本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及具有apn抑制作用的生物活性肽。

背景技術(shù)：

生物活性肽作為促進(jìn)健康的生物活性成分，能有效促進(jìn)機(jī)體的功能或改善機(jī)體的狀態(tài)，并具有傳遞生理信息，調(diào)節(jié)生理功能的作用。生物活性肽常作為功能性成分用于食品生產(chǎn)，特別是在食品、保健品中的應(yīng)用方面已經(jīng)取得良好效果。長(zhǎng)期以來，雞蛋一直被認(rèn)為是生物活性肽的理想來源。雞蛋中的生物活性肽在滿足基本的營(yíng)養(yǎng)需求以外還發(fā)揮著多種不同的生物學(xué)功能，不僅具有抗氧化、抗衰老、抗炎癥、抗高血壓、降血糖、抗細(xì)菌等作用，而且作為免疫調(diào)節(jié)劑具有調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、抗腫瘤等功能，并且能夠清除自由基具有延緩衰老的功效。

雞蛋蛋白被胃蛋白酶和胰蛋白酶分解利用，并發(fā)生了一系列生理生化反應(yīng)，使蛋白質(zhì)變?yōu)槎嚯幕蛘哂坞x的氨基酸，最終被人體消化吸收或通過小腸上皮細(xì)胞的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)直接進(jìn)入人體的血液循環(huán)，并以活性形式和足夠劑量的方式運(yùn)輸?shù)桨衅鞴侔l(fā)揮其生物活性作用。

因此，這些生物活性小分子肽不僅是篩選藥物的天然資源寶庫(kù)，也是功能性食品工業(yè)的主要原料成分。目前，生物活性肽的制備及其應(yīng)用開發(fā)已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)研究的熱點(diǎn)。天天好生物制品有限公司首次在國(guó)內(nèi)利用酶切技術(shù)酶解雞蛋中的卵清蛋白，獲得生物活性肽并證明其生理活性。他們發(fā)現(xiàn)，利用胃蛋白酶和胰凝乳蛋白酶水解卵清蛋白，從水解物中得到的氨基酸序列arg-ala-asp-his-pro-phe-leu和tyr-ala-glu-glu-arg-tyr-pro-ile-leu，口服12周能夠使緩激肽的分解減少，加強(qiáng)血管的舒張作用，使血壓下降從而抑制高血壓的發(fā)展。1991年，tsuge等人從雞蛋中的卵清蛋白中得到生物活性肽ahk，vhh和vhhanen，研究證明它們具有較好的抗氧化生物學(xué)活性。choi等人酶解雞蛋中的卵黃高磷蛋白得到磷酸肽，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不僅對(duì)人體具有抗氧化活性，還增強(qiáng)了鈣的生物利用度，增強(qiáng)人體免疫力，減少疾病的發(fā)生。

氨肽酶n(apn)是一種鋅依賴性金屬蛋白酶，廣泛存在于如腸上皮，腎，肝，肺細(xì)胞等許多細(xì)胞中，可以選擇性地從肽的n-末端切割氨基酸。apn經(jīng)常被鑒定為腫瘤細(xì)胞表面的過度表達(dá)，并與腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成有關(guān)，一直被認(rèn)為是抗腫瘤治療的重要目標(biāo)。同時(shí)，apn與炎癥、鎮(zhèn)痛、癌癥、以及調(diào)節(jié)血壓都有關(guān)。自1976年首次推出抗apn藥物bestatin以來，已有大量apn抑制劑被報(bào)道，例如，probestin，lapstatin，ahpa-val等。

盡管雞蛋蛋白內(nèi)含有許多具有生物活性的肽序列，但這些生物活性肽序列只有通過一定的手段將其釋放出來才能發(fā)揮作用。獲取蛋源性活性肽的主要手段有兩種：①發(fā)酵，利用微生物發(fā)酵蛋源蛋白獲??；②酶解，利用來自動(dòng)物的消化道酶和來自植物和微生物的蛋白酶。然而，分離和純化生物活性肽研究周期長(zhǎng)且價(jià)格昂貴，因此可以通過虛擬篩選的方法來推進(jìn)這一過程。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明公開了具有apn抑制作用的生物活性肽，并且可以將其作為保健品成分以及生物藥品中有效成分的生物遞送的有效載體。

本發(fā)明的具有apn抑制作用的生物活性肽，其氨基酸序列分別為cys-asn-arg、cys-asp-arg、gly-glu-phe，其抑制apn活性的半抑制濃度(ic50)分別為8.935、6.42和61.67mm。

