腫瘤微環(huán)境（Tumor Microenvironment, TME）中T細胞效應功能的喪失是腫瘤進展和免疫治療失敗的主要原因之一【1-2】。近期研究發(fā)現(xiàn)，CD8+TILs中存在線粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)耦連增強的現(xiàn)象【3】，這一結(jié)果提示細胞器互作和代謝適應在重編程T細胞功能和命運中的重要性【4】。然而，目前這種細胞器相互作用是如何調(diào)控腫瘤浸潤性CD8+ T細胞功能的生物學機制尚不清楚。
2023年9月22日，中山大學韓輝，高嵩和北京大學白凡共同通訊在Science Immunology（IF=25）在線發(fā)表題為“Mitochondria-ER contact mediated by MFN2-SERCA2 interaction supports CD8+ T cell metabolic fitness and function in tumors”的研究論文，該研究展示了線粒體融合素-2（MFN2）的表達與多種癌癥的預后呈正相關(guān)。在CD8+ T細胞中遺傳消融Mfn2抑制了線粒體代謝和功能，促進了腫瘤的發(fā)展。
研究者首先利用SYSUCC腎透明細胞癌（ccRCC）隊列，發(fā)現(xiàn)CD8+TILs中MFN2高表達的患者預后更好，該結(jié)論在其它癌種中也得到證實。通過分選ccRCC中CD8+TILs進行單細胞測序和實驗驗證，發(fā)現(xiàn)MFN2在CD8+T細胞激活后表達上調(diào)，并與更強的效應功能和線粒體氧化磷酸化能力相關(guān)，這一現(xiàn)象在非小細胞肺癌和結(jié)直腸癌中也得到證實，進一步發(fā)現(xiàn)AP-1 通路參與介導CD8+T細胞激活后MFN2表達的上調(diào)。
為了深入驗證MFN2對T細胞抗腫瘤功能的影響，研究者構(gòu)建了T細胞中特異性敲除MFN2的條件性敲除小鼠（Mfn2flox/floxCD4Cre, CKO小鼠），利用皮下成瘤模型進行功能實驗并分選CD8+TILs進行單細胞測序，分析MFN2對CD8+T細胞抗腫瘤免疫功能的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MFN2敲除后，T細胞在腫瘤微環(huán)境中的效應功能、增殖和存活明顯受損，對anti-PD-1治療無應答，證明MFN2在維持體內(nèi)CD8+T細胞抗腫瘤功能中的重要作用（圖1）。
圖1.臨床特征與單細胞測序揭示MFN2與患者預后和CD8+ TILs功能關(guān)聯(lián)
接著研究者通過轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)，MFN2敲除后線粒體氧化磷酸化和脂肪酸氧化代謝通路顯著受到抑制。進一步代謝實驗證明，MFN2敲除后主要損害線粒體利用脂肪酸作為底物氧化產(chǎn)生能量的能力。MFN2敲除后CD8+T細胞長期下調(diào)的線粒體代謝功能導致其抗腫瘤功能受到損害（圖2）。
圖2.MFN2敲除影響線粒體代謝功能損害CD8+T細胞抗腫瘤功能
緊接著研究者研究了MFN2敲除（Mfn2-/-）TILs線粒體代謝功能受損的機制。既往研究發(fā)現(xiàn)MFN2通過介導線粒體融合或線粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)耦連來調(diào)節(jié)線粒體代謝。利用三維超高分辨率共聚焦顯微鏡（3D-SIM）和透射電鏡，研究者發(fā)現(xiàn)在Mfn2-/- CD8+TILs中，線粒體融合未受明顯影響，而線粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)耦連顯著下降。已知線粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)耦連能夠促進Ca2+離子向線粒體轉(zhuǎn)運，激活線粒體有氧代謝功能。
作者發(fā)現(xiàn)Mfn2-/- CD8+TILs中線粒體 Ca2+水平明顯降低；利用Ru360降低線粒體Ca2+水平可顯著抑制CD8+TILs的線粒體代謝和效應功能。這些結(jié)果初步表明，MFN2介導的線粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)耦連以及由此導致的線粒體Ca2+內(nèi)流對于CD8+ TILs的線粒體代謝和效應功能起著重要作用。
研究者進一步探究了MFN2經(jīng)典的促線粒體融合功能在CD8+ TILs中不占主導作用的原因。T細胞被腫瘤抗原激活后發(fā)生克隆增殖，而分裂的線粒體是T細胞增殖所需。作者發(fā)現(xiàn)T細胞活化后DRP1介導的線粒體分裂機器也隨之激活，抵消了MFN2的線粒體融合效果，從而使T細胞依賴MFN2介導的線粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)耦連來維持線粒體良好的有氧代謝功能（圖3）。
圖3.MFN2介導線粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)耦連調(diào)節(jié)線粒體代謝
MFN2介導線粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)耦連的機制仍不清楚。既往研究指出，MFN2可能存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的MFN2負責介導該過程。為了探究其背后的分子機制，作者首先進行細胞組分分析實驗，發(fā)現(xiàn)T細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上并無MFN2。
