[0001]
本發(fā)明屬于覆盆子酮生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種覆盆子酮的工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)方法。

背景技術(shù)：

[0002]
覆盆子酮又名懸鉤子酮，化學(xué)名4-對(duì)羥基苯基-2-丁酮。覆盆子酮是覆盆子的主要香氣成分，是國(guó)內(nèi)外大量使用的優(yōu)雅果香的香料，廣泛應(yīng)用于化妝品和食品中，除此之外還可應(yīng)用于合成醫(yī)藥等。
[0003]
現(xiàn)有技術(shù)中，關(guān)于覆盆子酮的合成方法的報(bào)道具體如下：
[0004]
(1)1996年，claudio fuganti等分別以baker
′
s yeast(tetrahedron，1996，52.4041-4052) 和beauveria bassiana(tetrahedron：asymmetry，1996，7，3129-3134)對(duì)4-羥基亞芐基丙酮 (如圖1所示)中的烯鍵進(jìn)行還原制備覆盆子酮。并且于1998年發(fā)表文章(journal ofmolecular catalysis b：enzymatic 1998，4，289-293)再次對(duì)能夠催化還原烯鍵的問(wèn)生物進(jìn)行篩選，并對(duì)還原產(chǎn)物進(jìn)行詳盡的考察，發(fā)現(xiàn)某些微生物能選擇性地還原烯鍵，而大多數(shù)微生物則同時(shí)還原烯鍵和羰基生成杜鵑醇。
[0005]
(2)1998年，whitehead，i.m.等(food technol1998，52，40-46)使用從發(fā)酵或植物提取來(lái)源的對(duì)羥基苯甲醛和發(fā)酵來(lái)源的丙酮通過(guò)醛縮酶催化縮合，而后經(jīng)β-消去反應(yīng)得到 4-羥基亞芐基丙酮，最后通過(guò)微生物催化烯鍵還原得到覆盆子酮。
[0006]
(3)2007年，g.feron等(letters in applied microbiology 2007，45，29-35)等利用基因工程宿主菌大腸桿菌表達(dá)源于細(xì)菌的醛縮酶(dera)實(shí)現(xiàn)了對(duì)羥基苯甲醛和丙酮的縮合，并通過(guò)過(guò)程優(yōu)化，最終覆盆子酮合成關(guān)鍵中間體4-羥基亞芐基丙酮的產(chǎn)量達(dá)到160 mg/l。
[0007]
綜上，以上各方法均停留在實(shí)驗(yàn)室水平，還無(wú)法實(shí)現(xiàn)覆盆子酮的工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

[0008]
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)缺陷，提供一種覆盆子酮的工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)方法。
[0009]
本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0010]
一種覆盆子酮的工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)方法，包括如下步驟：
[0011]
(1)以天然對(duì)香豆酸為原料，在放線菌actinomycetes sp.omk-74代謝下生成對(duì)羥基苯甲醛；
[0012]
(2)以步驟(1)所得的對(duì)羥基苯甲醛與丙酮為原料，在芽胞桿菌bacillus sp.omk-75 代謝下生成4-羥基芐叉丙酮；
[0013]
(3)以步驟(2)所得的4-羥基芐叉丙酮為原料，在酵母菌saccharomyces sp.omk-76 代謝下還原生成所述覆盆子酮；
[0014]
放線菌actinomycetes sp.omk-74于2020年10月16日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏
30℃培養(yǎng)至克隆子飽滿；
[0028]
b、從上述克隆子中挑取單克隆子接種于第二種子培養(yǎng)基中，于29-30℃、180-220rpm 搖床培養(yǎng)或380-420rpm通風(fēng)攪拌培養(yǎng)20-25h，獲得第二種子培養(yǎng)液；
[0029]
c、將上述第二種子培養(yǎng)液以8-12％的接種量接種于第二發(fā)酵培養(yǎng)基中，于34-35℃、 ph＝6.5-7.0的條件下發(fā)酵培養(yǎng)8-12h至分光光度計(jì)測(cè)定od
600
不再增加時(shí)，一次性添加對(duì)羥基苯甲醛和丙酮分別至終濃度為38-42g/l和100-150g/l，再繼續(xù)培養(yǎng)至底物反應(yīng)完全或不再繼續(xù)反應(yīng)時(shí)，然后經(jīng)純化，獲得所述對(duì)羥基芐叉丙酮。
[0030]
