近日，上海交通大學(xué)譚在高研究員和合作者，成功繞過(guò)天然途徑的固有弊端，實(shí)現(xiàn)了丙二酰輔酶 A（malonyl-CoA）及其衍生物的高效合成。

圖 | 譚在高（來(lái)源：譚在高）

“截至目前，有很多國(guó)內(nèi)外同行都對(duì)我們構(gòu)建的新途徑非常感興趣，他們都希望能將它用到自己的研究中。”譚在高表示。

研究中，譚在高等人所構(gòu)建的丙二酰輔酶 A 合成新途徑，有效克服了天然途徑存在的傳統(tǒng)問(wèn)題。

這不僅提高了多種底盤(pán)細(xì)胞內(nèi)的丙二酰輔酶 A 產(chǎn)量，也為丙二酰輔酶 A 及其相關(guān)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供了極大可能。

由于丙二酰輔酶 A 是合成所有脂肪酸類、聚酮類化合物以及合成黃酮類化合物的前體，因此本次新途徑可被用于這些化合物的高效合成之中。

目前，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn) 10000 多種不同的聚酮類化合物，由之衍生的新產(chǎn)物更是不計(jì)其數(shù)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，有超過(guò) 20 多種聚酮類化合物（例如紅霉素、四環(huán)素、洛伐他汀、阿維菌素等）已成為商業(yè)化藥物。

其中，在醫(yī)藥業(yè)和畜牧業(yè)中，紅霉素是最常用的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。而包括洛伐他汀在內(nèi)的他汀類藥物的銷售額，在降血脂藥物市場(chǎng)總銷售額中占比 80% 以上。目前，上述 20 多種藥物的全球年銷售額已超過(guò) 200 億美元。

黃酮類化合物，也是一種廣泛存在的次級(jí)代謝產(chǎn)物，當(dāng)前已被發(fā)現(xiàn)的黃酮類化合物超過(guò) 8000 種，大部分具有良好的抗病毒、抗菌、抗炎、抗癌和抗肥胖等生理活性。

預(yù)計(jì)到 2024 年，黃酮類化合物市場(chǎng)將達(dá)到 12 億美元。因此，課題組認(rèn)為本次提出的生物合成新途徑具有廣闊的應(yīng)用前景。

（來(lái)源：Nature Catalysis）

天然途徑卻并不完美

如前所述，丙二酰輔酶 A——是合成脂肪酸、聚酮化合物、黃酮類化合物等 3 萬(wàn)多種高值化合物的共同前體。

但是，此前不少研究均表明，胞內(nèi)的丙二酰輔酶 A 處于供給不足的狀態(tài)，這讓高值衍生物的高效生物合成遭到限制。

在幾乎在所有的生物體中，丙二酰輔酶 A 的合成都非常保守。即在丙酮酸脫氫酶（PDH，pyruvate dehydrogenase）的催化之下，丙酮酸可以形成乙酰輔酶 A（acetyl-CoA）。

而在乙酰輔酶 A 羧化酶（ACC，Acetyl CoA carboxylase）的催化之下，乙酰輔酶 A 可以形成丙二酰輔酶 A。

然而，從高效生物合成的角度來(lái)看，盡管 PDH-ACC 是一條天然途徑，但是它并不完美。

這種途徑的催化速率往往偏低，活性僅為 nmol/min/mg 級(jí)。脫羧反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生溫室氣體二氧化碳，從而造成碳源浪費(fèi)。而羧化則需要消耗腺嘌呤核苷三磷酸，因此會(huì)造成能量浪費(fèi)。

此外，脫羧反應(yīng)會(huì)受到胞內(nèi)多種代謝物的嚴(yán)格調(diào)控。這些弊端的存在，是導(dǎo)致丙二酰輔酶 A 供給不足的主要因素。

那么，該如何提高丙二酰輔酶 A 的供給？此前，學(xué)界將重點(diǎn)放在提高天然途徑的表達(dá)。

主要采取的手段有兩種：其一，過(guò)表達(dá)乙酰輔酶 A 羧化酶；其二，讓乙酰輔酶 A 羧化酶發(fā)生突變從而提高其活性。

但是，這并不能解決天然途徑碳效率低下和能量效率低下等固有缺陷。并且，有不少研究報(bào)道，過(guò)表達(dá)乙酰輔酶 A 羧化酶，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的生長(zhǎng)受到抑制。

