摘要：α-酮酸是一種同時(shí)含有羧基和酮基的雙官能團(tuán)有機(jī)化合物，廣泛應(yīng)用于食品、藥品和化妝品等行業(yè)。為了滿足環(huán)境友好、安全高效和可持續(xù)發(fā)展的社會(huì)要求，利用酶轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)α-酮酸受到人們的廣泛關(guān)注。文中從酶的篩選、酶的改造以及酶的轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化3個(gè)方面介紹丙酮酸、α-酮戊二酸、酮亮氨酸、酮纈氨酸、苯丙酮酸和酮蛋氨酸酶法合成的研究狀況，并展望了α-酮酸進(jìn)一步高效生產(chǎn)的發(fā)展方向。

Quan Zhang1,3 , Wei Song1 , Can Zhang1 , Shanshan Pei1,2 , Xiulai Chen1 , Jia Liu1 , Qiuling Luo1,3 , Liming Liu1     

Abstract: Alpha-keto acid is a bifunctional organic compound containing both carboxyl and ketone groups, and widely applied in the industries of food, pharmaceutical and cosmetics. Based on the demand of eco-friendly process, safety and sustainable development, production of α-keto acids by enzymatic conversion technology has been paid more and more attention. In this article, we review the status of α-keto acids biosynthesis from three aspects: enzymatic screening, enzymatic modification and optimization of enzymatic conversion conditions. Meanwhile, we also indicate future research directions for further improving α-keto acids production.

酮酸是一類同時(shí)含有羧基和酮基的雙官能團(tuán)有機(jī)化合物。根據(jù)分子中羧基和酮基的相對(duì)位置可以將其分為α-酮酸和β-酮酸。其中α-酮酸包括丙酮酸、α-酮戊二酸、酮亮氨酸、酮纈氨酸、苯丙酮酸和酮蛋氨酸等。α-酮酸是有機(jī)藥物合成及生物合成的重要中間體，已廣泛用于食品、醫(yī)藥、化工和化妝品等領(lǐng)域。

目前，α-酮酸的生產(chǎn)技術(shù)主要可以分為化學(xué)合成法、微生物發(fā)酵法和酶轉(zhuǎn)化法3種?；瘜W(xué)合成法是指某些特定的化學(xué)物質(zhì)在苛刻的反應(yīng)條件下生成目標(biāo)產(chǎn)物，主要包括氧化法、水解法、雙羰基化法和海因法等，化學(xué)法以一氯戊烷和一氧化碳為底物，八羰基二鈷和鈀絡(luò)合物為催化劑在60 ℃條件下合成α-酮亮氨酸，轉(zhuǎn)化率達(dá)到了71.1%[1]。但是反應(yīng)過程中原料昂貴且復(fù)雜，工藝繁瑣，反應(yīng)條件苛刻不易被人們采用。發(fā)酵法指微生物直接發(fā)酵糖質(zhì)原料或其他碳源生成α-酮酸。但是采用直接發(fā)酵法生產(chǎn)某些α-酮酸時(shí)產(chǎn)量較低，底物轉(zhuǎn)化率低，比如α-酮亮氨酸的碳酸轉(zhuǎn)化率僅僅達(dá)到了0.17 g α-酮亮氨酸/g葡萄糖，難以滿足工業(yè)化的要求[2-3]。酶轉(zhuǎn)化法指利用微生物中某些酶高選擇性的催化性質(zhì)，將底物特定分子氨基酸催化轉(zhuǎn)化為價(jià)值更高的α-酮酸(圖 1)。在部分α-酮酸的合成過程中，酶轉(zhuǎn)化法與其他方法相比具有獨(dú)特的優(yōu)勢，比如高選擇性、高效性、無毒、低污染等特點(diǎn)。

圖 1 酶法轉(zhuǎn)化氨基酸合成α酮酸Fig. 1 Production of α-keto acids from amino acid by enzymatic conversion technology. PLP: Pyridoxal 5?-phosphate.

近年來，酶法轉(zhuǎn)化生產(chǎn)α-酮酸已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)，總結(jié)于表 1。本綜述以丙酮酸、α-酮戊二酸、酮亮氨酸、酮纈氨酸、苯丙酮酸和酮蛋氨酸為目標(biāo)產(chǎn)物，從酶的篩選、酶的改造以及酶的轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化3個(gè)方面詳細(xì)論述α-酮酸酶法合成的研究狀況，并對(duì)未來α-酮酸的高效生產(chǎn)進(jìn)行了展望。

表 1 酶轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)α-酮酸Table 1 Production of α-keto acids by enzymatic conversion technology