為了深入研究其背后分子機制，作者在昆蟲細胞中過表達全長MFN2蛋白并與T細胞裂解物孵育，利用Pulldown實驗聯(lián)用LC-MS/MS蛋白組技術(shù)鑒定了MFN2在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上潛在的互作蛋白—SERCA2；隨后應用免疫共沉淀、鄰近連接（PLA）試驗、活細胞3D成像、體外蛋白Pulldown實驗等技術(shù)手段，證實了MFN2和SERCA2的相互作用。研究者發(fā)現(xiàn)MFN2-SERCA2互作受MFN2 GTP酶活性和構(gòu)象變化的影響：MFN2點突變R94Q失去與SERCA2互作能力，而點突變R259A卻仍保留了該作用（圖4）。
圖4.MFN2通過與SERCA2互作介導線粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)耦連
作者進一步深入研究MFN2-SEACA2互作的生物學意義。通過體內(nèi)外酶活實驗和脂質(zhì)體GUV實驗，研究者發(fā)現(xiàn)，MFN2與SERCA2的互作可刺激SERCA2的Ca2+-ATP酶活性，從而將線粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)連接處的Ca2+回收到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，避免線粒體內(nèi)Ca2+過載，維持細胞線粒體鈣穩(wěn)態(tài)，避免T細胞凋亡。應用線粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)連接肽（mito-ER linker）模擬SERCA2-MFN2在線粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)耦連中的物理連接作用，作者發(fā)現(xiàn)相比野生型T細胞，Mfn2-/- T細胞予mito-ER linker回補線粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)耦連后線粒體Ca2+顯著過載，細胞凋亡增加，抗腫瘤功能下降。
最后，利用OT-I背景的Mfn2-/- T細胞進行慢病毒過表達回補和尾靜脈回輸，并結(jié)合MFN2具有不同SERCA2蛋白互作能力的點突變（特別是R94Q和R259A），作者深入論證了MFN2-SERCA2互作介導的線粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)耦連和線粒體Ca2+內(nèi)流對T細胞抗腫瘤功能的重要意義（圖5）。
圖5.MFN2-SERCA2互作介導線粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)耦連和線粒體Ca2+內(nèi)流影響T細胞抗腫瘤功能
鑒于MFN2對腫瘤微環(huán)境中CD8+T細胞的重要作用，作者探索靶向T細胞中MFN2的治療價值。利用原代腫瘤細胞制備的條件培養(yǎng)基（CM）模擬腫瘤微環(huán)境的營養(yǎng)條件，研究者發(fā)現(xiàn)CM可損害CD8+T細胞的MFN2表達、線粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)耦連、生存、線粒體代謝和效應功能；過表達MFN2則可增強CD8+T細胞對CM的適應能力。利用抗原特異性CD8+T細胞回輸重建免疫的腎透明細胞癌PDX（Patient-derived xenografts）小鼠、OT-I小鼠和C57BL/6小鼠模型，研究者發(fā)現(xiàn)靶向T細胞中MFN2可顯著增強T細胞的抗腫瘤功能，改善anti-PD-1治療的療效。
綜上所述，本文通過臨床標本驗證、單細胞測序、轉(zhuǎn)基因小鼠模型、細胞生物學和生化實驗等多種技術(shù)手段，深入論證了MFN2-SERCA2互作介導的線粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)細胞器互作對CD8+T細胞在腫瘤微環(huán)境中代謝適應和發(fā)揮抗腫瘤功能的重要作用，初步揭示了線粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)耦連潛在的分子機制。這些發(fā)現(xiàn)共同揭示了MFN2在調(diào)控CD8+ T細胞的代謝、功能和存活方面的關(guān)鍵作用，并表明增強MFN2的表達是改善免疫療法的一種有意義的途徑。這些研究成果可能有助于我們更好地理解腫瘤免疫學，并為癌癥患者的治療提供新的策略。
中山大學腫瘤防治中心、華南腫瘤學國家重點實驗室高嵩教授和韓輝教授，北京大學生物醫(yī)學前沿創(chuàng)新中心（BIOPIC）、生命科學學院白凡教授為論文的共同通訊作者。中山大學腫瘤防治中心楊杰鋒博士、羅麗博士，北京大學生物醫(yī)學前沿創(chuàng)新中心博士后邢旭東博士，中山大學附屬第一醫(yī)院研究生周昕煒為本文并列第一作者。
論文鏈接:
https://www.science.org/doi/10.1126/sciimmunol.abq2424
參考文獻：
【1】Wolchok, J. et al. (2021) Checkpoint blockade: The end of the beginning. Nat. Rev. Immunol. 21, 621
【2】Hegde, P. et al. (2020) Top 10 challenges in cancer immunotherapy. Immunity 52, 17ty
【3】Yu, Y. et al. (2020) Disturbed mitochondrial dynamics in CD8+ TILs reinforce T cell exhaustion. Nature Immunology 21(12), 1540-1551
【4】 DePeaux, K. et al. (2021) Metabolic barriers to cancer immunotherapy. Nat. Rev. Immunol. 21, 785. Im返回搜狐，查看更多
