V.T. Pham and M.H. Mohajeri. The application of in vitro human intestinal models on the screening and development of pre- and probiotics. Benef Microbes.2018 Apr 26:1-18.
▌介紹
人體內(nèi)有大量的微生物，其中胃腸道是迄今為止最大的定植器官，其包含的不同節(jié)段具有不同環(huán)境條件和微生物譜，這反映在細菌細胞的分布不均，胃和十二指腸細菌濃度低（每克10^1至10^3個細菌），在空腸和回腸中增加至每克10^4至10^7個細菌，結(jié)腸中濃度最高（每克10^11至10^12個細菌）。結(jié)腸含有人體中所有微生物的70％以上。消化物質(zhì)的緩慢流動為細菌提供了發(fā)酵來源于飲食和內(nèi)源性分泌物的未消化的底物以增殖的時間，因此，人類腸道是一個大型、多樣化和動態(tài)的細菌群落的自然棲息地，迄今為止描述的細菌種類超過1,200種。最近的分析表明，我們體內(nèi)的細菌數(shù)量與人類細胞總數(shù)相同，并且含有比人類基因組多100倍的基因。需注意受年齡、性別、飲食、疾病、藥物和環(huán)境等影響，個體之間的微生物組成存在顯著差異。人們早已認識到并記錄了這個龐大而動態(tài)的細菌群落對宿主健康和疾病的意義及影響。在早年生活中，腸道菌群的定植及代謝與胃腸疾病的病因相關(guān)，如嬰兒腹痛和壞死性小腸結(jié)腸炎。人類腸道微生物群在免疫系統(tǒng)的發(fā)育和穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用，并可能與多系統(tǒng)器官衰竭、結(jié)腸直腸癌、炎癥性腸?。↖BD）和肥胖等特定病理狀況有關(guān)。此外，腸道微生物群與神經(jīng)系統(tǒng)之間的關(guān)系也日益顯著。因此，人們有機會通過開發(fā)益生菌和益生元干預(yù)來調(diào)節(jié)腸道微生物以獲得長期持久的健康。
益生菌被定義為“一種活的微生物，在給予足夠劑量時，對宿主健康有益”。益生菌發(fā)揮其有益作用的機制包括改變腸道微生物群、競爭并限制病原體的定植、增強上皮屏障功能和調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)。益生元最初定義為“不易消化的食物成分，通過選擇性刺激結(jié)腸中一種或少數(shù)幾種細菌的生長和/或活性對宿主產(chǎn)生有益影響，改善宿主健康”。經(jīng)過20年的研究，益生元的概念已獲得發(fā)展，定義已被多次完善。益生元的最新定義是“宿主微生物選擇性利用的底物，賦予宿主健康益處”。一些關(guān)鍵性的研究總結(jié)了益生元和益生菌在總體健康、結(jié)直腸癌、IBD和肥胖中的作用。在這篇綜述中，我們討論了體外腸道模型是作為益生元和益生菌研究的有用方法及最常用模型的優(yōu)缺點和技術(shù)問題。此外，我們對應(yīng)用這些模型進行益生元和益生菌研究的文獻進行了總結(jié)。
▌體外人類腸道模型是益生元和益生菌發(fā)展的有力工具
在益生元和益生菌的研究中，體外和體內(nèi)研究之間的整合是必要的，可以互相補充。下面將討論每種方法的優(yōu)點和缺點。
人體研究
人體研究可利用糞便樣品，它能初步反應(yīng)胃腸道微生物組成。這種類型的研究還能夠建立微生物群組成與宿主表型或環(huán)境之間的相關(guān)性，產(chǎn)生研究問題，或者可以用來確認在簡化模型中觀察到的效應(yīng)或機制。