Product Substrate Enzyme Source of
enzyme Coenzyme Expressing
host Titer
(g/L) Conversion
rate (%) Reference Pyruvic acid L-alanine Mutant of L-amino
acid deaminase P. mirabilis FAD E. coli BL21 14.57 29.14 [4] α-ketoglutarate
acid L-glutamic acid L-amino acid
deaminase P. mirabilis FAD E. coli BL21 1.52 12.67 [5] α-ketoglutarate
acid L-glutamic acid L-amino acid
deaminase P. mirabilis
KCTC2566 FAD B. subtilis 168 4.65 31.00 [6] α-ketoglutarate
acid L-glutamic acid Mutant of L-amino
acid deaminase P. mirabilis
KCTC2566 FAD B. subtilis 168 10.08 83.30 [7] α-ketoglutarate
acid L-glutamic acid L-glutamate oxidase S. ghanaensis
ATCC14672 FAD E. coli BL21 104.70 96.10 [8] α-ketoglutarate
acid L-glutamic acid L-glutamate
oxidase S. ghanaensis
ATCC14672 FAD E. coli BL21 127.20 97.00 [9] α-ketoglutarate
acid L-glutamic acid L-glutamate
oxidase,
Catalase-peroxidase S. ghanaensis
ATCC14672,
E. coli W3110 FAD E. coli BL21 103.10 94.60 [10] α-ketoisocaproate L-leucine L-amino acid
deaminase R. opacus
DSM 43250 FAD NR 1.27 NR [11] α-ketoisocaproate L-leucine L-amino acid
deaminase P. mirabilis FAD E. coli BL21 61.50 95.70 [12] α-ketoisocaproate L-leucine Mutant of L-amino
acid deaminase P. mirabilis FAD E. coli BL21 106.20 97.70 [13] α-ketoisocaproate L-leucine L-amino acid
deaminase P. vulgaris FAD E. coli BL21 86.55 94.25 [14] α-ketoisovalerate L-valine L-amino acid
deaminase P.
myxofaciens FAD E. coli BL21 8.197 72.54 [15] α-ketoisovalerate L-valine L-amino acid
oxidase C.
glutamicum FAD E. coli BL21 51.00 79.10 [16] α-ketoisovalerate L-valine Mutant of Lamino
acid oxidase C.
glutamicum FAD E. coli BL21 54.60 84.60 [17] Phenylpyruvate L-phenylalanine Mutant of L-amino
acid deaminase P. mirabilis
KCTC2566 FAD E. coli BL21 72.50 96.67 [18] Phenylpyruvate L-phenylalanine Mutant M5
optimized by codon P. mirabilis
KCTC2566 FAD E. coli BL21 83.00 98.20 [19] α-keto-γ-
methylthiobutyric
acid L-methionine L-amino acid
oxidase optimized
by codon R.
erythropolis FAD E. coli BL21 95.18 95.84 [20]NR: not reported.

1 丙酮酸

丙酮酸(Pyruvic acid, PA)又稱α-氧代丙酸，是在α碳上含有羰基的三碳一羧酸化合物，分子式為C3H4O3，相對(duì)分子質(zhì)量為88.06。丙酮酸是許多酶催化的中間代謝物，參與體內(nèi)的TCA循環(huán)，對(duì)于維持體內(nèi)的氧化還原狀態(tài)也發(fā)揮重要的作用，此外，丙酮酸還是一種重要的工業(yè)原料[21]。

1.1 酶的篩選

酶轉(zhuǎn)化法合成丙酮酸的底物包括乳酸和丙氨酸。當(dāng)以乳酸為底物時(shí)，涉及的酶包括L-乳酸氧化酶(L-lactate oxidase，LOD，EC 1.1.3.2)、乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase，LDH，EC 1.1.1.27)和乙醇酸氧化酶(Glycolate oxidase，GO，EC 1.1.3.15)。谷勁松等從土壤樣品中富集、篩選和純化獲得乳酸氧化酶的菌株SM-10#、SM-29#、SM-14#，總酶活力為1 469.50、1 310.64、1 103.55 U/mL。LDH借助輔酶的氧化型或還原型(NAD+或NADH)在糖酵解過程中參與乳酸和丙酮酸的可逆轉(zhuǎn)化[22]。郁書懷在乳酸片球菌Pediococcus acidilactici和戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus中克隆LDH基因并在E. coli中實(shí)現(xiàn)了表達(dá)，對(duì)丙酮酸的比活性分別為422.1和835 U/mg，Kcat/Km值分別為3 157和658 mmol/(L·S)[23]。趙婷從副干酪乳桿菌Lactobacillus paracasei W2中克隆了LDH基因，表達(dá)成功后對(duì)丙酮酸具有較高的酶活性[24]。乙醇酸氧化酶能將乳酸氧化為丙酮酸，并伴隨過氧化氫的生成，此過程以FMN為輔酶，氧氣作為最終的電子受體[25]。Amy利用多形漢遜酵母Hansenula polymorpha和畢赤酵母Pichia pastoris分別表達(dá)來源于菠菜的乙醇酸氧化酶。當(dāng)pH為8.0時(shí)，乙醇酸氧化酶活性最高，L-乳酸和丙酮酸對(duì)應(yīng)的pKa分別為3.79和2.49，并且發(fā)現(xiàn)L-乳酸不會(huì)對(duì)該酶產(chǎn)生抑制效應(yīng)，而底物丙酮酸會(huì)抑制該酶的活性[25]。

當(dāng)以丙氨酸為底物時(shí)，主要包括L-丙氨酸脫氫酶(Alanine dehydrogenase，ALDH，EC 1.4.1.1)、L-氨基酸脫氨酶和氨基酸氧化酶。研究表明，來源于產(chǎn)氣腸桿菌Enterobacter aerogenes的丙氨酸脫氫酶分別以丙氨酸和丙酮酸為底物進(jìn)行催化反應(yīng)時(shí)，最適pH為10.9和8.7。對(duì)丙氨酸、NAD+、丙酮酸、NADH和氨的Km值分別為0.47、0.16、0.22、0.067和66.7 mmol/L[26]。L-氨基酸脫氨酶催化的氧化脫氨反應(yīng)主要是酶與細(xì)胞膜上電子傳遞鏈相關(guān)，電子經(jīng)過電子傳遞鏈傳遞給細(xì)胞色素氧化酶，使分子氧還原為水，生成α-酮酸和氨[27]。L-氨基酸氧化酶是利用分子氧直接氧化還原型的FAD，再生成氧化型的FAD，生成過氧化氫、α-酮酸和氨[28]。

