一文讀懂液體活檢
液體活檢的目標(biāo)與方法
腫瘤的液體活檢主要包括循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)、游離腫瘤細(xì)胞(CTC)及外泌體(exosome)。眾多研究表明三者與腫瘤的早診、治療、預(yù)后等均存在相關(guān)性。目前在臨床應(yīng)用最多的當(dāng)屬ctDNA檢測。
正常人的體液內(nèi)亦存在來自于機(jī)體正常細(xì)胞的游離DNA,簡稱循環(huán)游離DNA或cfDNA;在腫瘤患者體內(nèi),循環(huán)游離DNA不僅僅來自于正常細(xì)胞,還有一部分來自于腫瘤細(xì)胞,即ctDNA,也是循環(huán)游離DNA的一部分,因此我們可以通過檢測ctDNA相關(guān)變異狀態(tài)作為來自腫瘤細(xì)胞的標(biāo)志物。目前臨床腫瘤ctDNA檢測最常見的應(yīng)用領(lǐng)域為治療方案選擇及耐藥監(jiān)測。
由于ctDNA具有片段化程度高、豐度低等特點(diǎn),其主流檢測方法包括Cobas法、Super-ARMS法、高通量二代測序(NGS)及數(shù)字PCR。
液體活檢的運(yùn)用與優(yōu)勢
液體活檢最大的優(yōu)勢在于微創(chuàng)、快捷,易于動態(tài)監(jiān)測;一定程度上全面反映腫瘤整體變異狀態(tài),不受腫瘤異質(zhì)性影響;適用人群更廣泛,對于難以取得活檢腫瘤組織或取得腫瘤組織不夠基因檢測的患者,液體活檢提供了一個了解腫瘤基因變異狀態(tài)的有效途徑。
1. 早期診斷
腫瘤的早期診斷最大難點(diǎn)是由于腫瘤負(fù)荷很低,可能影像學(xué)上沒有明確的病灶,此時血液中ctDNA的含量亦極低,普通針對ctDNA突變的檢測難以滿足早診的要求。
但DNA甲基化改變是貫穿整個惡性轉(zhuǎn)化的表觀遺傳學(xué)改變。即使在腫瘤發(fā)展的最早期,DNA甲基化模式也已經(jīng)與正常細(xì)胞存在顯著差異;其次,甲基化水平的改變是具有組織特異性的,即對甲基化進(jìn)行檢測及比對,能夠進(jìn)行器官溯源,發(fā)現(xiàn)到底是哪里可能會發(fā)生或已經(jīng)發(fā)生了腫瘤。
因此,對ctDNA的甲基化水平進(jìn)行檢測,是一種有效的腫瘤早期篩查輔助手段。比如SEPT9基因甲基化檢測試劑盒對結(jié)直腸癌診斷的敏感度及特異性可達(dá)74.8%及97.5%[1],現(xiàn)在已經(jīng)可以作為一種結(jié)腸鏡前的初篩手段。
2. 指導(dǎo)靶向治療
腫瘤的靶向治療是目前臨床最常見的ctDNA檢測應(yīng)用。根據(jù)《非小細(xì)胞肺癌血液EGFR基因突變檢測中國專家共識》,如果有腫瘤組織,推薦使用腫瘤組織進(jìn)行驅(qū)動基因檢測;若無腫瘤組織樣本或腫瘤組織樣本不足的情況下,液體活檢可作為很多患者基因檢測的首選。
無論何種檢測方式,應(yīng)注意的是若組織活檢或者液體活檢有任何一個是陽性,患者應(yīng)當(dāng)考慮使用靶向藥物;當(dāng)液體活檢先行的時候,若液體活檢為陰性,應(yīng)提示患者可能存在假陰性,必要時再取活檢,以避免錯失可能的靶向治療機(jī)會。
3. 耐藥監(jiān)測
靶向治療終歸面臨耐藥的問題,而液體活檢由于微創(chuàng)快捷的優(yōu)勢,是理想的耐藥監(jiān)測材料。對于EGFR一代或者二代TKI用藥人群,約半數(shù)以上的患者出現(xiàn)EGFR 20號外顯子T790M而耐藥,因此對于此類患者的耐藥監(jiān)測可使用敏感度高且成本低的數(shù)字PCR法對T790M單點(diǎn)進(jìn)行監(jiān)測。如果患者已經(jīng)出現(xiàn)了耐藥,亟需探索其耐藥機(jī)制以更換治療方案,此時推薦使用NGS對基因變異的整體狀態(tài)進(jìn)行檢測,以便全面尋找耐藥原因。
4. 預(yù)后評估
在預(yù)后評估方面,微小殘留病變(MRD)是目前研究的熱點(diǎn)。MRD指的是治療后傳統(tǒng)影像學(xué)和實驗室方法無法發(fā)現(xiàn),但通過分子診斷可以發(fā)現(xiàn)的腫瘤來源的分子異常。多種腫瘤的相關(guān)研究表明,ctDNA突變狀態(tài)可提示接受根治性治療的患者的預(yù)后復(fù)發(fā),并且已經(jīng)在部分臨床實驗中得到應(yīng)用。
液體活檢的樣本采集要求
血液的規(guī)范化處理是保證液體活檢結(jié)果準(zhǔn)確的基本前提。在血液樣本的送檢方面應(yīng)注意:
1.采血管的選擇
ctDNA檢測的血液需使用EDTA抗凝管或者cfDNA專用采血管。若使用EDTA抗凝管,血液離體后應(yīng)盡量保存于4℃,2小時內(nèi)需盡快進(jìn)行血漿分離;若使用cfDNA專用采血管,血液可在常溫保存3-5天。切記嚴(yán)禁使用肝素抗凝管,因為肝素在后續(xù)DNA提取過程中難以去除,并且會抑制PCR反應(yīng),導(dǎo)致后續(xù)ctDNA檢測失敗。
2.采血量及采血注意事項
一般而言,ctDNA檢測需要采集8-10ml的全血。采血后嚴(yán)禁劇烈震蕩血液,或者使用注射器針頭對血液進(jìn)行轉(zhuǎn)移,因為這樣的操作均會導(dǎo)致血液中細(xì)胞破裂,從而造成基因組DNA的污染,增加ctDNA檢測的假陰性。采血后應(yīng)輕柔將采血管顛倒8-10次進(jìn)行混勻。
3. 患者采血時間的選擇
一般建議患者空腹進(jìn)行抽血,特別是血脂較高的患者。這是由于低密度脂蛋白對熒光有屏蔽和吸收的作用,會干擾后續(xù)ctDNA的相關(guān)檢測;三酰甘油會降低ctDNA的提取率;若使用微滴式數(shù)字PCR檢測技術(shù),血液中的脂質(zhì)會影響后續(xù)微滴的生成。此外,對于正在進(jìn)行化療的患者,一般建議患者化療結(jié)束后進(jìn)行抽血。
參考資料:
[1] Jin P, Kang Q, Wang X, Yang L, Yu Y, Li N, et al. Performance of a second-generation methylated SEPT9 test in detecting colorectal neoplasm. Journal of gastroenterology and hepatology. 2015 May;30(5):830-3. PubMed PMID: 25471329.
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