營養(yǎng)化合物對腸道微生物群的影響可以通過給予人類受試者過量的測試成分來證明，但可能導(dǎo)致不良反應(yīng)。因此，介于道德及安全問題，這些研究往往受到限制。而且，很難監(jiān)測和嚴格遵守介入治療。新的數(shù)據(jù)也提供了結(jié)腸微生物群能快速適應(yīng)底物可用性改變的證據(jù)。在人體研究中，取樣大多限于糞便探針作為終點測量。由于侵入性和不方便操作，從胃腸道不同區(qū)域（例如近端結(jié)腸）獲取樣品受到限制，因此難以準確確定起效的部位，及進一步確定益生元和益生菌的作用機制。腸道上皮細胞分泌形成粘液層，將腸腔和宿主組織分開。然而，粘液層的采樣是侵入性的，糞便樣品的使用無法代表粘膜群落。在人體研究中，由于宿主-微生物群之間不可避免的相互作用，益生元和益生菌對腸道微生物活性的直接影響通常難以解釋。人體研究的另一個挑戰(zhàn)是由遺傳背景、飲食、健康狀況、生活方式和環(huán)境條件等混雜因素引起的巨大的個體差異。最后，難以確定益生元和益生菌對腸道微生物群組成的影響是通過直接刺激生長或是通過微生物群短鏈脂肪酸（SCFA）（可降低pH）的產(chǎn)生。
動物研究
動物模型（主要是小鼠、大鼠和小豬）使我們可以在高度控制的環(huán)境下調(diào)節(jié)和研究宿主- 微生物相互作用，從而將人體研究中常見的混雜因素的影響降至最低。其中無菌動物是研究腸道微生物對宿主功能影響的最適合的模型。處死動物后我們可以直接獲取結(jié)腸內(nèi)容物，結(jié)腸內(nèi)容物中的細菌代謝物例如SCFA還沒有被宿主吸收，因此與使用糞便的研究相比，動物試驗更適合于研究腸道微生物群的代謝活性。
最近一項使用新生仔豬模型的研究證明了低聚半乳糖（GOS）對腸道功能的影響，如促進腸道微生物群平衡，改善腸道組織形態(tài)和刺激腸道免疫系統(tǒng)。一般而言，動物模型在營養(yǎng)干預(yù)例如腸胃外營養(yǎng)、低聚糖、益生元和益生菌的篩選方面具有優(yōu)勢，并能進一步闡明其作用機制和對宿主的影響，鑒定微生物和宿主生物標志物，這些在非侵入性嬰兒研究是不可能做到的。然而，動物模型是昂貴的，勞動密集的，并且在生理學(xué)上可能不能代表人體代謝。另外，動物的微生物組不同于人類的微生物組，因此，將從動物模型獲得的發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)用于人類仍然是一個挑戰(zhàn)。
體外腸道發(fā)酵模型
為了克服體內(nèi)研究的這些缺點，人們開發(fā)了體外發(fā)酵模型，作為在高度控制的條件下研究人類腸道微生物群的有力工具，它使我們能夠在模擬不同結(jié)腸區(qū)域的反應(yīng)器中隨時間動態(tài)取樣。
與體內(nèi)研究相比，體外結(jié)腸發(fā)酵模型更便宜，可重復(fù)性更高，不需要經(jīng)過精心準備倫理批準，并且可以在更短的時間內(nèi)進行研究。這些模型能夠在模擬的生理條件下培養(yǎng)來自糞便樣品的人類腸道微生物群。幾種模型還可以進一步模擬酶消化活性、粘液生成以及微生物群和宿主之間的相互作用。因此，研究人員能夠使用這些系統(tǒng)來研究益生元和益生菌對腸道微生物群的影響、益生元的發(fā)酵譜、益生菌在整個胃腸道的生存能力和功能。體外發(fā)酵模型不僅可用于篩選和開發(fā)不同的益生元及益生菌，還能用于機制研究，并在碳水化合物和蛋白質(zhì)發(fā)酵、類固醇和膽汁酸代謝、氫氣形成和清除領(lǐng)域形成假設(shè)。
體外發(fā)酵的原理是在生理條件下（厭氧生活、保留時間、培養(yǎng)基、溫度和pH）將糞便微生物群接種在營養(yǎng)培養(yǎng)基中。最簡單的模型是分批發(fā)酵，由于底物的快速消耗和pH的降低（抑制微生物活性），適用于短期實驗。另一方面，具有不同復(fù)雜程度的連續(xù)培養(yǎng)可允許長期發(fā)酵和參數(shù)調(diào)整以模擬體內(nèi)條件。單階段模型通常模擬近端結(jié)腸的條件，而多階段發(fā)酵模型可以模擬結(jié)腸的不同區(qū)域（近端結(jié)腸、橫結(jié)腸和遠端結(jié)腸）。
