。

圖5 不同加工工藝大葉茶的腸道菌群各菌屬相對豐度柱狀圖
Fig.5 Histogram of the abundance of gut microbiota and genera in Camellia sinensis var.assamica with different processing techniques

2.1.5 PICRUSt2 功能預(yù)測分析

通過PICRUSt2功能預(yù)測,共測序出41條二級代謝途徑。如圖6所示,在正常模型組中,白茶的干預(yù)導(dǎo)致11條二級代謝途徑存在顯著性差異,其中促進(jìn)了運(yùn)輸和分解代謝、內(nèi)分泌系統(tǒng)、脂質(zhì)代謝、酶家族、免疫系統(tǒng)疾病、細(xì)胞過程和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等代謝途徑,抑制了其他氨基酸代謝途徑、消化系統(tǒng)、代謝疾病以及碳水化合物代謝。普洱生茶使5條二級代謝途徑產(chǎn)生差異,促進(jìn)了細(xì)胞過程和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、生物降解和代謝、能量代謝等途徑,抑制了循環(huán)系統(tǒng)途徑。普洱熟茶使17條二級代謝途徑產(chǎn)生顯著性差異,其中促進(jìn)了神經(jīng)退行性疾病、排泄系統(tǒng)、細(xì)胞過程和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、運(yùn)輸與分解代謝、內(nèi)分泌系統(tǒng)、脂質(zhì)代謝、心血管疾病、細(xì)胞運(yùn)動性、免疫系統(tǒng)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)、能量代謝等途徑,抑制了遺傳信息處理、核苷酸代謝、輔助因子和維生素代謝以及代謝性疾病等途徑。酸茶的干預(yù)則導(dǎo)致外源化合物生物降解代謝途徑、三羧酸循環(huán)代謝途徑存在顯著性差異,促進(jìn)了能量代謝。4種茶均與人體代謝健康相關(guān),但作用的機(jī)理不同。特別是普洱生茶和酸茶,其作用機(jī)制應(yīng)重點(diǎn)考慮抗氧化活性強(qiáng)以及對外源有害物質(zhì)的降解能力強(qiáng),從而產(chǎn)生抗炎保護(hù)作用。

a-白茶干預(yù); b-酸茶干預(yù); c-普洱生茶干預(yù); d-普洱熟茶干預(yù)
圖6 不同加工工藝大葉茶干預(yù)下普通腸型菌群代謝PICRUSt預(yù)測差異性分析
Fig.6 Difference analysis of PICRUSt prediction of metabolism of common intestinal flora under the intervention of Camellia sinensis var.assamica with different processing techniques

進(jìn)一步分析三級代謝途徑顯示(如圖7),白茶、普洱生茶、普洱熟茶均不同程度促進(jìn)了蛋白和脂質(zhì)代謝,以普洱熟茶為最強(qiáng),但只有普洱熟茶促進(jìn)了淀粉和蔗糖的代謝。白茶、普洱生茶、普洱熟茶、酸茶均促進(jìn)了脂肪酸的合成。白茶、普洱生茶、普洱熟茶、酸茶均激活了與腸道健康相關(guān)的PPARγ信號通路。研究表明,潰瘍性結(jié)腸炎患者結(jié)腸上皮中PPARγ表達(dá)降低,可能是導(dǎo)致腸功能障礙和慢性炎癥的重要因素[16],提示大葉茶對腸道炎癥的抑制潛力。白茶、普洱熟茶、酸茶促進(jìn)了能量代謝,白茶、普洱生茶、普洱熟茶抑制了Ⅱ型糖尿病途徑。在降解外源化合物方面,普洱生茶抑制硫代謝,促進(jìn)了苯甲酸降解,鞘糖脂的生物合成。普洱熟茶促進(jìn)膽汁酸合成,促進(jìn)能量代謝和脂肪酸的合成。酸茶促進(jìn)了鄰苯二酚等物質(zhì)的降解。

圖7 不同加工工藝大葉茶干預(yù)下特殊腸型菌群代謝PICRUSt預(yù)測差異性分析
Fig.7 Difference analysis of PICRUSt prediction of metabolism of special intestinal flora under the intervention of Camellia sinensis var.assamica with different processing techniques