1.2 酶的表達(dá)與改造

2016年，Hossain等以大腸桿菌Escherichia coli BL21 (DE3)為表達(dá)宿主，表達(dá)來自奇異變形桿菌Proteus mirabilis的L-氨基酸脫氨酶基因pm1，構(gòu)建了重組菌株pET-20b(+)-pm1 (E. coli BL21)，丙氨酸經(jīng)過全細(xì)胞轉(zhuǎn)化丙酮酸的產(chǎn)量達(dá)到了1.14 g/L[4]。為了阻斷丙氨酸和丙酮酸的去路，敲除了基因cycA、amaP和lldP，丙酮酸的產(chǎn)量進(jìn)一步得到提高，達(dá)到了5.38 g/L。為了提高轉(zhuǎn)氨酶的催化效率，Hossain等對(duì)pm1進(jìn)行了定向進(jìn)化，經(jīng)過3輪易錯(cuò)PCR，得到了突變體pm1ep3，使得丙酮酸的產(chǎn)量達(dá)到了14.57 g/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)到了29.14%[4]。該突變體對(duì)L-丙氨酸的親和力(Km)和催化效率(Kcat/Km)分別提高至6.76 mmol/L和0.085 mmol/(L·s)。上述結(jié)果表明，酶轉(zhuǎn)化技術(shù)結(jié)合定向進(jìn)化策略和代謝工程策略可以顯著提高丙酮酸的產(chǎn)量。Simona等將來源于紅酵母Rhodotorula gracilis的氨基酸氧化酶用于丙氨酸的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，最終轉(zhuǎn)化率達(dá)到了90%以上[29]。

乳酸脫氫酶可以催化乳酸生成丙酮酸。Ping Xu課題組以假單胞桿菌Pseudomonas stutzeri SDM為出發(fā)菌株，以25.5 g/L的D/L-乳酸為底物，轉(zhuǎn)化24 h，丙酮酸的產(chǎn)量達(dá)到了22.6 g/L，轉(zhuǎn)化率高達(dá)88.6%[30]。

2 α-酮戊二酸

α-酮戊二酸(α-ketoglutaric acid, α-KG)是戊二酸的兩種含酮基衍生物中的一種，分子式為C5H6O5，相對(duì)分子質(zhì)量為146.1。α-KG是連接微生物細(xì)胞碳-氮代謝的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，是微生物三羧酸循環(huán)中重要的代謝中間物，在氨基酸形成和氮轉(zhuǎn)運(yùn)中扮演著重要的角色[31]。α-KG作為保健品原料，增加蛋白質(zhì)的合成，作為飼料添加劑可以緩解免疫性應(yīng)激對(duì)畜牧氨基代謝的影響[32]。

2.1 酶的篩選

以L-谷氨酸為底物酶法合成α-KG的酶包括谷氨酸脫氫酶(Glutamate dehydrogenase，GDH)、L-氨基酸脫氨酶(L-amino acid deaminase)和L-谷氨酸氧化酶(L-glutamate oxidase，LGOX，EC：1.4.3.11)。Paul等以黃化瘤胃球菌Ruminococcus flavefaciens FD1為出發(fā)菌株，純化并研究了谷氨酸脫氫酶(EC：1.4.1.4)的性質(zhì)，該酶以NADP+輔酶，在0.5 mol/L KCl溶液中的最適pH為6.9–7.0，對(duì)NH3、α-KG、谷氨酸的Km值分別為19、0.41、62 mmol/L[33]。此外，張克旭等研究了天津短桿菌T6-13谷氨酸脫氫酶的特性，研究表明，該酶對(duì)還原型輔酶Ⅱ(NADPH)、α-KG、NH3、谷氨酸的Km值分別為0.076、3.23、4.0、120.48 mmol/L。并且該酶受反應(yīng)產(chǎn)物的抑制，正反應(yīng)受NADPH、α-KG和NH4+的抑制，逆反應(yīng)受NADP+和谷氨酸的抑制[34]。

LGOX是一種核黃素酶，是以FAD為輔酶，在不添加外源性輔助因子的條件下，專一性地將L-谷氨酸氧化脫氨，生成氨、α-KG和過氧化氫。研究者測定了來源于鏈霉菌屬Streptomyces endus、Streptomyces sp. 18G和Streptomyces sp. X-119-6的LGOX的生化特性[35-37]。LGOX的蛋白大小分別為90、120、77 kDa，比酶活分別為0.0024、0.15、0.056 U/mL。來源于Streptomyces endus的LGOX Km值最大為1.1 mmol/L。Amina等還對(duì)Streptomyces sp. X-119-6中的LGOX晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)其蛋白活性部位在蛋白中心、底物和產(chǎn)物進(jìn)出通道較窄，并且活性部位殘基不同造成底物專一性強(qiáng)[38]。