考慮到每種方法的優(yōu)點和局限性，將體外和動物模型與人體研究相結(jié)合設(shè)計多尺度的策略可能有助于深入了解腸道微生物群，飲食和宿主之間的復(fù)雜關(guān)系;并進一步闡明腸道微生物群在健康和疾病中的作用。
▌體外人類腸道模型的重要參數(shù)
糞便接種
胃腸道不同區(qū)域具有不同環(huán)境條件和微生物特征。因此，模擬一個區(qū)域（例如近端結(jié)腸）的模型最好應(yīng)接種該特定區(qū)域的生物學(xué)內(nèi)容物。然而，收集此類樣品需要侵入性的操作，導(dǎo)致了倫理的約束，因此大多數(shù)體外結(jié)腸發(fā)酵模型接種的是糞便樣品。盡管如此，理論上通過選擇專門的發(fā)酵培養(yǎng)基，仍然可以模擬胃腸道中所需區(qū)域的條件。需注意，使用糞便樣品可能會將額外的未定義的底物引入系統(tǒng)中。為了減少底物污染物的影響，糞便樣品經(jīng)常短暫離心以去除大顆粒。此外，在確定的發(fā)酵培養(yǎng)基中分批發(fā)酵糞便接種物將進一步促進糞便微生物群適應(yīng)特定結(jié)腸區(qū)域的實驗條件。
考慮到由性別、飲食、地理位置、種族和年齡引起的糞便供體者之間的個體間差異，來自不同供體的糞便樣品在接種到體外系統(tǒng)之前是否應(yīng)該匯集仍然存在爭議。有利于匯集微生物群的爭論是匯集可以限制個體間變異性并提供可以重復(fù)用于不同發(fā)酵的標準化微生物群，便于實驗之間的比較。值得注意的是，隨著時間的推移，除個體差異之外，同一個供體內(nèi)的差異也可能導(dǎo)致不同的微生物群組成和代謝活性。此外，匯集糞便樣品會增加總體多樣性并導(dǎo)致更廣泛的腸道微生物譜。最近一項使用TIM-2系統(tǒng)的研究比較了來自單個供體和四個供體的腸道微生物群的穩(wěn)定性和活性。作者強調(diào)了單個供體在多樣性和功能方面與多個供體相似，這表明糞便樣品的匯集適合用于發(fā)酵實驗。
另一方面，支持使用個體接種的主要觀點是，混合接種物中不同功能細菌群的混合可能干擾每個供體個體中建立的重要交叉互生和營養(yǎng)鏈，從而可能導(dǎo)致結(jié)果不同于個體接種。
pH值
結(jié)腸pH對腸道微生物群的組成和代謝活性有著深遠的影響。重要的是，pH能影響益生元發(fā)酵關(guān)鍵酶的活性。Palframan等人證明了在不同pH條件下雙歧桿菌對低聚果糖（FOS）、菊糖、異麥芽低聚糖（IMO）、GOS和乳果糖的作用不同。這支持了益生元組合的構(gòu)想，使益生元在在結(jié)腸的不同部位起作用。在受控和不受控制的pH周期下，固定化嬰兒糞便細菌的連續(xù)發(fā)酵證明了大多數(shù)細菌群體，特別是雙歧桿菌屬種對pH值的變化的高度敏感性。在使用了接種成人糞便微生物群體的單級發(fā)酵系統(tǒng)的研究中，將pH從6.5降低至5.5促進了丁酸鹽的產(chǎn)生，增加了產(chǎn)丁酸鹽細菌的水平，并且抑制了類桿菌屬種的生長。一項研究利用接種來自四名成年供體的糞便漿液的分批培養(yǎng)物，研究pH值（5.2、5.9和6.4）對乳酸鹽產(chǎn)生和利用的影響，結(jié)果表明，pH 5.2誘導(dǎo)乳酸鹽積聚，這是由于乳酸鹽利用率降低。Zihler Berner等人使用接種了3名兒童（6、8和10歲）的腸道菌群的連續(xù)PolyFermS腸模型，研究pH的影響。該研究表明，pH值從5.7降至5.5導(dǎo)致丁酸酯產(chǎn)量增加、乙酸濃度降低以及總代謝活性降低。0.2個單位的pH下降也導(dǎo)致了擬桿菌屬成員的相對豐度降低，產(chǎn)丁酸鹽菌的相對豐度增加。最近的一項研究表明，pH對來自不同分類細菌之間的競爭有很大的影響，這些細菌有利用相同多糖的能力，在菊糖作為唯一碳水化合物的反應(yīng)器中，擬桿菌屬16S rRNA基因拷貝的百分比從pH 6.9的60％降至的pH 5.5的30％。