（來(lái)源：Nature Catalysis）

規(guī)避天然途徑的弊端

因此，譚在高團(tuán)隊(duì)沒(méi)有繼續(xù)將精力集中在天然合成途徑的優(yōu)化上。

而是另辟蹊徑，嘗試構(gòu)建一條新的丙二酰輔酶 A 合成途徑，希望在提高丙二酰輔酶 A 合成速率的同時(shí)，規(guī)避天然途徑所存在的弊端。

研究中，擺在他們面前的第一件事，便是選取丙二酰輔酶 A 合成底物。胞內(nèi)代謝通量是否足夠大，是主要的選取原則。

在細(xì)胞中，丙酮酸不僅是一種非常常見(jiàn)的中心代謝物，而且合成通量非常大。于是，該團(tuán)隊(duì)選取它作為合成底物。

但是，從丙酮酸生成丙二酰輔酶 A 不可能一蹴而就，中間需要?dú)v經(jīng)幾個(gè)步驟。

而為了避免二氧化碳釋放造成的碳源浪費(fèi)，所以他們不再考慮使用脫羧反應(yīng)，于是在中間物上選取了 C3 型。

在眾多 C3 化合物中，他們發(fā)現(xiàn) 3-氧代丙酸很有可能通過(guò)一步反應(yīng)合成丙二酰輔酶 A，而丙酮酸也只需通過(guò)一步轉(zhuǎn)氨反應(yīng)就能得到 3-氧代丙酸。

也就是說(shuō)在理想情況之下，對(duì)于丙酮酸來(lái)說(shuō)它只需要通過(guò)兩步反應(yīng)，即可合成丙二酰輔酶 A。

確定中間產(chǎn)物之后，課題組在數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索可能涉及到的反應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：對(duì)于上述第一步反應(yīng)，可以由轉(zhuǎn)氨反應(yīng)完成；對(duì)于上述第二步反應(yīng)，此前還沒(méi)有相關(guān)報(bào)道。

但是，有研究表明在 MCR-C（the C-terminal fragment of malonyl-CoA reductase）的作用之下，丙二酰輔酶 A 可以合成 3-氧代丙酸。

課題組推測(cè)：針對(duì)相關(guān)逆反應(yīng)進(jìn)行催化，或許也是一條可行的道路。通過(guò)一番計(jì)算他們發(fā)現(xiàn)，從 3-氧代丙酸到丙二酰輔酶 A 的反應(yīng)，能夠在熱力學(xué)上找到一定的依據(jù)。

因此，他們選定這一類酶作為第二步反應(yīng)的候選酶。對(duì)于自然途徑來(lái)說(shuō)，它所采用的是“C3（丙酮酸）-C2（乙酰輔酶 A）-C3（丙二酰輔酶 A）”這樣一種先脫羧、再羧化的途徑。

而該團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了一種“C3（丙酮酸）-C3（3-氧代丙酸）-C3（丙二酰輔酶 A）”的新途徑，擺脫了碳源浪費(fèi)和能量消耗等弊端。

后來(lái)，他們將這種途徑稱之為 NCM 途徑（non-carboxylative malonyl-CoA formation pathway）。

接下來(lái)，他們開(kāi)始進(jìn)行酶的挖掘，將候選酶用于進(jìn)行體外反應(yīng)。并通過(guò)還原酶催化的還原反應(yīng)所合成的還原型輔酶 Ⅱ，在 340nM 處吸收數(shù)值的增加速度，來(lái)判斷候選酶的強(qiáng)弱。

以及通過(guò)液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，來(lái)檢測(cè)體外反應(yīng)產(chǎn)物。在這種雙重驗(yàn)證之下， NCM 途徑的體外可行性得到了證明，并且活性非常高，達(dá)到了μmol/min/mg級(jí)，是天然合成途徑（nmol/min/mg 級(jí)）的 1000 倍。

（來(lái)源：Nature Catalysis）

得到兩支外部團(tuán)隊(duì)的大力支援

事實(shí)上，在最初幾次的液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)中，他們始終檢測(cè)不到丙二酰輔酶 A。本文的第一作者李健，也是譚在高研究員在上海交通大學(xué)招收的第一位博士研究生，認(rèn)為可能有如下兩個(gè)原因：

一是丙二酰輔酶 A 的檢測(cè)信號(hào)不強(qiáng)，而體外反應(yīng)合成的丙二酰輔酶 A 太少，所以檢測(cè)不到；

二是丙二酰輔酶 A 太不穩(wěn)定，在處理過(guò)程中已經(jīng)分解了不少。

為了解決這些問(wèn)題，他們決定將大部分實(shí)驗(yàn)在 4℃ 的條件下進(jìn)行，并對(duì)體外反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行富集。經(jīng)過(guò)這些優(yōu)化，終于成功檢測(cè)到目標(biāo)產(chǎn)物。

體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明：NCM 途徑具備一定的可行性。那么，在細(xì)胞內(nèi)是否也可以應(yīng)用？