本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

(1)生物活性三肽的篩選

基于在線程序expasypeptidecutter(http：//web.expasy.org/peptide_cutter/)，使用兩種典型的胃腸道消化蛋白酶即胃蛋白酶和胰蛋白酶對(duì)雞蛋蛋白序列進(jìn)行模擬酶解，將酶解后產(chǎn)生的肽序列與biopep(http：//www.uwm.edu.pl/biochemia/index.php/en/biopep)數(shù)據(jù)庫(kù)中已報(bào)道的apn抑制肽進(jìn)行比較，篩選獲得到未經(jīng)報(bào)道的生物活性三肽cdr、sdf、adf、fyq、gef、ntf、lwk、mir、naf、aqf、cnr。通過peptidepropertycalculator、peptideranker和discoverystudio的admet模塊對(duì)三肽cdr、sdf、adf、fyq、gef、ntf、lwk、mir、naf、aqf、cnr進(jìn)行水溶性、生物活性和admet(吸收、分布、代謝、排泄、毒性)性質(zhì)的預(yù)測(cè)。篩選得到溶解性好、活性評(píng)分高于0.5、無毒的三肽cdr、sdf、gef、adf、lwk、cnr。從pdb數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//www.rcsb.org/)中獲得apn的晶體結(jié)構(gòu)(4fyr)，并將其作為蛋白靶標(biāo)，通過ds中的cdocker程序進(jìn)行分子對(duì)接來篩選能與apn緊密結(jié)合的三肽，并明確活性位點(diǎn)。以結(jié)合‘cdocker-interaction-energy’得分、形成氫鍵的數(shù)目及作用的關(guān)鍵氨基酸為指標(biāo)，篩選得到具有潛在apn抑制活性肽cnr、cdr、gef。

(2)體外apn抑制活性測(cè)定

通過酶標(biāo)儀法對(duì)肽cnr、cnr、gef的apn抑制活性進(jìn)行測(cè)定。取20μl活性肽，加入20μl濃度為60u/l的標(biāo)準(zhǔn)品混合均勻，在37℃恒溫水浴鍋中預(yù)熱10min，然后取混合液20μl。向酶標(biāo)包被板中加入30μl樣品稀釋液，與混合液充分混合后，加入100μl酶標(biāo)試劑后用封板膜封板，37℃保溫60min。將濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用。揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30s后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。每孔先加50μl顯色劑a，再加50μl顯色劑b，震蕩混勻后，37℃避光顯色15min。最后，每孔加50μl終止液，終止反應(yīng)，15min內(nèi)進(jìn)行測(cè)定。同時(shí)用apn標(biāo)準(zhǔn)品替代混合液作為空白對(duì)照組。該反應(yīng)液用酶標(biāo)儀進(jìn)行分析，檢測(cè)波長(zhǎng)為450nm。

利用下列公式計(jì)算不同濃度肽的抑制率：

apn抑制活性(％)＝(a-b)/a×100％

其中a是空白對(duì)照組的吸光度值，反應(yīng)空白混合物含有相同體積的緩沖溶液而不是樣品；b是apn和酶促肽樣品存在下反應(yīng)的吸光度值，ic50值定義為在測(cè)定條件下抑制50％apn活性的抑制劑濃度。

活性肽cnr、cdr、gef的獲得可利用胃蛋白酶和胰蛋白酶對(duì)雞蛋蛋白進(jìn)行酶解并通過多維色譜純化(凝膠過濾色譜、親和色譜和半制備液相色譜)實(shí)現(xiàn)；也可通過固相化學(xué)合成方法實(shí)現(xiàn)。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明生物活性多肽的有益效果為：

本發(fā)明從雞蛋蛋白中篩選得到了具有有效apn抑制作用的生物活性肽cnr、cdr、gef，并明確活性肽cnr、cdr、gef與apn的作用位點(diǎn)；本發(fā)明的蛋源性生物活性三肽cnr、cdr、gef具有很好的促進(jìn)機(jī)體免疫力活性和抗腫瘤功能；本發(fā)明的生物活性三肽能夠增強(qiáng)機(jī)體免疫力，提高機(jī)體抵御外界病原體感染的能力，降低機(jī)體發(fā)病率，而且經(jīng)過胃腸道消化模擬實(shí)驗(yàn)?zāi)苤苯游詹槐唤到?，進(jìn)入體內(nèi)不會(huì)引起機(jī)體的免疫排斥反應(yīng)。另外，模擬消化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明這三條生物活性三肽在通常的動(dòng)物體內(nèi)消化條件下穩(wěn)定，不會(huì)被進(jìn)一步降解，能夠被動(dòng)物機(jī)體直接吸收利用發(fā)揮其具有的生物活性功能，對(duì)開發(fā)具有抗腫瘤功能的食品、保健品和藥品具有十分重要的意義和應(yīng)用價(jià)值。