滯留時間
滯留時間在腸道菌群的發(fā)酵過程中起著重要作用。使用三階段連續(xù)模型（Reading模型）在體外研究滯留時間的影響。該研究表明，與60小時相比，將滯留時間降低至20小時導(dǎo)致乙酸酯增加和丁酸酯產(chǎn)量降低。重要的細菌群如瘤胃球菌屬和產(chǎn)丁酸的羅氏弧菌在20小時的滯留時間完全從系統(tǒng)中移除，這表明它們的生長不夠迅速以保持在生態(tài)系統(tǒng)中。滯留時間不僅影響碳水化合物的發(fā)酵，對于腸道細菌對蛋白質(zhì)的降解也可能是重要的，來自三階段連續(xù)模型的數(shù)據(jù)表明，酶活性、蛋白質(zhì)濃度、氨和苯酚產(chǎn)量與滯留時間同步增加。通過使用相同的腸道模型，MacFarlane等人發(fā)現(xiàn)，將滯留時間從27.1小時改變?yōu)?6.7小時可增加蛋白質(zhì)降解和氨基酸發(fā)酵。在最近的一項研究中，將滯留時間從正常48小時改為96小時，導(dǎo)致生物量和總細菌數(shù)量減少。此外，在該模型系統(tǒng)中，延長的滯保留時間降低了橫向和遠端隔室的腸道微生物群多樣性，同時導(dǎo)致近端結(jié)腸中碳水化合物發(fā)酵增加為主的代謝轉(zhuǎn)變。
在最近的一篇綜述中還詳細討論了體外人類腸道模型中涉及的其他參數(shù)，如氧化還原電位和厭氧生物學(xué)，本文不包括這些參數(shù)的討論。
▌體外分批發(fā)酵模型
強調(diào)每個體外模型具有的特定優(yōu)點和/或缺點是很重要的。體外模型的選擇取決于實驗的目的（圖1，請參見原文）。我們在下文討論不同模型的優(yōu)點、缺點和技術(shù)問題，并關(guān)注在益生元和益生菌研究中最常應(yīng)用的模型的最新進展。
分批發(fā)酵是測試特定菌株或糞便微生物群落代謝不同底物能力的最簡單和最常用的模型。這些模型在封閉系統(tǒng)中接種純培養(yǎng)物或糞便原料懸浮液，在控制或不控制pH下操作，并且沒有額外的營養(yǎng)物供應(yīng)。分批培養(yǎng)的優(yōu)點是它們快速，便宜，易于操作和可重復(fù)。高通量和可自動化的特性使其成為初步調(diào)查益生菌和膳食化合物對腸道微生物群組成和代謝活動調(diào)節(jié)的有價值的方法。此外，由于能夠縮減比例，這些分批發(fā)酵模型可以使所需介質(zhì)體積和測試化合物最小化。在一項研究通過不同模型研究抗性淀粉作用的研究中，與TIM-2模型相比，分批發(fā)酵的SCFA比率更接近于猝死受害者測量值。分批發(fā)酵的缺點是由于底物的快速消耗、微生物代謝產(chǎn)物的積累和pH值的降低（可抑制微生物活性），可操作時間很短。這種短期發(fā)酵可能不支持一個營養(yǎng)鏈（一個菌種的發(fā)酵產(chǎn)物成為另一個菌種的底物）建立。
表1（請參見原文）總結(jié)了在分批發(fā)酵模型中觀察益生菌、益生元和合生元對人腸道菌群的作用的體外研究。分批發(fā)酵研究證明了GOS、IMO、支鏈FOS、蜂蜜低聚糖、葡萄糖低聚糖、小麥阿糖基木聚糖、長雙歧桿菌和動物雙歧桿菌產(chǎn)生的胞外多糖、乳果糖寡糖（OsLu）、反式低聚半乳糖（B-GOS）和菊粉的益生元作用。幾項研究顯示合生元有抑制大腸桿菌水平，并增強益生元效應(yīng)的潛力。相同的實驗設(shè)置是研究pH和益生元劑量對雙歧桿菌效應(yīng)的影響或不同結(jié)構(gòu)，分子量和聚合度益生元的作用的理想條件。有趣的是，補充益生元可以改善分批發(fā)酵模型中抗生素的作用，至少部分模擬了人類的情況。最近進行了體外抑制試驗的研究表明，鼠李糖乳桿菌GG、羅伊氏乳桿菌1063、菊粉和GOS減少了粘附侵襲性大腸桿菌的存活和生長。因此，分批發(fā)酵為篩選益生菌和益生元抑制傳染性和胃腸疾病中潛在病原體的能力提供了機會。