2.2 酶的表達(dá)與改造

2014年，Hossain等以枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis 168和E. coli BL21 (DE3)為表達(dá)宿主，表達(dá)來自P. mirabilis KCTC2566的L-氨基酸脫氨酶基因pmAAD，構(gòu)建了重組菌株pHT43-pmAAD (B. subtilis)和pET-20b(+)-pmAAD (E. coli BL21)。通過以L-谷氨酸為底物進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化24 h，重組菌株pHT43-pmAAD (B. subtilis)轉(zhuǎn)化率優(yōu)于pET-20b(+)-pmAAD (E. coli BL21)，α-KG產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率分別達(dá)到了4.65 g/L和31%[6]，其原因可能是B. subtilis可以去除錯(cuò)誤折疊和不完整的蛋白來促進(jìn)高質(zhì)量蛋白的合成。為了提高pmAAD的催化效率，Hossain等在前期的基礎(chǔ)上對(duì)pmAAD進(jìn)行蛋白質(zhì)工程改造。首先，通過易錯(cuò)PCR手段確定了影響催化效率的6個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)，分別為F110、A255、E349、R228、T249和I352，隨后，采用定點(diǎn)飽和突變的方法將6個(gè)位點(diǎn)分別突變?yōu)镕110I、A255T、E349D、R228C、T249S和I352A，α-KG的產(chǎn)量從之前的4.65 g/L提高到了10.08 g/L，轉(zhuǎn)化率從31%提高到了83.25%，此時(shí)，酶的親和效率也有所提高(Km值從49.21 mmol/L降低到了23.58 mmol/L)[7]。最后，Hossain等采用Cre/lox無痕敲除系統(tǒng)阻斷了B. subtilis中α-KG的降解路徑，α-KG的產(chǎn)量得以提高，達(dá)到了12.21 g/L。上述研究表明，蛋白質(zhì)工程改造技術(shù)能夠增強(qiáng)底物特異性和催化速率，進(jìn)而提高α-KG的產(chǎn)量。

利用LGOX催化L-谷氨酸生成α-酮戊二酸的過程會(huì)產(chǎn)生大量的H2O2，該副產(chǎn)物不僅能影響菌體的生長還能抑制LGOX的活性，進(jìn)而影響轉(zhuǎn)化反應(yīng)的進(jìn)行，常常需要通過外源添加過氧化氫酶才能夠保證轉(zhuǎn)化反應(yīng)的順利進(jìn)行，此舉提高了原料的成本。因此如何解決H2O2的添加問題成為酶法轉(zhuǎn)化生產(chǎn)α-酮戊二酸的關(guān)鍵問題之一。為了解決上述H2O2積聚問題，Wu等將來源于E. coli K12 W3110的過氧化氫酶基因katG異源表達(dá)于E. coli BL21 (DE3)中，并結(jié)合重組酶LGOX和KatG的生化性質(zhì)，從轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平構(gòu)建了LGOX和KatG共表達(dá)菌株[10]。在轉(zhuǎn)錄水平上，以pET28a為表達(dá)載體設(shè)定了3種不同策略構(gòu)建共表達(dá)菌株F008、FXC008、FXC009，分別為：策略一，采用單啟動(dòng)模式將LGOX和KatG串聯(lián)表達(dá)，兩個(gè)酶分別帶有相同的RBS序列；策略二，采用雙啟動(dòng)子模式于LGOX和KatG前面添加同樣的啟動(dòng)子及相關(guān)序列；策略三，采用單啟動(dòng)子模式將LGOX和KatG通過Hind Ⅲ直接串聯(lián)在一起。結(jié)果發(fā)現(xiàn)F008更有利于α-KG的生產(chǎn)[10]。隨后，對(duì)單啟動(dòng)子雙酶串聯(lián)表達(dá)菌株中KatG基因前的SD序列與ATG之間的間隔進(jìn)行了優(yōu)化，分別間隔3、6、9、12 bp，獲得重組菌株FXC003、FXC004、FXC005、FXC006，重組菌株FXC005產(chǎn)酶效果和轉(zhuǎn)化效果最優(yōu)，α-KG產(chǎn)量達(dá)到了86.7 g/L，轉(zhuǎn)化率為79.6%[10]。在翻譯水平上，通過預(yù)測合適起始翻譯速率的RBS序列以提高KatG有效表達(dá)量，構(gòu)建重組菌株F006。重組菌株F006 α-KG產(chǎn)量達(dá)到了103.1 g/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)到了94.6%，實(shí)現(xiàn)了不添加過氧化氫酶高效生產(chǎn)α-酮戊二酸[10]。上述結(jié)果表明，借助啟動(dòng)子工程策略優(yōu)化多酶級(jí)聯(lián)催化反應(yīng)可以平衡H2O2的合成與消耗問題，從而提高α-KG的產(chǎn)量。

2.3 酶的轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化

在轉(zhuǎn)化體系中添加過氧化氫酶解除過氧化氫對(duì)LGOX的抑制作用。牛盼清等通過優(yōu)化底物L(fēng)-谷氨酸的濃度與H2O2酶的添加量，發(fā)現(xiàn)當(dāng)L-谷氨酸濃度與H2O2酶酶活的最適比例為12:5 (g:kV)，此時(shí)α-KG產(chǎn)量為32.9 g/L，較優(yōu)化前提高了126.9%[39]。此外，Mn2+對(duì)LGOX有激活作用，牛盼清等研究了在轉(zhuǎn)化過程中不同濃度的Mn2+對(duì)α-KG產(chǎn)量的影響。研究表明，當(dāng)MnCl2的添加量為5 mmol/L時(shí)，轉(zhuǎn)化24 h，α-KG產(chǎn)量達(dá)到最高38.1 g/L，較未添加Mn2+提高了15.8%[39]。樊祥臣也研究了Mn2+濃度對(duì)α-KG產(chǎn)量的影響，當(dāng)Mn2+濃度為1 mmol/L時(shí)，結(jié)合正交實(shí)驗(yàn)最優(yōu)的結(jié)果，轉(zhuǎn)化24 h，α-KG的產(chǎn)量達(dá)到最大值127.2 g/L，轉(zhuǎn)化率為97.0%[9]。

