基于藥物代謝組學(xué)的肝毒性生物標(biāo)志物研究進(jìn)展

來源

中國新藥與臨床雜志 2020年11月，第39卷 第11期

作者

向亞蘭，方平飛

中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院 藥學(xué)部

中南大學(xué)臨床藥學(xué)研究所

摘要

藥物的肝毒性一直是醫(yī)藥工作者關(guān)注的重點，新的肝毒性標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)對降低新藥開發(fā)成本和增強臨床用藥安全具有重要意義。藥物代謝組學(xué)作為代謝組學(xué)與藥學(xué)交叉結(jié)合的一門新興學(xué)科，在毒性標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)、疾病預(yù)測、個體化用藥方面扮演著十分重要的角色。本文結(jié)合藥物代謝組學(xué)的分析流程及最新研究成果，重點綜述支鏈氨基酸、肌酸、鞘氨醇、谷胱甘肽、酰基肉堿等肝毒性生物標(biāo)志物的研究進(jìn)展。

關(guān)鍵詞

代謝組學(xué)；生物標(biāo)記；化學(xué)性與藥物性肝損傷

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正文

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肝臟是藥物代謝處置中心，這使其極易成為毒性物質(zhì)的靶器官。肝毒性是多數(shù)藥物的不良反應(yīng)，是新藥臨床前安全性評估和臨床用藥的重點觀察指標(biāo)。對于新藥研發(fā), 肝毒性是終止Ⅰ期臨床試驗和藥物撤市的主要原因之一；同樣地，在臨床用藥過程中也常發(fā)生因缺乏肝毒性的早期監(jiān)測指標(biāo)而致肝損傷的情況，嚴(yán)重限制了許多藥物的臨床應(yīng)用。因此, 新藥研發(fā)和臨床安全用藥都迫切需要特異性強、靈敏度高的新型生物標(biāo)志物來準(zhǔn)確評價藥物的肝毒性, 既能有效控制研發(fā)風(fēng)險和減少研發(fā)成本，又能顯著增強臨床用藥安全。

傳統(tǒng)毒理學(xué)通常以生化指標(biāo)和組織病理學(xué)結(jié)果作為診斷肝毒性的終點，但生化數(shù)據(jù)往往靈敏度較低，且多數(shù)病變組織樣本難以獲得［1］。相較而言, 代謝組學(xué)可以在組織尚未發(fā)生明顯損傷之前，非侵入性地確定毒性生物標(biāo)志物［2］。近年來，代謝組學(xué)廣泛運用于毒性研究、疾病預(yù)測和療效評價。目前，利用代謝組學(xué)方法發(fā)現(xiàn)藥物肝毒性生物標(biāo)志物，并通過內(nèi)源性代謝物的改變揭示肝毒性的機制已成為國內(nèi)外的研究熱點。

代謝組學(xué)和藥物代謝組學(xué)

代謝組學(xué)作為“組學(xué)”領(lǐng)域的最新成員，是一種借助各種高通量技術(shù)分析內(nèi)源性小分子代謝物在遺傳、生物和環(huán)境共同作用下的集中變化的方法［3］。相較于其他組學(xué)，代謝組學(xué)有以下特點：第一，代謝物處于生物信息流的末端，其變化是各組學(xué)相互協(xié)調(diào)作用信息的最終體現(xiàn)，客觀反映了機體的整體變化；第二，代謝物的數(shù)量遠(yuǎn)少于基因和蛋白質(zhì)的數(shù)量，更利于分析與鑒定；第三，代謝分析研究中的生物標(biāo)志物可以從臨床前延續(xù)應(yīng)用至臨床，因為許多內(nèi)源性代謝物（如糖、氨基酸、脂類、類固醇和三酰甘油等）與物種無關(guān)，而基因和蛋白質(zhì)往往表現(xiàn)出物種間的差異［2］。

藥物代謝組學(xué)是代謝組學(xué)技術(shù)引入藥學(xué)領(lǐng)域發(fā)展出的一個分支，通過分析比較藥物干預(yù)前和干預(yù)后生物體代謝譜的差異，幫助評價和預(yù)測藥物的療效或毒性。

