[0001]
本發(fā)明屬于覆盆子酮生產(chǎn)技術領域，具體涉及一種覆盆子酮的工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)方法。

背景技術：

[0002]
覆盆子酮又名懸鉤子酮，化學名4-對羥基苯基-2-丁酮。覆盆子酮是覆盆子的主要香氣成分，是國內(nèi)外大量使用的優(yōu)雅果香的香料，廣泛應用于化妝品和食品中，除此之外還可應用于合成醫(yī)藥等。
[0003]
現(xiàn)有技術中，關于覆盆子酮的合成方法的報道具體如下：
[0004]
(1)1996年，claudio fuganti等分別以baker
′
s yeast(tetrahedron，1996，52.4041-4052) 和beauveria bassiana(tetrahedron：asymmetry，1996，7，3129-3134)對4-羥基亞芐基丙酮 (如圖1所示)中的烯鍵進行還原制備覆盆子酮。并且于1998年發(fā)表文章(journal ofmolecular catalysis b：enzymatic 1998，4，289-293)再次對能夠催化還原烯鍵的問生物進行篩選，并對還原產(chǎn)物進行詳盡的考察，發(fā)現(xiàn)某些微生物能選擇性地還原烯鍵，而大多數(shù)微生物則同時還原烯鍵和羰基生成杜鵑醇。
[0005]
(2)1998年，whitehead，i.m.等(food technol1998，52，40-46)使用從發(fā)酵或植物提取來源的對羥基苯甲醛和發(fā)酵來源的丙酮通過醛縮酶催化縮合，而后經(jīng)β-消去反應得到 4-羥基亞芐基丙酮，最后通過微生物催化烯鍵還原得到覆盆子酮。
[0006]
(3)2007年，g.feron等(letters in applied microbiology 2007，45，29-35)等利用基因工程宿主菌大腸桿菌表達源于細菌的醛縮酶(dera)實現(xiàn)了對羥基苯甲醛和丙酮的縮合，并通過過程優(yōu)化，最終覆盆子酮合成關鍵中間體4-羥基亞芐基丙酮的產(chǎn)量達到160 mg/l。
[0007]
綜上，以上各方法均停留在實驗室水平，還無法實現(xiàn)覆盆子酮的工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)。