3 酮亮氨酸

α-酮異己酸(α-ketoisocaperate, KIC)又名α-酮亮氨酸，是亮氨酸的前體物質(zhì)，分子式為C6H10O3，相對(duì)分子質(zhì)量為130.14。α-酮亮氨酸作為生理必需物質(zhì)，對(duì)氨基酸代謝具有平衡和刺激的作用，同時(shí)α-酮亮氨酸也可以作為氨基酸的替代物質(zhì)，降低生物體內(nèi)的氮代謝負(fù)擔(dān)。在臨床中，α-酮亮氨酸飲食療法治療肝腎病患者體內(nèi)代謝的紊亂，保健品中可作為運(yùn)動(dòng)補(bǔ)充劑提高健身效果。在動(dòng)物飼料中，適量加入α-酮亮氨酸可以提高飼料轉(zhuǎn)化率，促進(jìn)蛋白質(zhì)積累與家畜生長，提高動(dòng)物免疫力。

3.1 酶的篩選

以L-亮氨酸為底物催化合成α-酮亮氨酸的酶為L-氨基酸脫氨酶，是一類以FAD為輔酶的黃素蛋白，可以催化L-亮氨酸脫氨形成α-酮亮氨酸和氨。L-氨基酸脫氨酶來源廣泛，包括蛇毒、不透明紅球菌、鏈霉菌和變形桿菌等。其中，結(jié)構(gòu)功能研究最徹底的來源于蛇毒的L-氨基酸脫氨酶難以異源表達(dá)，不利于工業(yè)化制備和應(yīng)用，來源于紅球菌的L-氨基酸脫氨酶將氨基酸脫氨后會(huì)形成過氧化氫，并且生產(chǎn)周期較長，也不適合制備α-酮亮氨酸。因此，來源于變形桿菌的L-氨基酸脫氨酶定位在細(xì)胞膜上，采用非典型的脫氨機(jī)制將L-亮氨酸脫氨成α-酮亮氨酸具有非常大的優(yōu)勢。然而，來源于不同變形桿菌的L-氨基酸脫氨酶對(duì)底物L(fēng)-亮氨酸的轉(zhuǎn)化效率也存在著差異，來自P. myxofaciens的L-氨基酸脫氨酶(Ladf)的轉(zhuǎn)化效率為99.2%[40]，來自P. mirabillis的L-氨基酸脫氨酶(Pma、Pml)的轉(zhuǎn)化效率卻只有41.7%和7.6%[41-42]。宋陽測定了P. vulgaris來源的L-氨基酸脫氨酶的酶學(xué)性質(zhì)，Km為17.71 mmol/L，(max為1.62 μmol/(L·min·mg)，Kcat值為1.41 s–1[43]。

3.2 酶的表達(dá)與改造

2011年，Zhu等首次利用不透明紅球菌Rhodococcus opacus DSM 43250自身合成L-氨基酸脫氨酶催化L-亮氨酸合成α-酮亮氨酸，并且取得了成功，采用響應(yīng)面分析的方法對(duì)菌體培養(yǎng)條件和轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化后，α-酮亮氨酸的產(chǎn)量達(dá)到了1.27 g/L[11]。為了提高α-酮亮氨酸的產(chǎn)量，研究者們選擇了變形桿菌屬來源的L-氨基酸脫氨酶。Song和劉立明分別將來源于普通變形桿菌和奇異變形桿菌的L-氨基酸脫氨酶克隆至表達(dá)載體pET-28a上，轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主E. coli BL21(DE3)后均能檢測到L-氨基酸脫氨酶的活性[12-14]。

為了進(jìn)一步提高L-氨基酸脫氨酶的表達(dá)量，Song等對(duì)其轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平進(jìn)行了調(diào)控，通過對(duì)非編碼區(qū)的RBS序列優(yōu)化控制翻譯的起始速率，通過改變質(zhì)?？截悢?shù)影響轉(zhuǎn)錄水平，α-酮亮氨酸的產(chǎn)量得到了大幅度的提高，達(dá)到了86.55 g/L[14]。雖然α-酮亮氨酸的產(chǎn)量得到了大幅度的提高但是其轉(zhuǎn)化率為94.25%，還有進(jìn)一步上升的空間。針對(duì)上述轉(zhuǎn)化率低的問題，劉立明課題組對(duì)L-氨基酸氧化酶進(jìn)行了蛋白質(zhì)工程改造，首先在奇異變形桿菌L-氨基酸脫氨酶同源建模的基礎(chǔ)上，通過分析確定了突變位點(diǎn)T436A，突變體T436A α-酮亮氨酸的產(chǎn)量達(dá)到了106.2 g/L，轉(zhuǎn)化率為97.7%，此突變體T436對(duì)L-亮氨酸的催化效率較原L-氨基酸脫氨酶提高了72.7%[13]。此研究工作增強(qiáng)了α-酮亮氨酸的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

3.3 酶的轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化

在大腸桿菌細(xì)胞中存在兩種亮氨酸的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。高親和性的分支氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)LivFGHMJ和LivFGHMK是細(xì)胞膜上的ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)家族的組成部分。LivJ可轉(zhuǎn)運(yùn)亮氨酸、纈氨酸和異亮氨酸3種支鏈氨基酸，LivK專一性地轉(zhuǎn)運(yùn)L-亮氨酸，BrnQ需要鈉離子梯度電勢。因此，為了減少L-亮氨酸的轉(zhuǎn)運(yùn)，宋陽等采用不同濃度的轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑3-羰基氰酯(Cyanide-3-chlorophenylhydrazone, CCCP)抑制livK、livJ和BrnQ的轉(zhuǎn)運(yùn)效率，提高了酶的轉(zhuǎn)化效率。但是CCCP價(jià)格昂貴，未來可以通過基因敲除的策略敲除livK和BrnQ基因以降低生產(chǎn)成本[43]。