▌體外連續(xù)發(fā)酵模型
Reading模型
最早的連續(xù)發(fā)酵模型之一是Gibson、Cummings和MacFarlane開發(fā)的三階段系統(tǒng)。這一多階段系統(tǒng)的基本原理是大腸/結(jié)腸是由三個具有獨特的pH和發(fā)酵活性的區(qū)域組成，即近端結(jié)腸、橫結(jié)腸和遠端結(jié)腸。因此，多隔室系統(tǒng)優(yōu)化了結(jié)腸不同區(qū)域的特定條件下微生物群的生長。在該模型中，將無菌培養(yǎng)基加入代表近端結(jié)腸（pH5.5）的容器1中，并順序加入容器2和3中，分別模擬橫結(jié)腸（pH 6.2）和遠端結(jié)腸（pH 6.8）。使用2M NaOH通過外部pH控制器控制pH。該模型通過對猝死受害者的結(jié)腸內(nèi)容物進行測量來驗證。該作者還配制了廣泛應(yīng)用于此后開發(fā)的其他發(fā)酵系統(tǒng)（如PolyFermS模型）的發(fā)酵培養(yǎng)基。當細菌處于穩(wěn)態(tài)條件下時，通過在發(fā)酵罐中放置粘蛋白凝膠，MacFarlane等人觀察到糞便微生物群迅速定植在粘蛋白凝膠上，表明該模型適合模擬腸內(nèi)腔及粘膜層內(nèi)側(cè)條件下的細菌生長。將該模型用于調(diào)查小麥糊精對腸道菌群的影響，每天兩次給予7g小麥糊精18天后，產(chǎn)丁酸鹽關(guān)鍵細菌顯著增加并在所有容器中產(chǎn)生明顯的致丁作用。最近，三階段發(fā)酵系統(tǒng)證明了含有Bimuno（一種GOS混合物（B-GOS））的橙汁的有益作用，它增加了雙歧桿菌和乳桿菌數(shù)量，增加了產(chǎn)丁酸酯的Roseburia亞群和丁酸的產(chǎn)生。該模型最近還應(yīng)用于調(diào)查益生元（B-GOS）對自閉癥和非自閉癥兒童糞便細菌種群和代謝活動的影響。該研究有了令人鼓舞的結(jié)果，B-GOS施用顯著增加含有自閉癥和非自閉癥樣品的所有容器中的雙歧桿菌水平，以及非自閉癥模型的遠端結(jié)腸乳酸桿菌水平。
PolyFermS模型
由于沖洗掉了競爭力較小的細菌，反應(yīng)器中接種糞便混懸液與接種結(jié)腸內(nèi)容物相比細菌細胞密度降低。此外，自由漂浮的細菌細胞系統(tǒng)并不代表在結(jié)腸中的浮游和靜止狀態(tài)。為了克服這個缺點，人們開發(fā)了一種帶有固定化糞便微生物群的發(fā)酵模型（PolyFermS），新鮮的糞便微生物群被收集在凝膠珠中，并在從外圍層釋放細菌進入發(fā)酵培養(yǎng)基之前倍增達到高密度。這種新方法在長達80天的運行時間內(nèi)顯著改善了體系的細菌密度，增加了系統(tǒng)的穩(wěn)定性。此外，一個新的模型設(shè)計被開發(fā)和驗證，使人們能在單個實驗中，在分離的有相同微生物群組合物的平行連接的反應(yīng)器中進行幾種處理的測試，從而提供足夠的治療重復(fù)以及治療與對照的比較。然而，這種模式的主要局限性在于缺乏透析和缺乏宿主反應(yīng)。而且，這樣的系統(tǒng)需要專有技術(shù)和使用昂貴的設(shè)備，因此這一種低產(chǎn)量的方法。
具有固定化細胞的單級和三級連續(xù)發(fā)酵系統(tǒng)成功證明了FOS、低聚果糖和菊粉的益生元效應(yīng)（表2，請參見原文）。另一方面，在來自鼠李糖乳桿菌的EPS中沒有觀察到益生元作用。
SHIME，TWIN SHIME，M-SHIME
在連續(xù)發(fā)酵模型中，“人類腸道微生物生態(tài)系統(tǒng)模擬器”（SHIME）模型是模擬完整腸道的少數(shù)模型之一。其發(fā)展于Reading模型，SHIME與原始模型不同的是，通過整合上消化道條件，形成五個連續(xù)的隔室模擬胃和十二指腸、小腸（空腸和回腸）、升結(jié)腸、橫結(jié)腸和降結(jié)腸。一個重要的技術(shù)方面是系統(tǒng)的穩(wěn)定性，可以在2-3周后達到。表2（請參見原文）總結(jié)了大多數(shù)使用SHIME模型探討益生菌和益生元對腸道微生物群組成和代謝活性的影響的研究。