而在便秘人群中,白茶、普洱生茶和酸茶的攝入均未導(dǎo)致二級代謝途徑產(chǎn)生顯著性差異,只有普洱熟茶的干預(yù)使得與心血管健康和循環(huán)系統(tǒng)相關(guān)的2條二級代謝途徑產(chǎn)生顯著性差異。

2.2 有機(jī)酸分析

短鏈脂肪酸主要通過改善腸道pH值、抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫力、改善腸道組織形態(tài)學(xué)、調(diào)節(jié)微生物譜促進(jìn)腸道健康。其中,乙酸可以抑制病原菌、降低腸道感染性疾病的發(fā)生[17];丙酸能夠激活宿主體內(nèi)與腸道糖異生有關(guān)的通路;丁酸可以為腸道上皮提供能量、保護(hù)腸道上皮屏障,從而阻止毒素易位進(jìn)入人體;此外也有激活下游代謝通路的作用[18-19]。

不同茶湯干預(yù)對不同腸型短鏈脂肪酸影響不同。如圖8所示,在正常模型組,與對照組相比,白茶、普洱生茶、普洱熟茶、酸茶的總短鏈脂肪酸分別由(21.2±1.6) mmol/L上升至(49.1±20.4)、(54.1±4.7)、(50.8±14.6)、(57.3±15.5) mmol/L;乙酸分別由(10.3±1.7) mmol/L上升至(19.7±13.3)、(29.0±4.3)、(25.0±7.7)、(36.8±6.4) mmol/L,以酸茶和普洱生茶組的增加最為顯著。與對照組相比,白茶、普洱生茶、普洱熟茶、酸茶的丙酸分別由(1.5±0.2) mmol/L上升至(3.3±0.9)、(12.6±1.0)、(14.5±3.7)、(7.5±4.5) mmol/L,以普洱熟茶和普洱生茶的增加最為顯著;丁酸分別由(9.4±3.5) mmol/L上升至(26.1±23.7)、(12.5±2.4)、(11.3±3.5)、(12.9±5.2) mmol/L,以白茶的增加最為顯著。

a-總短鏈脂肪酸;b-乙酸;c-丙酸;d-丁酸
圖8 總短鏈脂肪酸、乙酸、丙酸、丁酸的含量的變化
Fig.8 Changes in the content of total short chain fatty acids, acetic acid, propionic acid, and butyric acid

便秘模型組的總短鏈脂肪酸、乙酸含量在酸茶干預(yù)下顯著增加,乙酸含量從對照組的(8.0±4.7) mmol/L增加至(17.1±5.8) mmol/L;除此之外,其余茶湯的干預(yù)對便秘模型的短鏈脂肪酸含量影響均不顯著。

2.3 典型“炎癥-肥胖”通路相關(guān)指標(biāo)分析

腸道菌群中Firmicutes和Bacteroidetes的相對豐度是指示肥胖易感性的生物標(biāo)志物。比較肥胖和健康個體的腸道微生物群,肥胖人群中Firmicutes和Bacteroidetes的比值(F/B)較高,F/B值增加可能有利于能量吸收和脂肪儲存,而導(dǎo)致體重增加和肥胖[20];反之,F/B值較低與不容易吸收熱量、不容易胖相關(guān)。在正常人群腸道模型中,4種茶均有降低F/B的作用,從強(qiáng)到弱依次為普洱熟茶、普洱生茶、白茶、酸茶。便秘人群腸道模型的F/B相對于正常人群腸道模型顯著升高,4種茶均降低便秘人群腸道模型的F/B,其中以普洱熟茶最為顯著(表1)。

表1 不同加工工藝大葉茶對腸道菌群中厚壁菌/擬桿菌的影響單位:%
Table 1 Effects of different processing techniques on Firmicutes/Bacteroides in the gut microbiota of Camellia sinensis var.assamica

組別對照組酸茶普洱熟茶普洱生茶白茶正常組37.46±18.63a27.72±22.42ab5.44±1.71b9.47±3.85b11.09±2.17b便秘組356.67±244.06a150.39±64.52ab23.00±11.04b186.71±75.18ab147.71±28.65ab

注:每行中的上標(biāo)字母表示統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異(P<0.05)。

