具有清除自由基功能的海南青梅莖提取物的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種具有清除自由基功能的海南青梅莖提取物及其制備方法，是在海南青梅莖的干燥粉末中加入有機溶劑提??；提取液經(jīng)過濾、減壓濃縮得到總浸膏，加水混懸，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，減壓回收分別得到石油醚部分、乙酸乙酯部分，所得乙酸乙酯部分經(jīng)氯仿與甲醇混合溶劑系統(tǒng)梯度洗脫，其中體積比為100:30的氯仿與甲醇洗脫組分具有優(yōu)良的清除自由基活性，該組分包括16個白藜蘆醇低聚體類化合物。本發(fā)明制得的提取物得率高，工藝流程簡單，成本低廉，適合較大規(guī)模的制備，所得提取物具有優(yōu)良清除自由基活性，可應用于抗氧化與清除自由基功能的保健食品、藥品和食品中。
【專利說明】具有清除自由基功能的海南青梅莖提取物的制備方法
【技術(shù)領域】
[0001]本發(fā)明屬于植物活性組分提取分離【技術(shù)領域】，涉及一種植物活性組分及其有效成分的提取分離方法，具體是一種具有清除自由基功能的海南青梅莖提取物的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]青梅屬(Vatica)為龍腦香科(Dipterocarpaceae)植物中最大的亞屬，約有65種，主要分布于亞洲熱帶地區(qū)，為熱帶雨林優(yōu)勢樹種。我國有三種，海南青梅，即青梅(V.mangachapoi Blanco ssp.hainanensis),廣西青梅(V.guangxiensis X.L.)和版納青梅(V.xishuangbannaensis G.D.)。其中海南青梅的世界分布主要在越南、泰國、菲律賓、印度尼西亞等地，在我國，海南青梅僅分布在海南省，其葉在民間被長期用作殺菌消毒，治療肝炎及提取中藥龍腦香。
[0003]天然白藜蘆醇低聚體是一類由白藜蘆醇或者是其它二苯乙烯類單體經(jīng)脫氫后形成聚合度不等的特殊多酚類化合物。自1951年King等人從龍腦香科的兩種植物Hopea odorata和Balanocarpus heimii中首次分離得到第一個白藜蘆醇的聚合體(hopeaphenol,四聚體),并于1965年成功應用χ-ray單晶衍射技術(shù)證實該結(jié)構(gòu)(CoggonP，Janes N F，King F E，et al.Hopeaphenol, an extractive of the heart wood of Hpeaodorata and Balanocarpus heimi1.J.Chem.Soc.1965，1:406 - 409)。白藜蘆醇低聚體因具有與白藜蘆醇類似的抗癌、抑癌作用(Ito Tj Akao Y，Yi H，et al Antitumor effectof resveratrol oligomers against human cancer cell lines and the molecularmeehanism of apoptosis indueed by vatieanolC.Careinogenesis2003, 24:1489 - 1497)、抗炎作用(Liu B L，Inami Y，Tanaka H，et al.Vaticanol (B, C and G)，a -viniferin, andhopeaphenol inhibit mediator release from bone marrow-derived mouse mast cellsin vitr0.Chin.J.Nat.Med.2004，2:176 - 183)、保肝作用(Oshima Y，Ueno Υ.AmpelopsinDj Ej H and cis—ampelopsin E，oligostilbenes from Ampelopsis brevipeduneulatavar.Hancei roots.Phytochemisrtry 1993, 33:179 - 182)、抗細菌和真菌(Nitta T，AraiΤ，Takamatsu H，et al.Antibacterial activity of extracts prepared from tropicaland subtropical plants on methiciIIin—resistant staphylococcus aurreu.J.Health.Sc1.2002，48: 