4 酮纈氨酸

α-酮異戊酸(α-ketoisovalerate, α-KIV)又名酮纈氨酸，是纈氨酸的前體物質(zhì)，分子式為C5H8O3，相對(duì)分子質(zhì)量為116.12。作為支鏈酮酸的一種，α-酮異戊酸是重要的中間體，它主要應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域。在飼料內(nèi)加入酮纈氨酸可以促進(jìn)家畜的肌肉生長。同時(shí)α-酮酸具有降低腎過濾壓力的效果，可用于治療慢性尿毒癥和氮代謝的相關(guān)疾病。

4.1 酶的篩選

以L-纈氨酸為底物酶轉(zhuǎn)化法合成酮纈氨酸所用的酶包括氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶、L-氨基酸氧化酶和L-氨基酸脫氨酶。氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶通常以α-酮戊二酸和纈氨酸為底物生成對(duì)應(yīng)的酮纈氨酸和谷氨酸，該方法添加α-酮戊二酸增加了成本，副產(chǎn)物谷氨酸的出現(xiàn)增加了后續(xù)的純化分離步驟，因此，研究者更傾向于選擇L-氨基酸氧化酶和L-氨基酸脫氨酶。然而，文獻(xiàn)報(bào)道L-氨基酸脫氨酶和L-氨基酸氧化酶催化L-纈氨酸生成α-酮纈氨酸的催化效率都比較低[41-42]。吳靜等選取的L-氨基酸氧化酶的催化效率是目前文獻(xiàn)中報(bào)道最高的，達(dá)到了84.6%[17]。

4.2 酶的表達(dá)與改造

Li等在E. coli BL21(DE3)中建立了酶轉(zhuǎn)化體系合成酮纈氨酸。表達(dá)來自P. myxofaciens的L-氨基酸脫氨酶基因ladf，構(gòu)建了重組菌株E. coli BL21 (ladf)，為了提高底物L(fēng)-纈氨酸的利用率，繼續(xù)敲除了細(xì)胞膜支鏈氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因livF和氨基酸轉(zhuǎn)氨酶基因ilvE，得到了重組菌株E. coli BL21 (△livF△ilvE, ladf)，此菌株以5 g/L的L-纈氨酸為底物進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)得到了0.585 g/L的酮纈氨酸[15]。吳靜等同樣以E. coli BL21作為表達(dá)宿主表達(dá)L-氨基酸氧化酶，構(gòu)建了重組菌株E. coli BL21-LAAO，α-酮纈氨酸的產(chǎn)量最高可達(dá)51 g/L，轉(zhuǎn)化率為79.1%。

為了提高L-氨基酸脫氨酶的催化效率，Li等借助了蛋白質(zhì)工程改造技術(shù)對(duì)L-氨基酸脫氨酶進(jìn)行了改造[15]。首先，根據(jù)同源建模和分子對(duì)接分析確定了4個(gè)關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)F318、R316、N100和Q276，然后對(duì)這4個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行飽和突變得到最優(yōu)單突變體F318T。在此基礎(chǔ)之上，對(duì)F318T進(jìn)行N100飽和突變，得到最優(yōu)突變體N100H，其轉(zhuǎn)化效率比F318T提高了28.24%；最后在F318T/N100H的基礎(chǔ)上對(duì)Q276進(jìn)行飽和突變，三突變體F318T/N100H/Q276E的產(chǎn)量為8.197 g/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)到72.54%，轉(zhuǎn)化時(shí)間縮短至10 h[15]。上述研究中對(duì)L-氨基酸脫氨酶的改造工作一定程度上提高了酶的催化效率。

4.3 酶的轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化

在酶催化過程中酶的轉(zhuǎn)化效率會(huì)受到溫度、pH、金屬離子、催化劑濃度的影響，甚至反應(yīng)體系的大小也會(huì)影響酶催化的效率。Li等[15]和吳靜等[16]分別對(duì)轉(zhuǎn)化溫度、轉(zhuǎn)化pH和金屬離子進(jìn)行了優(yōu)化。重組菌株E. coli (pET20b-ladf，△livF△ilvE)全細(xì)胞轉(zhuǎn)化L-纈氨酸的最優(yōu)轉(zhuǎn)化條件為pH 6.5、底物濃度為100 mmol/L、菌體量為10 g/L DCW細(xì)胞，轉(zhuǎn)化12 h，α-酮異戊酸的產(chǎn)量達(dá)到了1.49 g/L[15]。重組菌株E. coli BL21-LAAO的最優(yōu)轉(zhuǎn)化條件為25 ℃、pH 8.0、菌體量為30 g/L濕菌體，轉(zhuǎn)化24 h，α-酮異戊酸的產(chǎn)量最高可達(dá)51 g/L，轉(zhuǎn)化率為79.1%，大幅度提高了生產(chǎn)效率，實(shí)現(xiàn)了L-纈氨酸向α-酮纈氨酸的高效合成[16]。

5 苯丙酮酸

α-苯丙酮酸(Phenylpyruvic acid, PPA)是一種含有雙羰基的多功能有機(jī)酸，分子式為C9H8O3，相對(duì)分子質(zhì)量為164.16。PPA作為苯丙氨酸合成的原材料，苯丙氨酸是合成手性藥物的重要中間體。