技術實現(xiàn)要素：

[0008]
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術缺陷，提供一種覆盆子酮的工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)方法。
[0009]
本發(fā)明的技術方案如下：
[0010]
一種覆盆子酮的工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)方法，包括如下步驟：
[0011]
(1)以天然對香豆酸為原料，在放線菌actinomycetes sp.omk-74代謝下生成對羥基苯甲醛；
[0012]
(2)以步驟(1)所得的對羥基苯甲醛與丙酮為原料，在芽胞桿菌bacillus sp.omk-75 代謝下生成4-羥基芐叉丙酮；
[0013]
(3)以步驟(2)所得的4-羥基芐叉丙酮為原料，在酵母菌saccharomyces sp.omk-76 代謝下還原生成所述覆盆子酮；
[0014]
放線菌actinomycetes sp.omk-74于2020年10月16日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏
30℃培養(yǎng)至克隆子飽滿；
[0028]
b、從上述克隆子中挑取單克隆子接種于第二種子培養(yǎng)基中，于29-30℃、180-220rpm 搖床培養(yǎng)或380-420rpm通風攪拌培養(yǎng)20-25h，獲得第二種子培養(yǎng)液；
[0029]
c、將上述第二種子培養(yǎng)液以8-12％的接種量接種于第二發(fā)酵培養(yǎng)基中，于34-35℃、 ph＝6.5-7.0的條件下發(fā)酵培養(yǎng)8-12h至分光光度計測定od
600
不再增加時，一次性添加對羥基苯甲醛和丙酮分別至終濃度為38-42g/l和100-150g/l，再繼續(xù)培養(yǎng)至底物反應完全或不再繼續(xù)反應時，然后經(jīng)純化，獲得所述對羥基芐叉丙酮。
[0030]
進一步優(yōu)選的，所述第二種子培養(yǎng)基的配方如下表所示：
[0031][0032]
其中溶劑為水。
[0033]
進一步優(yōu)選的，所述第二發(fā)酵培養(yǎng)基的配方如下表所示：
[0034][0035][0036]
其中溶劑為水。
[0037]
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述步驟(3)包括：
[0038]
a、取甘油冷藏的酵母菌saccharomyces sp.omk-76進行平板劃線，所得平板置于 27-28℃培養(yǎng)至克隆子飽滿；
[0039]
b、從上述克隆子中挑取單克隆子接種于第三種子培養(yǎng)基中，于29-30℃、180-220rpm 搖床培養(yǎng)或380-420rpm通風攪拌培養(yǎng)20-25h，獲得第三種子培養(yǎng)液；
[0040]
c、將上述第三種子培養(yǎng)液以8-12％的接種量接種于第三發(fā)酵培養(yǎng)基中，于29-30
℃、自然ph的條件下發(fā)酵培養(yǎng)8-12h至分光光度計測定od
600
不再增加時，一次性添加對羥基芐叉丙酮至終濃度為48-52g/l，再繼續(xù)培養(yǎng)至底物反應完全或不再繼續(xù)反應時，然后經(jīng)純化，獲得所述覆盆子酮。
[0041]
進一步優(yōu)選的，所述第三種子培養(yǎng)基的配方如下表所示：
[0042][0043]
其中溶劑為水。
[0044]
進一步優(yōu)選的，所述第三發(fā)酵培養(yǎng)基的配方如下表所示：
[0045][0046][0047]
其中溶劑為水。
[0048]
本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明通過三步發(fā)酵，實現(xiàn)了高效的生物法合成覆盆子酮的生產(chǎn)工藝。第一步：以天然對香豆酸為原料，在微生物(放線菌actinomycetes sp.omk-74) 代謝下生成天然對羥基苯甲醛；第二步：對羥基苯甲醛和丙酮在微生物(芽胞桿菌bacillussp.omk-75)代謝下生成4-羥基芐叉丙酮；最后4-羥基芐叉丙酮經(jīng)過酵母菌(酵母菌 saccharomyces sp.omk-76)特異且高效還原生成覆盆子酮。
附圖說明
[0049]
圖1為本發(fā)明實施例1的技術路線圖。
具體實施方式
[0050]
以下通過具體實施方式結(jié)合附圖對本發(fā)明的技術方案進行進一步的說明和描述。
[0051]
實施例1
[0052]
本實施例中所涉及的微生物從海洋土壤眾多微生物中分離篩選出而得到，其中：放線菌actinomycetes sp.omk-74于2020年10月16日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為：cctcc no：m 2020584；芽胞桿菌bacillus sp.omk-75于2020年10月16 日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為：cctcc no：m 2020585；酵母菌 saccharomyces sp.omk-76于2020年10月16日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為：cctcc no：m 2020586。
[0053]
如圖1所示，一種覆盆子酮的工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)方法，包括如下步驟：