273 - 276 ;Zgoda_pols J Rj Freyer A Jj Killmer L B，et alAntimicrobial resveratrol tetramers from the stem bark of Vatica oblongifoliassp.0blongiflolia.J.Nat.Prod.2002，65，1554 - 1559)、抗氧化和抗衰老作用、清除自由基(Tanaka Tj Ito Tj Nakaya K，et al.Vatieanol Dj a novel resveratrol hexamerisolated fr om Vatica rassak.Tetrahedron Lett.2000，41:7929 - 7932)以及氧化酶和乙酰膽堿酯酶抑制活性(Qin Y H，Zhang Jj Cui J Tj et al.0ligostilbenes fromVatica mangachapoi with xanthine oxidase and acetylcholinesterase inhibitoryactivities.RSC Advances，2011，1:135 - 141)等重要生物活性而備受關(guān)注。迄今為止，從青梅屬植物中已分離得到單體衍生物到白藜蘆醇八聚體共幾十種白藜蘆醇低聚體，其中以二、三和四聚體居多。
[0004]自由基是機體氧化反應中產(chǎn)生的有害化合物，具有強氧化性，可損害機體的組織和細胞，進而引起慢性疾病及衰老效應。隨著對自由基研究的深入，科學家們越來越清楚地認識到，清除人體多余自由基有益于某些疾病(炎癥、心血管疾病、腫瘤和氧化性疲勞等)的預防和治療，開發(fā)利用高效無毒的天然抗氧化劑-自由基清除劑，已成為當今科學發(fā)展的趨勢。
[0005]海南青梅葉部分的80%乙醇提取物已證實具有良好抗氧化活性(尹文清，宋鑫明，陳光英，等.青梅葉中多酚含量測定及抗氧化活性研究.食品安全與檢測，2009，34:283-286)，但其活性成分是什么尚未確定；而其莖的粗提取物已經(jīng)被證實具有優(yōu)良抗HIVd-W樸，陳光英，韓長日，等.藥用植物的提取物及其應用CN102724990)、抗腫瘤(袁媛，王琳，田麗美，等.MTT法篩選青梅對SPCA-1體外增殖抑制作用有效部位的研究，食品工業(yè)，2010，1:10-11)、抗炎(陳忠，楊燕，王天山，等.青梅和大葉魚骨木提取浸膏的抑菌活性.時珍國醫(yī)國藥，2009，20:445-446)等活性。但目前國內(nèi)外尚未見海南青梅莖提取物的化學活性組分的研究報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種具有清除自由基功能的海南青梅莖提取物及其制備方法，采用清除DPPH自由基的活性 追蹤分離策略，利用提取分離方法對海南青梅莖提取物乙酸乙酯萃取部位的不同極性組分進行清除DPPH自由基活性篩選，確定活性組分，經(jīng)多次柱層析，闡明活性組分中所含的化學成分。
[0007]本發(fā)明所采用的技術(shù)方案:
[0008]一種具有清除自由基功能的海南青梅莖提取物的制備方法，其步驟如下:
[0009]1、總浸膏的制備
[0010]取海南青梅的莖于室溫陰干后粉碎成粉末，然后用溶劑提取，提取的次數(shù)為3~5次；提取液過濾合并，經(jīng)減壓濃縮得總浸膏。所述溶劑為甲醇、丙酮或50~95%的乙醇。
[0011]2、不同極性部位的制備
[0012]將步驟(1)制得的總浸膏加水混懸，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，減壓回收得到相應的石油醚部分、乙酸乙酯部分。
[0013]3、硅膠柱色譜分段
[0014]A、將步驟(2)制備的乙酸乙酯部位，通過有機溶劑溶解，然后用100~200或200~300目硅膠與其混勻，硅膠與樣品的干重比I~2:1，室溫下避光自然風干后經(jīng)硅膠柱色譜分離，硅膠柱中的硅膠顆粒為200~300或300~400目，且硅膠與樣品的干重比為10 ~12:1 ;
[0015]B、采用氯仿-甲醇溶劑系統(tǒng)進行梯度洗脫，每一極性段均洗脫至無色，得到多個極性段的組分；所采用梯度為氯仿與甲醇的體積比分別為100:0、100: 5、100:30、100:40、100:60和100:100。洗脫液每500~750ml收集一瓶。
[0016]4、硅膠和凝膠柱色譜分離純化