藥物代謝組學(xué)分析流程

藥物代謝組學(xué)的分析流程基本同代謝組學(xué)一樣，主要有實驗?zāi)Ｐ团c生物樣品的選取、生物樣品預(yù)處理、數(shù)據(jù)采集以及數(shù)據(jù)處理和分析等步驟［4］。

1

實驗?zāi)Ｐ团c生物樣品的選取

選擇合適的實驗?zāi)Ｐ秃蜕飿颖緦M學(xué)分析而言是關(guān)鍵的。實驗?zāi)Ｐ椭饕腥?、動物及?xì)胞?？紤]到基因多態(tài)性以及環(huán)境、飲食和生活方式等在人類受試者中差異很大，人一般只用于最后標(biāo)志物的臨床驗證階段，而細(xì)胞的代謝途徑在物種間高度保守，不具有普遍性［5］，因此，動物模型一般是首選。動物的各類型生物樣本的獲取較為容易，動物的給藥處理可操作性強、實驗條件易控制，動物的年齡、健康狀態(tài)等差異較人類受試者?。?］。代謝組學(xué)研究可以應(yīng)用于各種生物樣品，主要包括尿液、血液、唾液、腦脊液、細(xì)胞及組織提取液等生物體液，其中尿液和血液更易收集且處理簡單，因此最為常用。

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2

生物樣品預(yù)處理

為了盡量避免樣品中代謝物組成的改變，使原有代謝信息最大化，樣品處理應(yīng)遵循“最小，最好”的基本原則，即要求盡量少操作。在必要條件下，生物樣品預(yù)處理根據(jù)樣品類型、生化特性和研究目的做出相應(yīng)調(diào)整，但絕大多數(shù)樣品都需要基本的去除蛋白質(zhì)和鹽顆粒等程序。目前固相萃取和液液萃取是代謝組學(xué)中最常用的樣品處理方法 ［7］。相比于液液萃取，固相萃取能更有效地將分析物與干擾組分分離, 保留樣品中的代謝物。盡管如此，由于分析的局限性，一些代謝物仍然難以被檢測到。

3

數(shù)據(jù)采集

數(shù)據(jù)采集多借助核磁共振（NMR）、質(zhì)譜（MS）和色譜分析技術(shù)。其中NMR 技術(shù)具有快速、高通量和自動化分析程度高的優(yōu)點，且對極性化合物敏感，對樣本處理要求低。NMR 技術(shù)能為代謝物鑒定提供原子水平上的結(jié)構(gòu)信息，是其他方法難以比擬的［2］，但其靈敏度相對較低，不能在亞摩爾濃度下檢測代謝物。MS 在靈敏度和重現(xiàn)性方面比NMR 更有優(yōu)勢，通常與具有高分辨率的分離技術(shù)，如液相色譜或氣相色譜聯(lián)用，使MS 的應(yīng)用領(lǐng)域大為擴展。液質(zhì)聯(lián)用可分析不穩(wěn)定、不易衍生化、難揮發(fā)的代謝物，氣質(zhì)聯(lián)用選擇性好、數(shù)據(jù)庫較為健全，然而聯(lián)用技術(shù)也存在對極性代謝物缺乏保留、對許多非極性代謝物缺乏分辨率等缺點［8］。針對極性代謝物分離的方法，較常用的是親水性液相色譜法、毛細(xì)管電泳法和離子對反相色譜法等［9］。