SHIME模型設(shè)計進一步改進以適應(yīng)不同的實驗?zāi)康?，包括Twin-SHIME、Triple-SHIME和M-SHIME模型。Twin-SHIME由兩個相同的SHIME單元（每個單元包括上述五個隔室）組成，Triple-SHIME模擬三個胃和小腸隔室，為三種組合的近端和遠端的結(jié)腸容器提供原料。這些模型使人們能在相同環(huán)境條件下對相同的腸道微生物群進行平行對照試驗和兩種處理。此外，可將不同供體的糞便微生物群接種到不同的反應(yīng)器來通過這些系統(tǒng)研究個體間差異的影響。Grootaert等人使用Twin-SHIME比較阿糖基木聚糖低聚糖（AXOS）和菊糖的益生元效應(yīng)，該研究表明，兩種寡糖的降解和SCFA產(chǎn)生具有結(jié)腸室特異性，近端結(jié)腸和橫結(jié)腸分別是菊粉和AXOS降解的主要位點。Twin-SHIME用于證明SHIME模型的可重復(fù)性，并進一步揭示了微生物群落的結(jié)腸區(qū)域特異性，其中分解糖和降解粘蛋白的細菌分別存在于近端和遠端區(qū)域中。Twin-SHIME的另一項研究表明，金合歡樹膠對FOS和菊糖的部分替代增加了丙酸鹽和丁酸鹽，并顯示出雙歧桿菌效應(yīng)。最近使用接種來自IBD患者的糞便樣品的Triple-SHIME模型的研究通過IL-8濃度降低和IL-10量增加揭示了對FOS和阿拉伯半乳聚糖（AG）的結(jié)腸區(qū)域特異性抗炎反應(yīng)。
為了更精確地模擬覆蓋有保護性粘液層的人體腸道，SHIME通過添加粘蛋白覆蓋的微生態(tài)系統(tǒng)（其每日替換以模擬粘液層的更新）合成粘膜環(huán)境。這種被稱為粘膜-SIME（M-SHIME）的模型不僅可以模擬懸浮的腸道微生物，而且還能模擬附著于表面的腸道微生物和粘蛋白降解群落，例如，被認為是下一代益生菌的柔嫩梭菌群和嗜粘蛋白-艾克曼菌。然而，主要在遠端結(jié)腸中降解粘蛋白的粘液霉菌在M-SHIME中未達到高密度，這表明M-SHIME模型可通過模擬遠端結(jié)腸進一步完善。此外，具有強烈粘附性的鼠李糖乳桿菌GG（LGG）選擇性的定植于粘膜區(qū)域，表明該模型可以預(yù)防粘附微生物的沖刷。該模型有助于研究促使腸道微生物群定位在與宿主上皮細胞密切相互作用的粘膜區(qū)域的因素。最近使用M-SHIME的研究顯示路氏乳桿菌1063、長鏈阿糖基木聚糖和GOS抑制粘液中的粘附侵襲性大腸桿菌，表明益生菌和益生元可能會限制機會病原體通過接近上皮細胞對宿主產(chǎn)生不利影響。最近還開發(fā)了其他的吸收單元來模擬小腸吸收過程。與其他發(fā)酵模型一樣，SHIME具有一定的局限性，包括使用比新鮮制備的胃粘蛋白具有更低摩爾質(zhì)量和更多雜質(zhì)的豬胃粘蛋白，并且缺乏體內(nèi)從血液釋放到粘液層的氧氣梯度。后者及宿主反應(yīng)的缺乏可以通過將SHIME與宿主微生物相互作用（HMI）模塊耦合來克服。由上部粘液層和下部半透膜組成的HMI模塊將含有腸上皮細胞系的下部隔室與含有SHIME流出物的腔室隔開。這種設(shè)計允許在剪切力和微需氧條件下研究細菌粘附。此外，它可以使氧氣和代謝物穿過隔室并且使細胞直接接觸復(fù)雜的微生物群。對低成本、低通量以及對訓(xùn)練有素的操作員的需求進一步阻礙了SHIME的應(yīng)用。
TIM-2