腸道代謝形成的丁酸能夠通過保護(hù)腸道上皮屏障的完整性,抑制毒素易位,從而降低系統(tǒng)性炎癥及其帶來的肥胖等代謝健康風(fēng)險[19]。如圖9所示,在正常模型組,觀察到茶干預(yù)使得典型產(chǎn)丁酸菌Ruminococcus、真細(xì)菌、Lachnospiraceae和丁酸球菌增加,其中普洱熟茶組增加最強(qiáng),表明普洱熟茶可能通過促進(jìn)丁酸在腸道的合成抑制“炎癥-肥胖”等通路,與代謝健康的積極作用相關(guān)[21]。飲茶對促進(jìn)便秘模型組產(chǎn)乙酸、丁酸菌增殖的作用弱于正常模型組,其中Faecalibacterium的增殖以酸茶最強(qiáng),其余產(chǎn)丁酸菌的增殖以普洱熟茶較強(qiáng)。酸茶促進(jìn)產(chǎn)丁酸菌增殖的能力整體弱于普洱熟茶,提示酸茶干預(yù)引起的短鏈脂肪酸增加可能存在其他機(jī)制。

a-正常組;b-便秘組
圖9 不同加工工藝大葉茶對腸道菌群主要產(chǎn)丁酸菌豐度的影響
Fig.9 Effect of different processing techniques on the abundance of main butyrate producing bacteria in the intestinal microflora of Camellia sinensis var.assamica
注:上標(biāo)字母表示統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異(P<0.05)。

產(chǎn)丁酸菌的增殖主要有以下原因:(a)飲茶抑制碳水化合物消化,為結(jié)腸微生物提供更多用于合成丁酸的底物[22]。(b)茶葉自身的茶多糖等物質(zhì)為結(jié)腸微生物消化提供底物[23]。(c)大葉茶通過抗氧化作用,相對有利于厭氧菌的增殖,從而有利于產(chǎn)生乙酸、丁酸等短鏈脂肪酸的合成[24-25]。

普洱熟茶和白茶在正常模型組促進(jìn)了Akkermansia的增殖;普洱熟茶和普洱生茶在便秘模型組促進(jìn)了Akkermansia的增殖。Akkermansia在較低豐度時,其增加與促進(jìn)代謝健康正相關(guān)。Akkermansia治療高脂飲食喂養(yǎng)的肥胖小鼠后,可特異性地激活棕色脂肪的產(chǎn)熱活性;同時激活腸道內(nèi)胃腸激素胰高血糖素樣肽1(GLP-1)的分泌,從而調(diào)節(jié)能量平衡、改善葡萄糖穩(wěn)態(tài)[26]。

2.4 典型腸炎相關(guān)指標(biāo)分析

炎癥性腸病包括克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎,炎癥性腸病患者的腸道微生物多樣性是減少的。主要表現(xiàn)為Firmicutes的豐度減少,以及腸桿菌科豐度的增加。部分研究還觀察到了Parabacteroides、Bifidobacterium以及Lactobacillus的變化。Blautia、Faecalibacterium、Ruminococcus是克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎中的關(guān)鍵菌群。Lachnospiraceae和Ruminococcus與復(fù)發(fā)性疾病、抗腫瘤壞死因子治療的不良反應(yīng)以及克羅恩病患者手術(shù)干預(yù)后的復(fù)發(fā)呈負(fù)相關(guān)。

在正常模型組中,與對照組相比,普洱熟茶組中與炎癥性腸病負(fù)相關(guān)的Parabacteroides[27]、Ruminococcus顯著增加。普洱生茶組和酸茶組中,具有致病性,有一定促炎作用的Bifidobacterium顯著減少。酸茶組中,參與促炎途徑的Blautia顯著減少。在便秘模型中,與對照組相比,普洱熟茶組中Faecalibacterium顯著增加,其在潰瘍性結(jié)腸炎中豐度降低,顯示其有益菌的功能。

3 結(jié)論

本研究基于體外試管發(fā)酵裝置,比較了不同加工工藝的大葉種茶產(chǎn)品對普通腸道及腸桿菌型便秘腸道模型中微生態(tài)的影響,并預(yù)測其潛在生理功能。結(jié)果表明,4種茶對正常健康人及腸桿菌科高的人的腸道菌群結(jié)構(gòu)均有影響;由于加工工藝導(dǎo)致的茶葉成分差異,其作用特點(diǎn)存在不同特征。