4

數(shù)據(jù)處理與分析

對譜圖復(fù)雜、信息含量豐富的原始數(shù)據(jù)的處理與分析是代謝組學(xué)技術(shù)的關(guān)鍵。首先，原始譜圖經(jīng)預(yù)處理轉(zhuǎn)變?yōu)閿?shù)據(jù)矩陣，再采用多元統(tǒng)計分析對高維數(shù)據(jù)進(jìn)行降維。分析過程中最常采用的一種多元統(tǒng)計分析是模式識別，分為無監(jiān)督法和監(jiān)督法。其中，無監(jiān)督法能夠根據(jù)代謝成分的內(nèi)在相似性或差異性對樣本組別進(jìn)行分類［5］，并通過同源可視化技術(shù)直觀地呈現(xiàn)，包括主成分分析法（PCA）、非線性映射技術(shù)（NLM）和層次聚類分析（HCA）等。監(jiān)督法可用來建立類別間數(shù)學(xué)模型，實現(xiàn)對所有類型樣本的最佳分離，包括偏最小二乘判別分析（PLS-DA）和人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（ANN） 等。目前PCA 和PLS-DA相結(jié)合是代謝組學(xué)分析中最常用的模式識別方法［10］。最后可根據(jù)得分圖和變量預(yù)測重要度（VIP）值等篩選差異代謝物，并對所得差異代謝物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定和代謝通路分析。

肝毒性生物標(biāo)志物

肝臟是藥物代謝的主要場所，也是藥物損傷發(fā)生的主要器官。目前臨床用于評價肝損傷的主要指標(biāo)有丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）以及總膽紅素（TB）等，但這些傳統(tǒng)的生化指標(biāo)特異性不太理想，如當(dāng)肌肉和心臟發(fā)生損傷時，也可引起血清ALT 和AST水平升高。此外，肝酶水平與組織病變嚴(yán)重程度的相關(guān)性也較差［11］。藥物代謝組學(xué)的出現(xiàn)為肝毒性生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)和藥物肝毒性評價開辟了新渠道。

1

異亮氨酸、亮氨酸和纈氨酸

肝臟中富含與氨基酸代謝相關(guān)的酶，因此當(dāng)藥物引起肝損傷時，氨基酸代謝將會發(fā)生紊亂。其中，異亮氨酸、亮氨酸和纈氨酸是脂肪側(cè)鏈的標(biāo)準(zhǔn)氨基酸，稱為支鏈氨基酸（BCAAs）。以往研究顯示，BCAAs 的血清水平在紅霉素和補骨脂素誘導(dǎo)的肝毒性大鼠中發(fā)生顯著性變化，提示BCAAs 可能是肝毒性標(biāo)志物［12,13］。

2

利奈唑胺在重癥感染患者體內(nèi)的藥動學(xué)

肌酸是一種含氮有機酸，由精氨酸、甘氨酸和甲硫氨酸合成而來。肌酸作為機體的能量緩沖器，在能量供給中發(fā)揮著核心作用。當(dāng)機體的腺苷三磷酸（ATP）儲存量少，不足以維持身體能量需求時，它能迅速通過肌酸/ 磷酸肌酸系統(tǒng)增強細(xì)胞能量，磷酸肌酸可以可逆地將磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移至腺苷二磷酸（ADP），從而增加ATP 水平［14］。因此，在藥物肝毒性機制涉及到能量代謝的情況下，一般會出現(xiàn)肌酸水平的波動。在菊三七引起的肝毒性大鼠尿液中觀察到肌酸水平顯著升高［15］ , 印證了上述理論。

3

鞘氨醇

鞘氨醇是一種具有高度生物活性的代謝物，它不僅是細(xì)胞膜和脂蛋白的組成部分，還是細(xì)胞增殖分化、膜轉(zhuǎn)運、自噬和細(xì)胞死亡的調(diào)節(jié)因子。鞘氨醇在細(xì)胞核內(nèi)的積累可能導(dǎo)致肝細(xì)胞的凋亡，提示鞘脂代謝的波動可能與肝損傷有關(guān)［16］。LIU 等［17］采用高效液相色譜（HPLC）技術(shù)對經(jīng)大黃素、雷公藤甲素和馬兜鈴酸處理的肝細(xì)胞進(jìn)行代謝分析，結(jié)果顯示鞘氨醇、C16 鞘氨醇水平顯著升高，并和谷胱甘肽一起被鑒定為預(yù)測大黃素、馬兜鈴酸和雷公藤甲素誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷的有效工具。