[0017]將步驟(3)所得的氯仿與甲醇的體積比為100:30極性段的提取物(組分)，經(jīng)硅膠、凝膠柱色譜細分，共得到16個白藜蘆醇低聚體類化合物，其中3個白藜蘆醇一倍半聚體，11個白藜蘆醇二聚體，2個白藜蘆醇四聚體。
[0018]上述方法中，所述提取方法包括室溫浸泡、加熱或超聲提取。
[0019]上述方法中，海南青梅莖的干燥粉末與溶劑的體積比為1:1~1:10。
[0020]上述方法中，柱層析用填料為柱層析用硅膠或葡聚糖凝膠LH-20。
[0021 ] 本發(fā)明的提取物具有優(yōu)良清除自由基活性，可以廣泛應用于具有抗氧化與清除自由基功能的保健食品、功能食品和食品中。
[0022]本發(fā)明的優(yōu)點在于:
[0023]I)、利用簡單的提取分離方法，對海南青梅莖提取物進行極性分段分離制備及清除自由基活性篩選，找到活性組分，經(jīng)多次柱層析，闡明活性組分的化學成分。
[0024]2)、本發(fā)明 所得提取物的化學成分明確。
[0025]3)、所得提取物具有優(yōu)良清除自由基活性，可以廣泛用于具有抗氧化與清除自由基功能的保健食品、功能食品和食品中。
[0026]4)、本法明制得的提取物得率高，工藝流程簡單，成本低廉，適合較大規(guī)模的制備?！揪唧w實施方式】
[0027]下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明的【具體實施方式】作進一步詳細描述。以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0028]海南青梅莖提取物的制備方法步驟如下:
[0029]I)、取海南青梅的莖于室溫陰干后粉碎，過20-80目篩，然后加入甲醇、丙酮或50-95 %的乙醇，室溫浸泡、加熱或超聲提取，提取時間為60分鐘至7天，料液比為1:1~1:10 ；
[0030]2)、將提取液過濾、減壓回收得到總浸膏，加水混懸，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，減壓回收分別得到石油醚部分和乙酸乙酯部分；乙酸乙酯部分經(jīng)氯仿與甲醇混合溶劑體系(梯度為100:O、100:5、100:30、100:40、100:60和100:100，體積比)進行梯度洗脫，薄層色譜檢測合并相同組分，得6個組分A-F(A，100:0 ；B,100:5 ；C,100:30 ；D, 100:40 ；E,100:60 ；F,100:100)；
[0031 ] 3)、對6個組分進行性能檢測，確定C組分具有優(yōu)良清除自由基活性，將C (100:30)組分進行反復柱層析:氯仿:乙酸乙酯(1:2)硅膠柱層析分別得到化合物(I)、(2)、(3)和
(5);氯仿:乙酸乙酯(I:2)接著是氯仿:甲醇(4:1)硅膠柱層析分離得到化合物(4)、(6)和(X);氯仿:乙酸乙酯(I:3)硅膠柱層析接著是氯仿:甲醇(1:1)葡聚糖凝膠SephadexLH-20柱層析分離得到化合物(8)、(9)、(10)和(11);氯仿:乙酸乙酯:甲醇(6:1:1)硅膠柱層析和氯仿:甲醇(1:1)葡聚糖凝膠Sephadex LH-20柱層析分離得到化合物(12)、(13)、和(14);氯仿:乙酸乙酯(1:4)硅膠柱層析得到化合物(15)和(16)。
[0032]4)、綜合應用多種波譜技術(shù)(包括MS、1D/2D NMR)結(jié)合相關(guān)文獻參考，對純化得到的單體化合物進行結(jié)構(gòu)鑒定，分別為16個白藜蘆醇低聚體類化合物，具體結(jié)構(gòu)為diptoindonesin G (I)、parviflorol (2)、diptoindonesin D (3)、(+) - ε -viniferin (4) >hopeahainol C(5)、vaticahainol(6)、hopeafuran(7)、vitisinols G(8)、malibatolA(9)、Vaticahainol C(10)、ampelopsin A(Il)、balanocarpol (12)、ampelopsin F(13) >isoampelopsin (14)、vaticaff inol (15)、paucif lorol C (16)，測定結(jié)構(gòu)可靠。
[0033]下面結(jié)合實施例對發(fā)明作詳細說明。
[0034]實例一海南青梅莖有效部位的制備
[0035]海南青梅莖(IOKg),室溫陰干后粉碎,室溫下采用75%乙醇室溫浸泡3次,7天/次，合并提取液，減壓濃縮得總提取物(1.0Kg)，加水懸浮分散，分別用石油醚、乙酸乙酯萃取，得石油醚部分(50g)，乙酸乙酯部分(400g)。