想要精確地測(cè)定胞內(nèi)丙二酰輔酶 A 的合成通量，需要用到 C13 代謝流分析。

考慮到中國(guó)科學(xué)院分子植物科學(xué)卓越創(chuàng)新中心楊琛研究員在 C13 代謝流分析上，是一位非常權(quán)威的專家。

于是，譚在高團(tuán)隊(duì)開(kāi)始尋求與楊琛團(tuán)隊(duì)合作。在楊琛研究員的指導(dǎo)下，董文越博士生的研究表明，將 NCM 途徑引入大腸桿菌后，胞內(nèi)有 57% 的丙二酰輔酶 A 是通過(guò) NCM 途徑產(chǎn)生的，這直接證明 NCM 途徑在細(xì)胞內(nèi)是可行的。

此外，對(duì)天然途徑合成酶乙酰輔酶 A 羧化酶進(jìn)行過(guò)表達(dá)，會(huì)讓細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制。那么，過(guò)表達(dá) NCM 途徑是否會(huì)有類似情況？

一番研究之后他們發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá) NCM 途徑對(duì)于細(xì)胞生長(zhǎng)并沒(méi)有明顯的抑制。

那么，引入 NCM 途徑是否會(huì)對(duì)細(xì)胞魯棒性產(chǎn)生影響？經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)得知，將 NCM 途徑引入大腸桿菌之后，即便處于由有機(jī)酸、毒性聚酮化合物、高滲透壓等不利生長(zhǎng)條件導(dǎo)致的生長(zhǎng)抑制環(huán)境之中，細(xì)胞對(duì)于這種環(huán)境的耐受性反而能夠提高。

而在這些脅迫條件之下，過(guò)表達(dá)乙酰輔酶 A 羧化酶的菌株，則生長(zhǎng)得非常緩慢。

隨后，譚在高團(tuán)隊(duì)還測(cè)試了 NCM 途徑在丙二酰輔酶 A 衍生物合成方面的應(yīng)用。

在模式菌株大腸桿菌中，他們將 NCM 途徑用于辛酸、間苯三酚、淡黃霉素和十五碳烯等丙二酰輔酶 A 衍生物的合成，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些產(chǎn)物的產(chǎn)量都得到了顯著提高。

那么，NCM 途徑的應(yīng)用場(chǎng)景是否可以更廣泛？它是不是可以在不同底盤(pán)細(xì)胞中起到作用？

后來(lái)，他們打算在鏈霉菌中測(cè)試 NCM 途徑效果，因?yàn)殒溍咕翘烊坏木弁惢衔锖铣傻妆P(pán)，很多商業(yè)化藥品都是聚酮類化合物。

為此，譚在高團(tuán)隊(duì)開(kāi)始尋求與上海交通大學(xué)劉天罡團(tuán)隊(duì)進(jìn)行合作。在劉天罡教授的指導(dǎo)之下，武漢大學(xué)的慕昕博士生將 NCM 途徑引入褐黃孢鏈霉菌之中，以用于生產(chǎn)納他霉素；以及將 NCM 途徑引入刺糖多孢菌之中，以用于生產(chǎn)多殺菌素。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)：納他霉素和多殺菌素的產(chǎn)量都能得到顯著提高。其中，多殺菌素?fù)u瓶的產(chǎn)量更是達(dá)到 4.6g/L，這是已有報(bào)道中的最高水平，也意味著他們已經(jīng)實(shí)現(xiàn)工業(yè)化量產(chǎn)。

最終，相關(guān)論文以《一種有效合成中心代謝物丙二酰輔酶 A 及其衍生物的非羧基化路線》（A non-carboxylative route for the efficient synthesis of central metabolite malonyl-CoA and its derived products）為題發(fā)在 Nature Catalysis。

上海交通大學(xué)博士生李健、武漢大學(xué)博士生慕昕、中科院分子植物卓越中心博士生董文越是共同一作。

上海交通大學(xué)譚在高研究員和劉天罡教授、中科院分子植物科學(xué)卓越創(chuàng)新中心楊琛研究員擔(dān)任共同通訊作者。

圖 | 相關(guān)論文（來(lái)源：Nature Catalysis）

目前，譚在高研究員已經(jīng)獲得 2024 年國(guó)家自然科學(xué)基金的支持。因此，除了 NCM 途徑之外，他們還打算利用其它不同類型的底物，實(shí)現(xiàn)丙二酰輔酶 A 的高效合成。

眼下，他們已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了從多種底物到丙二酰輔酶 A 非天然合成途徑的創(chuàng)制。

相比天然途徑，這些途徑展現(xiàn)出顯著的催化優(yōu)勢(shì)。因此，下一步他們將開(kāi)展丙二酰輔酶 A 衍生物的高效合成。

參考資料：

1.Li, J., Mu, X., Dong, W.et al. A non-carboxylative route for the efficient synthesis of central metabolite malonyl-CoA and its derived products. Nat Catal (2024). https://doi.org/10.1038/s41929-023-01103-2

運(yùn)營(yíng)/排版：何晨龍

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