4

谷胱甘肽

谷胱甘肽作為體內(nèi)重要的抗氧化劑，是一種由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成的三肽，在細(xì)胞內(nèi)合成后通過肝細(xì)胞外排作用分別轉(zhuǎn)運至膽汁和血液。其中，谷氨酸是合成谷胱甘肽的重要底物，可通過谷氨酰胺轉(zhuǎn)化而成，這種轉(zhuǎn)化對維持機體內(nèi)谷胱甘肽含量具有一定影響。谷胱甘肽的抗氧化作用是解毒的重要機制之一，它在發(fā)揮抗氧化作用的同時，自身會被氧化成氧化型谷胱甘肽，可通過測定血液和膽汁中谷胱甘肽含量或計算谷胱甘肽與氧化型谷胱甘肽的比值來評價肝毒性藥物引起的組織氧化應(yīng)激程度。但是，在不同類型的氧化應(yīng)激損傷中均可觀察到該指標(biāo)的變化，提示谷胱甘肽作為肝毒性標(biāo)志物的特異性不強［9］。因此，谷胱甘肽需要與其他肝毒性標(biāo)志物一起綜合運用，才有評價肝毒性的實際意義。

5

?；鈮A

肝細(xì)胞線粒體損傷是藥物導(dǎo)致肝毒性的主要機制之一。?；鈮A對維持正常肝功能具有重要作用，作為線粒體脂肪酸β- 氧化的特定底物，酰基肉堿可以幫助細(xì)胞將脂肪酸傳遞進(jìn)入線粒體［18］。當(dāng)線粒體功能損傷時，會導(dǎo)致?；鈮A大量累積，因此，?；鈮A作為肝毒性預(yù)測指標(biāo)具有較高的實用性。

6

尿 酸

尿酸是嘌呤代謝的最終氧化產(chǎn)物，其血清水平與血清肝酶水平的相關(guān)性較好，可以將其作為預(yù)測肝損傷的指標(biāo)之一。但是，尿酸與氧化應(yīng)激狀態(tài)緊密相關(guān)，具有抗氧化防御作用［19］，這也提示尿酸作為肝毒性標(biāo)志物的特異性較弱。

7

色氨酸

色氨酸也是一種必需氨基酸，在蛋白質(zhì)生物合成中起著重要的作用。由于大部分色氨酸在肝臟中代謝，多數(shù)藥物的肝毒性將會導(dǎo)致色氨酸代謝紊亂。WEI 等［11］報道，在藜蘆引起的肝毒性小鼠的肝臟代謝物中色氨酸含量顯著增加，推測可能與藜蘆引起的炎癥反應(yīng)激活吲哚胺-2，3- 二氧合酶有關(guān)。

8

丙氨酸

在肝毒性代謝物中，丙氨酸是最常被報道的標(biāo)志物之一，在超過40% 的肝毒性研究中，丙氨酸發(fā)生顯著性改變。但是，不同肝毒性藥物對丙氨酸的調(diào)節(jié)是不一致的，上調(diào)被描述為分解代謝反應(yīng)，而下調(diào)被解釋為自噬過程［9］。

9

?；撬岷湍懼嵯嚓P(guān)標(biāo)志物

牛磺酸作為細(xì)胞膜穩(wěn)定劑、抗氧化應(yīng)激劑和離子（如鈉、鉀、鈣和鎂）轉(zhuǎn)運促進(jìn)劑，參與了多項細(xì)胞活動。?；撬峥赏ㄟ^線粒體保護(hù)作用、抗纖維化特性、酶抑制和抗氧化等作用改善藥物誘導(dǎo)的急慢性肝損傷［20］。在雄黃所致的亞慢性肝毒性小鼠中，尿液中的?；撬岜徽J(rèn)為是肝毒性標(biāo)志物之一［21］。ZHAO 等［22］通過對小鼠血清和肝臟中代謝的分析，發(fā)現(xiàn)雷公藤甲素的肝毒性與?；撬?、次?；撬岬拇x有關(guān)，肝毒性模型組中?；撬崴降南抡{(diào)降低了其對雷公藤甲素誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和細(xì)胞調(diào)亡的保護(hù)作用。