[0054]
(1)以天然對香豆酸為原料，在放線菌actinomycetes sp.omk-74代謝下生成對羥基苯甲醛，具體包括：
[0055]
a、取一管-80℃冰箱甘油冷藏的放線菌actinomycetes sp.omk-74于新鮮、無菌平板上平板劃線，所得平板置于培養(yǎng)箱26℃培養(yǎng)72h至克隆子飽滿；
[0056]
b、從上述克隆子中挑取單克隆子接種于裝有1.8l第一種子培養(yǎng)基的3l生物反應器中，于37℃、300rpm通風攪拌培養(yǎng)24h，獲得第一種子培養(yǎng)液，鏡檢無雜菌后，準備接種于發(fā)酵罐；
[0057]
c、將上述第一種子培養(yǎng)液以10％的接種量接種于裝有10.2l第一發(fā)酵培養(yǎng)基的20l 生物反應器(經(jīng)121℃滅菌30min)中，于37℃、ph＝7.0-7.5(使用30％氫氧化鈉溶液自動控制)、400rpm攪拌轉(zhuǎn)速、通氣比為1∶0.2的條件下發(fā)酵培養(yǎng)12h至分光光度計測定 od
600
不再增加時，一次性添加對香豆酸至終濃度為50g/l(共600g)，再繼續(xù)培養(yǎng)48h 至底物反應完全或不再繼續(xù)反應時(每4h測樣)，發(fā)酵結(jié)束用hplc法測定發(fā)酵液中對羥基苯甲醛的濃度為35g/l，然后經(jīng)純化，獲得所述對羥基苯甲醛；
[0058]
第一種子培養(yǎng)基的配方如下表所示：
[0059][0060]
其中溶劑為水；
[0061]
第一發(fā)酵培養(yǎng)基的配方如下表所示：
[0062][0063]
其中溶劑為水；
[0064]
(2)以步驟(1)所得的對羥基苯甲醛與丙酮為原料，在芽胞桿菌bacillus sp.omk-75 代謝下生成4-羥基芐叉丙酮，具體包括：
[0065]
a、取一管-80℃冰箱甘油冷藏的芽胞桿菌bacillus sp.omk-75于新鮮、無菌平板上平板劃線，所得平板置于30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h至克隆子飽滿；
[0066]
b、從上述克隆子中挑取單克隆子接種于裝有1.8l第一種子培養(yǎng)基的3l生物反應器中，于30℃、400rpm通風攪拌培養(yǎng)24h，獲得第二種子培養(yǎng)液，鏡檢無雜菌后，準備接種于發(fā)酵罐；
[0067]
c、將上述第二種子培養(yǎng)液以10％的接種量接種于裝有10.2l第二發(fā)酵培養(yǎng)基的生物反應器(經(jīng)121℃滅菌30min)中，于35℃、ph＝6.5-7.0(使用30％氫氧化鈉溶液自動控制)、500rpm攪拌轉(zhuǎn)速、通氣比為1∶0.3的條件下發(fā)酵培養(yǎng)10h至分光光度計測定od
600
不再增加時，一次性添加對羥基苯甲醛和丙酮分別至終濃度為40g/l(共306g)和100g/l，再繼續(xù)培養(yǎng)72h至底物反應完全或不再繼續(xù)反應時(每4h測樣)，發(fā)酵結(jié)束用hplc法測定發(fā)酵液中對羥基芐叉丙酮的濃度為50g/l，然后經(jīng)純化，獲得所述對羥基芐叉丙酮；
[0068]
第二種子培養(yǎng)基的配方如下表所示：
[0069][0070]
其中溶劑為水；
[0071]
第二發(fā)酵培養(yǎng)基的配方如下表所示：
[0072][0073]
其中溶劑為水；
[0074]
(3)以步驟(2)所得的4-羥基芐叉丙酮為原料，在酵母菌saccharomyces sp.omk-76 代謝下還原生成所述覆盆子酮，具體包括：
[0075]
a、取一管-80℃冰箱甘油冷藏的酵母菌saccharomyces sp.omk-76于新鮮、無菌平板上平板劃線，所得平板置于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h至克隆子飽滿；
[0076]
b、從上述克隆子中挑取單克隆子接種于裝有1.8l第一種子培養(yǎng)基的3l生物反應器中，于30℃、400rpm通風攪拌培養(yǎng)24h，獲得第三種子培養(yǎng)液，鏡檢無雜菌后，準備接種于發(fā)酵罐；
[0077]
c、將上述第三種子培養(yǎng)液以10％的接種量接種于裝有10.2l第二發(fā)酵培養(yǎng)基的生物反應器(經(jīng)121℃滅菌30min)中，于30℃、自然ph、500rpm攪拌轉(zhuǎn)速、通氣比為1∶0.35 的條件下發(fā)酵培養(yǎng)10h至分光光度計測定od
600
不再增加時，一次性添加對羥基芐叉丙酮至終濃度為40g/l(共480g)和葡萄糖至終濃度100g/l，再繼續(xù)培養(yǎng)72h至底物反應完全或不再繼續(xù)反應時(每4h測樣)，發(fā)酵結(jié)束用hplc法測定發(fā)酵液中覆盆子酮的濃度為39.5g/l，然后經(jīng)純化，獲得所述覆盆子酮；
[0078]
第三種子培養(yǎng)基的配方如下表所示：
[0079][0080]
其中溶劑為水；
[0081]
第三發(fā)酵培養(yǎng)基的配方如下表所示：
[0082][0083][0084]
其中溶劑為水。
[0085]
以上所述，僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，故不能依此限定本發(fā)明實施的范圍，即依本發(fā)明專利范圍及說明書內(nèi)容所作的等效變化與修飾，皆應仍屬本發(fā)明涵蓋的范圍內(nèi)。

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