[0036]乙酸乙酯部分經(jīng)過硅膠柱層析分離，氯仿:甲醇(100:O、100:5、100:30、100:40、100:60和100:100，體積比)進行梯度洗脫，其中的氯仿:甲醇(100:30)洗脫所獲得的組分經(jīng)反復硅膠柱層析、葡聚糖凝膠(Sephdex LH-20)柱層析，得到16個白藜蘆醇低聚體類化合物，分別為反復氯仿:乙酸乙酯(1:2)硅膠柱層析分別得到diptoindonesinG(I) 20.5mg> parvif1rol(2)25.2mg> diptoindonesin D (3)17.4mg 和 hopeahainolC(5)31.5mg;氯仿:乙酸乙酯(1:2)接著是氯仿:甲醇(4:1)硅膠柱層析分離得到(+) - ε -viniferin (4) 17.8mg、vaticahainol (6) 13.2mg 和 hopeafuran (7) 21.1mg ;氯仿:乙酸乙酯(1:3)硅膠柱層析接著是氯仿:甲醇(1:1)葡聚糖凝膠Sephadex LH-20柱層析分離得到 vitisinols G (8) 9.5mg、malibatol A (9) 16.8mg、vaticahainol C (10) 26.1mg和ampelopsin A(ll)210.2mg ;氯仿:乙酸乙酯:甲醇(6:1:1)硅膠柱層析和氯仿:甲醇(1:1)葡聚糖凝膠 Sephadex LH-20 柱層析分離得到 balanocarpol (12) 1.2g、ampelopsinF (13) 176.8mg和isoampelopsin (14) 25.4mg ;氯仿:乙酸乙酯(1:4)硅膠柱層析得到vaticaffinol (15) 2.1g 和 pauciflorol C (16) 36.1mg0 化學結(jié)構(gòu)如下: [0037]
【權(quán)利要求】
1.一種具有清除自由基功能的海南青梅莖提取物的制備方法，其特征在于，其步驟如下: .1)、總浸膏的制備 取海南青梅的莖于室溫陰干后粉碎成粉末，然后用溶劑提取，提取的次數(shù)為3~5次；提取液過濾合并，經(jīng)減壓濃縮得總浸膏；所述溶劑為甲醇、丙酮或50~95%的乙醇； .2)、不同極性部位的制備 將步驟⑴制得的總浸膏加水混懸，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，減壓回收得到相應的石油醚部分、乙酸乙酯部分； 3)、硅膠柱色譜分段. A、將步驟(2)制備的乙酸乙酯部位，通過有機溶劑溶解，然后用100~200或200~.300目硅膠與其混勻，硅膠與樣品的干重比I~2:1，室溫下避光自然風干后經(jīng)硅膠柱色譜分離，硅膠柱中的硅膠顆粒為200~300或300~400目，且硅膠與樣品的干重比為10~.12:1 ； B、采用氯仿-甲醇溶劑系統(tǒng)進行梯度洗脫，每一極性段均洗脫至無色，得到多個極性段的組分；所采用梯度為氯仿與甲醇的體積比分別為100:O、100: 5、100:30、100:40、.100:60 和 100:100 ； .4)、硅膠和凝膠柱色譜分離純化 將步驟(3)所得的氯仿與甲醇的體積比為100:30的極性段的提取物，經(jīng)硅膠、凝膠柱色譜細分，共得到16個白藜蘆醇低聚體類化合物，其中3個白藜蘆醇一倍半聚體，11個白藜蘆醇二聚體，2個白藜蘆醇四聚體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于:所述提取方法包括室溫浸泡、加熱或超聲提取。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于:海南青梅莖的干燥粉末與溶劑的體積比為1:1~1:10。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于:柱層析用填料為柱層析用硅膠或葡聚糖凝膠LH-20。
【文檔編號】A23L1/29GK103961383SQ201410210150
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年5月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月19日
【發(fā)明者】陳光英, 韓長日, 陳文豪, 宋小平, 惠陽 申請人:海南師范大學

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