膽汁酸是內(nèi)源性小分子，參與調(diào)節(jié)膽固醇平衡、脂質(zhì)溶解和新陳代謝。異常高濃度的膽汁酸在肝內(nèi)積聚，可引起肝損傷。因此，膽汁酸一直被認(rèn)為是肝損傷和肝功能障礙的高度敏感標(biāo)志物［23］。但是關(guān)于膽汁酸中具體某一種或幾種化合物與肝毒性的關(guān)系卻鮮有報道。TIAN 等［24］研究發(fā)現(xiàn)，血清和肝臟中?；悄懰幔═CA）、牛磺鵝去氧膽酸（TCDCA）以及?；?α- 鼠膽酸（T-α-MCA）這三者的濃度與ALP 水平具有良好的相關(guān)性（正相關(guān)），是梔子苷肝毒性的潛在標(biāo)志物。血清中膽汁酸類成分（如膽酸、甘氨膽酸、TCA、TCDCA、甘氨鵝去氧膽酸）水平的上調(diào)提示藥物肝毒性類型是膽汁淤積型［25］。

10

磷脂和膽堿相關(guān)標(biāo)志物

溶血卵磷脂（LysoPC）是一種重要的信號分子，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和炎癥反應(yīng)，在各種肝病中起著至關(guān)重要的作用［26］。相似地，廣泛存在于細(xì)胞中的膽堿也參與信號通路過程，而且膽堿的生物轉(zhuǎn)化（膽堿可以被磷酸化為磷酸膽堿，繼而合成磷脂酰膽堿）與肝功能損傷相關(guān)［27］。因此，如果代謝物中涉及膽堿、磷酸膽堿、磷脂酰膽堿以及LysoPC 濃度變化，均提示該藥物的肝毒性可能與磷脂和膽堿代謝紊亂有關(guān)，這4 種物質(zhì)均是在藥物代謝組學(xué)研究中常見的肝毒性標(biāo)志物。

代表性肝毒性生物標(biāo)志物信息匯總詳見表1。

小結(jié)與展望

藥物代謝組學(xué)作為一門新興的交叉學(xué)科，顯示出在肝損傷早期發(fā)現(xiàn)無創(chuàng)標(biāo)志物以及在藥物毒性研究中提供代謝途徑信息的潛力。新的特異、敏感的肝毒性生物標(biāo)志物將有助于改善藥物的開發(fā)模式，并為藥物毒性評價提供依據(jù)。

盡管藥物代謝組學(xué)技術(shù)在肝毒性生物標(biāo)志物的篩選和鑒定方面取得了不俗進(jìn)展，但大部分標(biāo)志物的特異性和靈敏性尚需進(jìn)一步確證。組學(xué)平臺前期的研究發(fā)現(xiàn)還需要在大量患者群體中進(jìn)行驗證后才能納入日常實踐，真正能轉(zhuǎn)化為可供臨床使用或取代傳統(tǒng)損傷指標(biāo)的新標(biāo)志物還很少。況且，生物代謝網(wǎng)絡(luò)極具復(fù)雜性，各個通路之間交互相關(guān)，依據(jù)單一標(biāo)志物往往難以做出準(zhǔn)確的毒性評價。因此，驗證新型標(biāo)志物和尋找標(biāo)志物之間的最佳組合可能會是今后研究的重點。同時，需將基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)整合起來綜合考量，使各個組學(xué)所提供的信息最大化，提高藥物毒性研究的效率。相信隨著對組學(xué)技術(shù)的深入研究和標(biāo)志物驗證工作的進(jìn)一步開展，新肝毒性生物標(biāo)志物將會盡早服務(wù)于藥物開發(fā)和臨床實踐。

參考文獻(xiàn)

詳見 中國新藥與臨床雜志 2020年11月，第39卷 第11期

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