5.1 酶的篩選

D-氨基酸氧化酶以D-苯丙氨酸為底物催化合成苯丙酮酸，D-氨基酸氧化酶主要來源于三角酵母、畢赤酵母和紅酵母。此外，以L-苯丙氨酸為底物催化合成苯丙酮酸的酶包括苯丙氨酸脫氫酶、氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶和L-氨基酸脫氨酶。對(duì)于氨基酸脫氫酶，需要構(gòu)建輔酶NAD+再生系統(tǒng)。而且苯丙氨酸脫氫酶一般屬于胞內(nèi)酶，構(gòu)建全細(xì)胞催化劑后，不利于底物和酶的結(jié)合。L-氨基酸脫氨酶反應(yīng)只需一種氨基酸參與反應(yīng)，無需外源添加輔酶或構(gòu)建輔酶再生系統(tǒng)。因此，L-氨基酸脫氨酶成為催化苯丙酮酸的最佳選擇。L-氨基酸脫氨酶的來源主要包括鏈霉屬、變形桿菌屬和紅球菌屬。鏈霉菌屬來源的L-氨基酸脫氨酶具有底物專一性，對(duì)L-谷氨酸表現(xiàn)出較高的催化活性，紅球菌屬的L-氨基酸脫氨酶(L-AAO)對(duì)L-苯丙氨酸的轉(zhuǎn)化效率為53%[45]，然而變形桿菌來源的L-氨基酸脫氨酶(Pma)的催化效率為100%[41]，其突變體M5的Km值為33 mmol/L，較野生型的Pma提高了20.88%。

5.2 酶的表達(dá)與改造

Pantaleone課題組建立了酶法生產(chǎn)苯丙酮酸的路徑，在大腸桿菌異源表達(dá)來自P. mirabilis KCTC2566的L-氨基酸脫氨酶，通過優(yōu)化條件(菌體添加量、底物投量等)，最終苯丙酮酸的產(chǎn)量提高至42.50 g/L，轉(zhuǎn)化率為85%[46]。但是，隨著PPA產(chǎn)量的提高，對(duì)L-氨基酸脫氨酶有很強(qiáng)的產(chǎn)物抑制，導(dǎo)致產(chǎn)量無法進(jìn)一步提高。產(chǎn)物抑制的原因主要是產(chǎn)物釋放慢，產(chǎn)物與底物競爭性結(jié)合催化位點(diǎn)。劉佳等應(yīng)用構(gòu)象動(dòng)力學(xué)思想，從產(chǎn)物周圍的loop結(jié)構(gòu)入手，調(diào)節(jié)對(duì)結(jié)構(gòu)影響較小的loop上的氨基酸，從而增大產(chǎn)物結(jié)合位點(diǎn)的構(gòu)象動(dòng)力學(xué)，促進(jìn)產(chǎn)物釋放，減弱產(chǎn)物抑制，達(dá)到提高產(chǎn)量的目的[18]。首先，通過對(duì)酶結(jié)構(gòu)的分析選擇了18個(gè)氨基酸位點(diǎn)(Y103、T105、S106、D144、E145、R315、I316、F317、E340、L341、V411、S412、T414、F415、E417、T434、T436、V437)，將其突變?yōu)楸彼?，?gòu)建單點(diǎn)突變庫，突變體T105、S412、E417、E340和E145的轉(zhuǎn)化能力得到提高；隨后，采用組合突變的策略，對(duì)上述5個(gè)有益突變進(jìn)行組合突變，構(gòu)建了部分雙突變體、三突變體、四突變體和五突變體，得到最佳的五突變體為M5 (T105A、S412A、E417A、E340A、E145A)，M5的苯丙酮酸的產(chǎn)量最高，達(dá)到了72.5 g/L，此時(shí)底物轉(zhuǎn)化率為96.67%[18]。楊彬等測定了突變體M5的產(chǎn)物抑制常數(shù)和動(dòng)力學(xué)參數(shù)，產(chǎn)物抑制常數(shù)KPI提高到了86.6 g/L，較野生型提高了3.7倍。Kcat值比野生型增加了2倍，催化效率(Kcat/Km)也有所增加，是野生型的1.6倍[47]。

5.3 酶的轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化

Hou等將來自P. mirabilis KCTC 2566中的L-氨基酸脫氨酶基因克隆至pET-20b(+)并且成功轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主E. coli BL21(DE3)中，研究了溫度、pH、酶濃度、底物濃度、金屬離子(Ba+、Mg2+、Li+、Ca2+、Zn2+等)、輔酶FAD的濃度對(duì)全細(xì)胞轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸生成苯丙酮酸的影響。條件優(yōu)化后，轉(zhuǎn)化2.5 h，苯丙酮酸的產(chǎn)量達(dá)到最大值，為2.7 g/L，底物轉(zhuǎn)化率為86.7%[48]。同時(shí)，Hou等繼續(xù)研究了兩階段全細(xì)胞轉(zhuǎn)化，即生長態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化和靜止態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，建立了兩階段溫度控制策略，最終在3-L罐上苯丙酮酸的產(chǎn)量為77.6 g/L，苯丙氨酸的轉(zhuǎn)化率為99.3%[49]。劉佳等對(duì)L-氨基酸脫氨酶突變體催化制備苯丙酮酸的體系也進(jìn)行了優(yōu)化。首先，對(duì)重組大腸桿菌產(chǎn)酶條件進(jìn)行了優(yōu)化，包括不同的表達(dá)載體(pET-28a、pET-20b、pET-22b、pET-24a)、不同的培養(yǎng)基(LB、TB、SB、LBA、TBA、SBA和SOC)、誘導(dǎo)條件(誘導(dǎo)劑種類、濃度、誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時(shí)間)，然后優(yōu)化了L-苯丙氨酸轉(zhuǎn)化生產(chǎn)苯丙酮酸的條件，轉(zhuǎn)化條件包括pH、溫度、底物濃度、催化劑用量和添加劑種類(CTAB、曲拉通-100、吐溫-80、Mn2+和DMSO)。經(jīng)過條件優(yōu)化后，在30-L罐上苯丙酮酸的最高產(chǎn)量達(dá)到了83.0 g/L，底物轉(zhuǎn)化率高達(dá)98.20%[18]，該研究的產(chǎn)量與轉(zhuǎn)化率為目前報(bào)道最高。