白茶、普洱生茶、普洱熟茶、酸茶是以大葉茶為原料制備的,由于加工工藝的不同,導(dǎo)致茶葉成分存在差異。其中,普洱生茶有較高含量的兒茶素,普洱熟茶含有較高的茶褐素和茶多糖。普洱熟茶對腸道菌群結(jié)構(gòu)影響最為顯著,這與其特征成分茶褐素、茶多糖有關(guān)。酸茶在發(fā)酵過程中形成了含量豐富的有機(jī)酸,飲用后進(jìn)入人體腸道[28]。

普洱熟茶對腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響最為顯著,且預(yù)測干預(yù)的代謝通路最多,提示其具有促進(jìn)能量代謝、脂質(zhì)代謝以及改善代謝疾病的作用。與其他茶相比,熟普洱茶經(jīng)發(fā)酵形成含量較高的茶褐素、茶多糖等物質(zhì),分別作用于“膽汁酸-肝臟脂肪沉積”通路及“短鏈脂肪酸-腸道屏障-慢性炎癥”通路,可能是普洱熟茶與改善代謝關(guān)聯(lián)的主要物質(zhì)因素。研究發(fā)現(xiàn)普洱熟茶中茶褐素可通過抑制乳酸桿菌屬、芽孢桿菌屬、腸球菌屬、乳球菌屬,Streptococcus生長,從而增加回腸結(jié)合膽汁酸水平來抑制腸道FXR-FGF15信號通路,增加肝臟膽汁酸生成和糞便排泄,減少肝臟膽固醇和脂肪生成。而對于另枝菌屬、Akkermansia、布勞特氏菌屬、羅斯氏菌屬等與肥胖呈負(fù)相關(guān)的菌屬,普洱熟茶則可顯著提升其豐度。茶褐素增加7-去羥基化菌群如Akkermansia、梭狀芽胞桿菌和Parabacteroides,使膽汁酸的生物合成從經(jīng)典途徑轉(zhuǎn)移到替代途徑,從而改善白色和棕色脂肪組織的能量代謝,起到改善肥胖作用。茶多糖也能通過調(diào)節(jié)腸道微生物色氨酸代謝,促進(jìn)腸上皮細(xì)胞再生來改善結(jié)腸炎[29]。

酸茶經(jīng)乳酸菌、芽孢桿菌的厭氧發(fā)酵后,含有天然乳酸、琥珀酸、檸檬酸等形成乙酸、丙酸、丁酸等短鏈脂肪酸的前體物質(zhì),同時保留含量較高的多酚類化合物,但茶多糖、茶褐素的含量未見顯著增加。盡管熟普洱茶促進(jìn)產(chǎn)乙酸、丁酸菌的增殖作用更為突出,但其促進(jìn)腸道模型積累短鏈脂肪酸的能力卻弱于酸茶,可能與酸茶帶入有機(jī)酸有關(guān)。酸茶中自帶的乳酸菌、芽孢桿菌等微生物并沒有成為腸道菌群中的主導(dǎo)物種,提示酸茶對于腸道微生態(tài)的影響主要關(guān)注其代謝物而不是發(fā)酵微生物本身。被酸茶干預(yù)的代謝通路較少,提示針對酸茶的功能研究可以重點(diǎn)關(guān)注對腸道微環(huán)境的影響。

與正常人群腸道模型相比,盡管便秘人群模型的腸道菌群被茶干預(yù),但未明顯改變其腸型及代謝特征。提示飲茶干預(yù)人體健康的研究應(yīng)關(guān)注適用人群及其腸道的初始狀態(tài)。

研究表明,盡管采用相同的大葉茶原料,但內(nèi)源性酶、厭氧細(xì)菌、真菌等不同因素的作用導(dǎo)致茶產(chǎn)品的功能物質(zhì)含量存在差異。后續(xù)應(yīng)關(guān)注不同加工工藝大葉茶的功能特性及物質(zhì)基礎(chǔ),并判斷其適用人群,做好健康導(dǎo)向的質(zhì)量控制及應(yīng)用推廣。

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