進(jìn)一步優(yōu)選的，所述第二種子培養(yǎng)基的配方如下表所示：
[0031][0032]
其中溶劑為水。
[0033]
進(jìn)一步優(yōu)選的，所述第二發(fā)酵培養(yǎng)基的配方如下表所示：
[0034][0035][0036]
其中溶劑為水。
[0037]
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述步驟(3)包括：
[0038]
a、取甘油冷藏的酵母菌saccharomyces sp.omk-76進(jìn)行平板劃線，所得平板置于 27-28℃培養(yǎng)至克隆子飽滿；
[0039]
b、從上述克隆子中挑取單克隆子接種于第三種子培養(yǎng)基中，于29-30℃、180-220rpm 搖床培養(yǎng)或380-420rpm通風(fēng)攪拌培養(yǎng)20-25h，獲得第三種子培養(yǎng)液；
[0040]
c、將上述第三種子培養(yǎng)液以8-12％的接種量接種于第三發(fā)酵培養(yǎng)基中，于29-30
℃、自然ph的條件下發(fā)酵培養(yǎng)8-12h至分光光度計(jì)測(cè)定od
600
不再增加時(shí)，一次性添加對(duì)羥基芐叉丙酮至終濃度為48-52g/l，再繼續(xù)培養(yǎng)至底物反應(yīng)完全或不再繼續(xù)反應(yīng)時(shí)，然后經(jīng)純化，獲得所述覆盆子酮。
[0041]
進(jìn)一步優(yōu)選的，所述第三種子培養(yǎng)基的配方如下表所示：
[0042][0043]
其中溶劑為水。
[0044]
進(jìn)一步優(yōu)選的，所述第三發(fā)酵培養(yǎng)基的配方如下表所示：
[0045][0046][0047]
其中溶劑為水。
[0048]
本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明通過(guò)三步發(fā)酵，實(shí)現(xiàn)了高效的生物法合成覆盆子酮的生產(chǎn)工藝。第一步：以天然對(duì)香豆酸為原料，在微生物(放線菌actinomycetes sp.omk-74) 代謝下生成天然對(duì)羥基苯甲醛；第二步：對(duì)羥基苯甲醛和丙酮在微生物(芽胞桿菌bacillussp.omk-75)代謝下生成4-羥基芐叉丙酮；最后4-羥基芐叉丙酮經(jīng)過(guò)酵母菌(酵母菌 saccharomyces sp.omk-76)特異且高效還原生成覆盆子酮。
附圖說(shuō)明
[0049]
圖1為本發(fā)明實(shí)施例1的技術(shù)路線圖。
具體實(shí)施方式
[0050]
以下通過(guò)具體實(shí)施方式結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行進(jìn)一步的說(shuō)明和描述。
[0051]
實(shí)施例1
[0052]
本實(shí)施例中所涉及的微生物從海洋土壤眾多微生物中分離篩選出而得到，其中：放線菌actinomycetes sp.omk-74于2020年10月16日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為：cctcc no：m 2020584；芽胞桿菌bacillus sp.omk-75于2020年10月16 日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為：cctcc no：m 2020585；酵母菌 saccharomyces sp.omk-76于2020年10月16日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為：cctcc no：m 2020586。
[0053]
如圖1所示，一種覆盆子酮的工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)方法，包括如下步驟：
[0054]
(1)以天然對(duì)香豆酸為原料，在放線菌actinomycetes sp.omk-74代謝下生成對(duì)羥基苯甲醛，具體包括：
[0055]
a、取一管-80℃冰箱甘油冷藏的放線菌actinomycetes sp.omk-74于新鮮、無(wú)菌平板上平板劃線，所得平板置于培養(yǎng)箱26℃培養(yǎng)72h至克隆子飽滿；
[0056]
b、從上述克隆子中挑取單克隆子接種于裝有1.8l第一種子培養(yǎng)基的3l生物反應(yīng)器中，于37℃、300rpm通風(fēng)攪拌培養(yǎng)24h，獲得第一種子培養(yǎng)液，鏡檢無(wú)雜菌后，準(zhǔn)備接種于發(fā)酵罐；
[0057]
c、將上述第一種子培養(yǎng)液以10％的接種量接種于裝有10.2l第一發(fā)酵培養(yǎng)基的20l 生物反應(yīng)器(經(jīng)121℃滅菌30min)中，于37℃、ph＝7.0-7.5(使用30％氫氧化鈉溶液自動(dòng)控制)、400rpm攪拌轉(zhuǎn)速、通氣比為1∶0.2的條件下發(fā)酵培養(yǎng)12h至分光光度計(jì)測(cè)定 od