6 酮蛋氨酸

酮蛋氨酸(α-keto-γ-methylthiobutyric acid, KMTB)又稱α-酮-γ-甲硫基丁酸，是由蛋氨酸脫氨基生成的含酮化合物，分子式為C5H8O3S，分子量為148.21。KMTB作為L-甲硫氨酸的衍生物，不僅可以增加機(jī)體的利用效率還能抑制腫瘤細(xì)胞的生長，也被用來治療尿毒癥的病人。此外，KMTB還是一種安全無毒的禽畜飼料添加劑。

6.1 酶的篩選

以蛋氨酸為底物酶法合成酮蛋氨酸的酶主要包括L-氨基酸脫氨酶、氨基酸氧化酶和L-氨基酸轉(zhuǎn)氨酶。其中，氨基酸氧化酶和L-氨基酸脫氨酶全細(xì)胞轉(zhuǎn)化都以胞內(nèi)FAD為輔酶，不可逆的催化L-蛋氨酸生成α-亞蛋氨酸，α-亞蛋氨酸由于結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性，會(huì)自發(fā)水解形成α-酮蛋氨酸和氨。來源于P. vulgaris的氨基酸脫氨酶對(duì)蛋氨酸的轉(zhuǎn)化效率為100%[50]，而來源于P. mirabillis的氨基酸脫氨酶Pma和Pml對(duì)蛋氨酸的轉(zhuǎn)化效率只有16.7%和2.6%[41-42]。

6.2 酶的表達(dá)優(yōu)化與改造

2014年，Hossain等建立了酶轉(zhuǎn)化法合成KMTB的方法。以E. coli BL21 (DE3)為表達(dá)宿主，表達(dá)來自Proteus vulgaris的L-氨基酸脫氨酶基因pvAAD，構(gòu)建了重組菌株pET-20b(+)-pvAAD (E. coli BL21)。重組菌株以L-蛋氨酸為底物，進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化24 h，KMTB產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率分別達(dá)到了49.5 g/L和71.2%。在此基礎(chǔ)上，Hossain等對(duì)pvAAD進(jìn)行蛋白質(zhì)工程改造。首先，通過易錯(cuò)PCR技術(shù)獲得了2個(gè)能提高L-蛋氨酸轉(zhuǎn)化為KMTB效率的突變體K104R和A337S，轉(zhuǎn)化率分別達(dá)到了82.2%和80.8%。隨后，采用組合突變的方法將2個(gè)突變位點(diǎn)組合在一起獲得了最佳的突變體pvAADK104R/A337S。KMTB的產(chǎn)量從49.5 g/L提高到了63.6 g/L，轉(zhuǎn)化率從71.2%提高到了91.4%[51]。上述研究表明，蛋白質(zhì)工程改造技術(shù)能夠增強(qiáng)酶的催化速率，進(jìn)而提高KMTB的產(chǎn)量。

密碼子優(yōu)化能夠提高酶的翻譯，進(jìn)而提高酶的表達(dá)水平。劉立明課題組將來源于紅平紅球菌的L-氨基酸氧化酶經(jīng)過密碼子優(yōu)化后連接pET28a后導(dǎo)入E. coli BL21 (DE3)中進(jìn)行異源表達(dá)。通過對(duì)濕菌體的添加量(30 g/L、40 g/L、50 g/L、60 g/L)、轉(zhuǎn)化溫度(15 ℃、20 ℃、30 ℃、37 ℃)和轉(zhuǎn)化pH (7.0、7.5、8.0、8.5、9.0)優(yōu)化后，KMTB的產(chǎn)量達(dá)到95.18 g/L，轉(zhuǎn)化率為95.84%，時(shí)空產(chǎn)率為3.97 g/(L·h)[20]。

7 結(jié)論與展望

針對(duì)酶法轉(zhuǎn)化L-氨基酸生產(chǎn)相應(yīng)的α-酮酸，國內(nèi)外研究人員開展了卓有成效的研究工作。主要包括兩個(gè)方面：重組菌株的構(gòu)建，包括酶的篩選、酶的表達(dá)和酶的蛋白質(zhì)工程改造；另一方面為酶轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化。然而，由于酶制劑自身的催化效率低，轉(zhuǎn)化過程條件繁多且復(fù)雜，造成了α-酮酸產(chǎn)量、產(chǎn)率和生產(chǎn)強(qiáng)度較低。因此，為了提高α-酮酸的生產(chǎn)效率以及經(jīng)濟(jì)效益，今后需要在以下幾個(gè)方面進(jìn)行深入研究。第一，利用蛋白質(zhì)工程改造策略對(duì)酶進(jìn)行精準(zhǔn)改造，提高酶的催化效率，從而降低酶的用量，縮短催化反應(yīng)的時(shí)間；第二，可以發(fā)展多酶級(jí)聯(lián)催化反應(yīng)轉(zhuǎn)化生成附加值更高的酮酸衍生物，使得效益最大化；第三，深入研究酶的循環(huán)利用，做到酶制劑的多次重復(fù)利用，以降低生產(chǎn)成本；第四，利用代謝工程策略對(duì)表達(dá)宿主進(jìn)行改造，協(xié)調(diào)產(chǎn)物合成路徑與其他競爭性路徑之間的關(guān)系，增強(qiáng)酮酸的合成，為α-酮酸工業(yè)化生產(chǎn)奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

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