基于模擬胃到小腸的TIM-1系統(tǒng)，1999年開發(fā)了TNO體外結(jié)腸模型（TIM-2），其有兩個獨特之處，即蠕動混合和模擬攝取代謝產(chǎn)物的透析膜。先前的研究表明，在穩(wěn)態(tài)條件下操作的系統(tǒng)中，稀釋度，底物限制和產(chǎn)物抑制是限制最佳細菌生長的主要因素。因此，TIM-2被設(shè)計成可模擬腸道上皮對微生物代謝產(chǎn)物的攝取，其積累可能導(dǎo)致細菌代謝和生長的抑制。然而，致密且粘稠的濃縮飼料導(dǎo)致混合困難，這可以通過柔性膜的蠕動運動解決。使用相同的糞便接種物可以平行運行多達10個TIM-2單元，從而可以在對照和不同處理之間進行比較。該系統(tǒng)用于以10 g/d的濃度研究乳果糖、菊糖、低聚半乳糖的作用。有趣的是，使用TIM-2接種來自瘦和肥胖受試者的糞便樣品的研究表明，瘦和肥胖微生物對低聚半乳糖、乳果糖、蘋果纖維和甜菜果膠的發(fā)酵不同。同樣，在用豬糞便接種的TIM-2中GOS的降解比接種人糞便時更明顯，這突出表明在益生元和益生菌干預(yù)研究中從動物數(shù)據(jù)到人類的轉(zhuǎn)換應(yīng)該謹慎地進行。當抗生素和益生菌同時應(yīng)用于TIM-2時，導(dǎo)致雙歧桿菌和乳酸菌數(shù)量增加。
▌討論
在廣泛應(yīng)用于檢驗益生元、益生菌或環(huán)境調(diào)節(jié)劑的效果之前，需通過與體外數(shù)據(jù)和從人受試者獲得的數(shù)據(jù)相比較來驗證體外模型。通過使用從四名猝死受害者中獲得的近端和遠端結(jié)腸腸腔內(nèi)容物驗證了三階段連續(xù)發(fā)酵系統(tǒng)（Reading模型），顯示出與體外數(shù)據(jù)相當?shù)募毦N群和代謝活性。TIM-2模型也通過顯示高細菌密度進行了驗證，接近體內(nèi)結(jié)腸的細菌密度。使用從三個供體獲得的糞便微生物群獨立發(fā)酵的數(shù)據(jù)驗證了PolyFermS模型培養(yǎng)類似于糞便供體的復(fù)雜腸道微生物群的能力。類似地，通過顯示阿拉伯半乳聚糖、木聚糖和果膠的發(fā)酵模式在體外和體內(nèi)之間可比較數(shù)據(jù)驗證了SHIME模型。
有趣的是，通過使用TIM-2檢測到瘦和肥胖糞便微生物群對GOS、乳果糖、蘋果纖維和甜菜果膠的不同發(fā)酵模式。類似地，在分批發(fā)酵模型中，肥胖和正常體重組之間顯示對谷物膳食纖維不同的細菌代謝，其中肥胖的微生物群導(dǎo)致丙酸鹽和丁酸鹽產(chǎn)生增加。這些結(jié)果部分反映了體內(nèi)的情況，在肥胖兒童中檢測到丙酸鹽和丁酸鹽的水平顯著升高。
需注意，包括近端結(jié)腸，橫結(jié)腸和遠端結(jié)腸容器的多階段連續(xù)模型僅僅是體內(nèi)情況的簡化模型，其中由于底物供應(yīng)的限制，在遠端結(jié)腸內(nèi)，腸道微生物群在間歇或分批補料的條件下生長。為了更真實地模擬體外腸道環(huán)境，必須規(guī)劃微生物群適應(yīng)實驗條件的時期。因此，另一個技術(shù)問題是穩(wěn)定期，它是關(guān)鍵的，并且在不同的模型中有所不同，從16小時到3周不等（表3，請參見原文）。這段時間對于糞便微生物群適應(yīng)發(fā)酵條件以及在引入實驗處理時建立穩(wěn)定的微生物群組成和代謝活性是重要的。事實上，膳食纖維攝入量的變化可能需要幾個月才能在人體內(nèi)穩(wěn)定。
應(yīng)根據(jù)研究的目的選擇合適的模型，因為每種發(fā)酵方法都具有特定的優(yōu)勢（圖1，表3，請參見原文）。分批發(fā)酵的快速、高通量和自動化特性使其適用于篩選不同劑量和組合的新膳食化合物。分批發(fā)酵的主要缺點是發(fā)酵時間短，代謝產(chǎn)物積累和pH降低，從而抑制微生物活性。另一方面，連續(xù)培養(yǎng)允許長期發(fā)酵并且更接近地模擬體內(nèi)條件。包括Reading模型，PolyFermS和SHIME在內(nèi)的多隔室系統(tǒng)能夠模擬結(jié)腸的特定區(qū)域（即近端，橫向和遠端結(jié)腸）。