附圖說明

本發(fā)明附圖3幅，其中：

圖1cnr與apn的對(duì)接結(jié)果的3d圖；

圖2cdr與apn的對(duì)接結(jié)果的3d圖；

圖3gef與apn的對(duì)接結(jié)果的3d圖；

具體實(shí)施方式

下面以具體實(shí)施例的方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述。

實(shí)施例1.具有apn抑制作用的活性肽的篩選

通過在線工具expasypeptidecutter(http：//web.expasy.org/peptide_cutter/)的胃蛋白酶和胰蛋白酶對(duì)雞蛋蛋白(卵黏蛋白、抗生物素蛋白、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白)進(jìn)行虛擬酶解，將酶解后產(chǎn)生的肽序列與biopep(http：//www.uwm.edu.pl/biochemia/index.php/en/biopep)數(shù)據(jù)庫(kù)中已知的apn抑制肽進(jìn)行比較，篩選獲得到未經(jīng)報(bào)道的三肽cdr、sdf、adf、fyq、gef、ntf、lwk、mir、naf、aqf、cnr。通過在線工具peptidepropertycalculator、peptideranker和discoverystudio中的admet程序?qū)θ腸dr、sdf、adf、fyq、gef、ntf、lwk、mir、naf、aqf、cnr進(jìn)行水溶性、生物活性和admet(吸收、分布、代謝、排泄、毒性)性質(zhì)的預(yù)測(cè)。篩選得到溶解性好、活性評(píng)分高于0.5、無毒的三肽cdr、sdf、gef、adf、lwk、cnr。

從pdb數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//www.rcsb.org/)中獲得apn的晶體結(jié)構(gòu)(4fyr)，并將其作為蛋白靶標(biāo)，通過ds中的cdocker程序進(jìn)行分子對(duì)接來評(píng)價(jià)肽與apn緊密結(jié)合能力。結(jié)合‘cdocker-interaction-energy’得分、形成氫鍵的數(shù)目及作用的關(guān)鍵氨基酸，篩選得到具有潛在apn抑制活性的三肽cnr、cdr、gef。結(jié)果表明cnr可以與apn的主要?dú)埢磄lu355、his392、his388、glu411、tyr477、arg363、ala353和arg381結(jié)合(圖1)；cdr可以與apn的主要?dú)埢磄lu411、glu355、his388、his392、tyr477和glu389結(jié)合(圖2)；gef可以與apn的主要?dú)埢碼la351、tyr477、gly352、arg381、glu411、glu355、his388和his392結(jié)合(圖3)。

實(shí)施例2.體外apn抑制活性鑒定

通過酶標(biāo)儀法對(duì)肽cnr、cnr和gef的apn抑制活性進(jìn)行測(cè)定。取20μl活性肽，加入20μl濃度為60u/l的標(biāo)準(zhǔn)品混合均勻，在37℃恒溫水浴鍋中預(yù)熱10min，然后取混合液20μl。向酶標(biāo)包被板中加入30μl樣品稀釋液，與混合液充分混合后，加入100μl酶標(biāo)試劑后用封板膜封板，37℃保溫60min。將濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用。揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30s后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。每孔先加50μl顯色劑a，再加50μl顯色劑b，震蕩混勻后，37℃避光顯色15min。最后，每孔加50μl終止液，終止反應(yīng)，15min內(nèi)進(jìn)行測(cè)定。同時(shí)用apn標(biāo)準(zhǔn)品替代混合液作為空白對(duì)照組。該反應(yīng)液用酶標(biāo)儀進(jìn)行分析，檢測(cè)波長(zhǎng)為450nm。

利用下列公式計(jì)算不同濃度三肽的抑制率：

apn抑制活性(％)＝(a-b)/a×100％

其中a是空白對(duì)照組的吸光度值，反應(yīng)空白混合物含有相同體積的緩沖溶液而不是樣品；b是apn和酶促肽樣品存在下反應(yīng)的吸光度值，ic50值定義為在測(cè)定條件下抑制50％apn活性的抑制劑濃度。

結(jié)果表明cnr、cdr和gef可有效抑制apn的活性，其ic50值分別為8.935、6.42和61.67mm。

以上所述的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行了詳細(xì)說明，應(yīng)理解的是以上所述僅為本發(fā)明的具體實(shí)施例，并不用于限制本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)指出：對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的前提下，還可以做出各種變化和變型，這些變化和變型也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。

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