600
不再增加時(shí)，一次性添加對(duì)香豆酸至終濃度為50g/l(共600g)，再繼續(xù)培養(yǎng)48h 至底物反應(yīng)完全或不再繼續(xù)反應(yīng)時(shí)(每4h測(cè)樣)，發(fā)酵結(jié)束用hplc法測(cè)定發(fā)酵液中對(duì)羥基苯甲醛的濃度為35g/l，然后經(jīng)純化，獲得所述對(duì)羥基苯甲醛；
[0058]
第一種子培養(yǎng)基的配方如下表所示：
[0059][0060]
其中溶劑為水；
[0061]
第一發(fā)酵培養(yǎng)基的配方如下表所示：
[0062][0063]
其中溶劑為水；
[0064]
(2)以步驟(1)所得的對(duì)羥基苯甲醛與丙酮為原料，在芽胞桿菌bacillus sp.omk-75 代謝下生成4-羥基芐叉丙酮，具體包括：
[0065]
a、取一管-80℃冰箱甘油冷藏的芽胞桿菌bacillus sp.omk-75于新鮮、無(wú)菌平板上平板劃線，所得平板置于30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h至克隆子飽滿；
[0066]
b、從上述克隆子中挑取單克隆子接種于裝有1.8l第一種子培養(yǎng)基的3l生物反應(yīng)器中，于30℃、400rpm通風(fēng)攪拌培養(yǎng)24h，獲得第二種子培養(yǎng)液，鏡檢無(wú)雜菌后，準(zhǔn)備接種于發(fā)酵罐；
[0067]
c、將上述第二種子培養(yǎng)液以10％的接種量接種于裝有10.2l第二發(fā)酵培養(yǎng)基的生物反應(yīng)器(經(jīng)121℃滅菌30min)中，于35℃、ph＝6.5-7.0(使用30％氫氧化鈉溶液自動(dòng)控制)、500rpm攪拌轉(zhuǎn)速、通氣比為1∶0.3的條件下發(fā)酵培養(yǎng)10h至分光光度計(jì)測(cè)定od
600
不再增加時(shí)，一次性添加對(duì)羥基苯甲醛和丙酮分別至終濃度為40g/l(共306g)和100g/l，再繼續(xù)培養(yǎng)72h至底物反應(yīng)完全或不再繼續(xù)反應(yīng)時(shí)(每4h測(cè)樣)，發(fā)酵結(jié)束用hplc法測(cè)定發(fā)酵液中對(duì)羥基芐叉丙酮的濃度為50g/l，然后經(jīng)純化，獲得所述對(duì)羥基芐叉丙酮；
[0068]
第二種子培養(yǎng)基的配方如下表所示：
[0069][0070]
其中溶劑為水；
[0071]
第二發(fā)酵培養(yǎng)基的配方如下表所示：
[0072][0073]
其中溶劑為水；
[0074]
(3)以步驟(2)所得的4-羥基芐叉丙酮為原料，在酵母菌saccharomyces sp.omk-76 代謝下還原生成所述覆盆子酮，具體包括：
[0075]
a、取一管-80℃冰箱甘油冷藏的酵母菌saccharomyces sp.omk-76于新鮮、無(wú)菌平板上平板劃線，所得平板置于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h至克隆子飽滿；
[0076]
b、從上述克隆子中挑取單克隆子接種于裝有1.8l第一種子培養(yǎng)基的3l生物反應(yīng)器中，于30℃、400rpm通風(fēng)攪拌培養(yǎng)24h，獲得第三種子培養(yǎng)液，鏡檢無(wú)雜菌后，準(zhǔn)備接種于發(fā)酵罐；
[0077]
c、將上述第三種子培養(yǎng)液以10％的接種量接種于裝有10.2l第二發(fā)酵培養(yǎng)基的生物反應(yīng)器(經(jīng)121℃滅菌30min)中，于30℃、自然ph、500rpm攪拌轉(zhuǎn)速、通氣比為1∶0.35 的條件下發(fā)酵培養(yǎng)10h至分光光度計(jì)測(cè)定od
600
不再增加時(shí)，一次性添加對(duì)羥基芐叉丙酮至終濃度為40g/l(共480g)和葡萄糖至終濃度100g/l，再繼續(xù)培養(yǎng)72h至底物反應(yīng)完全或不再繼續(xù)反應(yīng)時(shí)(每4h測(cè)樣)，發(fā)酵結(jié)束用hplc法測(cè)定發(fā)酵液中覆盆子酮的濃度為39.5g/l，然后經(jīng)純化，獲得所述覆盆子酮；
[0078]
第三種子培養(yǎng)基的配方如下表所示：
[0079][0080]
其中溶劑為水；
[0081]
第三發(fā)酵培養(yǎng)基的配方如下表所示：
[0082][0083][0084]
其中溶劑為水。
[0085]
以上所述，僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，故不能依此限定本發(fā)明實(shí)施的范圍，即依本發(fā)明專利范圍及說(shuō)明書(shū)內(nèi)容所作的等效變化與修飾，皆應(yīng)仍屬本發(fā)明涵蓋的范圍內(nèi)。

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