PolyFermS仍是使用固定技術(shù)將細菌固定到凝膠珠上的唯一模型，因此可以將發(fā)酵延長至幾個月，同時保持穩(wěn)定的細菌組成和代謝活性。通過在發(fā)酵罐中放置粘蛋白凝膠及添加粘蛋白覆蓋的微生態(tài)系統(tǒng)，Reading和SHIME模型分別可以更準確地模擬人類腸道的厚粘液層的內(nèi)側(cè)。選擇發(fā)酵模型時要考慮的另一個重要特征是比較不同劑量的益生元和益生菌治療或有陰性/陽性對照的能力。這可以在單級模型如TIM-2和PolyFermS中完成，或者多級模型如Twin-SHIME 和Triple-SHIME中完成。與其他模型相比，TIM-2具有獨特的蠕動混合和透析系統(tǒng)，可以達到生理代謝物濃度。
上述體外發(fā)酵模型的一個普遍限制是缺乏宿主反應(yīng)。這可以通過將發(fā)酵模型與人類細胞模型相結(jié)合來部分克服，將發(fā)酵流出物添加至上皮單層如Caco-2或分泌粘液的HT29-MTX。一個例子是上述的SHIME-HMI模塊。其他微生物- 宿主相互作用模型包括Transwell共培養(yǎng)模型、Human Oxygen Bacteria ANaerobic模型（HoxBan）、Gut-on-a-chip模型、具有跨上皮電阻測量的Organs-on-chips模型和human-microbial crosstalk(HuMix)模型。主要挑戰(zhàn)包括重復(fù)性和功能穩(wěn)定性，這在之前的回顧中有詳細討論。此外，腸道微生物群個體間的巨大的變異性也對生物學(xué)重復(fù)構(gòu)成巨大挑戰(zhàn)。這可以部分地通過在不同的發(fā)酵系統(tǒng)中使用多個供體或通過匯集來自不同供體的糞便樣品來克服。雖然前者對于需要長時間穩(wěn)定期的系統(tǒng)來說費時費力，但后者正在像前面討論的那樣具有強烈的爭議。
對傳統(tǒng)的三階段系統(tǒng)進行擴展，M?kivuokko和Nurminen設(shè)計了EnteroMix?，其包含四個容器，分別代表升結(jié)腸、橫結(jié)腸、降結(jié)腸和降結(jié)腸末端，具有相應(yīng)的pH和滯留時間。在多級連續(xù)模型中，EnteroMix容器的工作容積最小，因此可以模擬有限數(shù)量的測試底物。最近，正在開發(fā)其他發(fā)酵模型，包括糞便微型反應(yīng)器陣列（MBRAs）、胃腸道模擬器（SIMGI）和填充柱生物膜反應(yīng)器。先前的文章對每種方法的特點和潛力進行了廣泛的介紹。這些系統(tǒng)在益生元和益生菌的篩選和開發(fā)中的應(yīng)用是有限的，因此本文將不討論這些系統(tǒng)。新模型的發(fā)展對克服當前模型的局限性非常重要。然而，比較使用不同的培養(yǎng)時間、糞便接種物組成、底物濃度、培養(yǎng)基組成、穩(wěn)定期的持續(xù)時間和分析程序的不同模型獲得的發(fā)酵模式是具有挑戰(zhàn)性的。因此，體外腸發(fā)酵過程的標準化將有助于比較益生菌和益生元對腸道微生物群組成和代謝活性的影響。
總之，體外腸道發(fā)酵仍然是篩選以及研究益生元和益生菌作用機制的不可替代的工具。研究的目標決定我們選擇哪種模型系統(tǒng)。在選擇合適的模型時，應(yīng)考慮每個模型的技術(shù)問題、優(yōu)點和局限性，因為它們是每個模型的能力的決定性因素。
-THE END-
不 一 樣 的 消 化 科
翻譯 / 張靈
編輯 / 葉峰
2018.10.12-14 南京
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申明 / 本文系消化客編譯整理，水平有限，僅供臨床、科研人士學(xué)習(xí)分享交流，內(nèi)容以英文原版為準。點擊閱讀原文，查看更多消化資訊。返回搜狐，查看更多
